刁丹紅, 王蔣麗, 郭文平, 李彩云, 楊歡歡, 李雁飛, 謝廣成

立克次體(Rickettsia)為原核單細(xì)胞微生物，其專(zhuān)性寄生于真核細(xì)胞內(nèi)。由該類(lèi)菌引起的立克次體病是一類(lèi)重要的人獸共患疾病[1-2]。近年來(lái)，世界范圍出現(xiàn)多種新發(fā)及再發(fā)立克次體病[3-5]。我國(guó)在新疆、黑龍江、云南等地野生動(dòng)物和/或患者樣本中檢出或分離到某些致病性立克次體[6]。

由于立克次體嚴(yán)格胞內(nèi)寄生這一特性，人們很難用傳統(tǒng)的細(xì)菌學(xué)分類(lèi)手段對(duì)該類(lèi)菌進(jìn)行區(qū)分。16SrRNA基因由于其高變區(qū)有種屬特異性，保守區(qū)在各細(xì)菌之間差異不大的特點(diǎn)，已經(jīng)成為最適合細(xì)菌屬種分類(lèi)鑒定的目的基因[7-8]。立克次體屬的檸檬酸合成酶基因(gltA)、外膜蛋白A(ompA)基因?yàn)殍b定立克次體種的常用基因[9]。立克次體的ompA基因序列具有種內(nèi)差異，為種內(nèi)菌株分型的目的基因[10]。

本研究捕獲河北省南部和東北部?jī)蓚€(gè)特定地區(qū)的野鼠作為調(diào)查對(duì)象，擴(kuò)增鼠脾臟樣本的立克次體16SrRNA、ompA、gltA基因，并對(duì)擴(kuò)得的目的基因片段測(cè)序，對(duì)測(cè)定的基因序列進(jìn)行同源性比對(duì)和系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)分析，研究當(dāng)?shù)亓⒖舜误w的遺傳特征和流行特征，為當(dāng)?shù)亓⒖舜误w病預(yù)防與控制提供重要數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器設(shè)備與試劑 PCR儀(Applied Biosystem，美國(guó))、凝膠成像儀(Bio-Rad，美國(guó))、電泳儀(北京六一儀器廠(chǎng)，北京)、組織研磨機(jī)(上海凈信實(shí)業(yè)有限公司，上海)、核酸提取儀(江蘇碩世生物科技股份有限公司，江蘇)、PCR master Mix(TIANGEN，北京)。

1.2 野鼠樣本采集 2020年4月-9月，在河北省邯鄲市及承德市選取的5個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)用粘鼠板和鼠籠法捕獲野鼠，其中邯鄲市50只，承德市50只，分別編號(hào)登記，無(wú)菌操作解剖，取脾臟樣本，-80 ℃ 凍存待檢。

1.3 脾DNA提取 每只鼠分別取約10 mg脾臟組織用研磨機(jī)進(jìn)行研磨，使用碩世生物科技有限公司的組織DNA提取試劑盒(磁珠法)提取脾臟組織全DNA，并保存于-20 ℃ 備用。

1.4 PCR擴(kuò)增 根據(jù)文獻(xiàn)[11]中的引物(表1)采用半巢氏PCR進(jìn)行立克次體16SrRNA、ompA、gltA基因的擴(kuò)增，其中16SrRNA分為兩段進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增條件為：94 ℃ 5 min后；94 ℃ 40 s、50 ℃ 40 s、72 ℃ 50 s，循環(huán)35次；最后72 ℃ 7 min。二輪擴(kuò)增的PCR程序與第一輪相同。16SrRNA前后兩半段、ompA、gltA擴(kuò)增產(chǎn)物目的片段的大小分別為950 bp、700 bp、750 bp和1 000 bp。

表1 本研究所用引物

1.5 序列分析及遺傳進(jìn)化特征分析 PCR陽(yáng)性產(chǎn)物送至北京擎科生物技術(shù)有限責(zé)任公司進(jìn)行測(cè)序，所得序列先用blast進(jìn)行比對(duì)分析，然后用Lasergene程序計(jì)算序列之間的同源性，用MEGA 6.0中的最大似然法(ML)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)，核苷酸替代模型為GTR+I+G，分析采用Bootstrap Replication的值為100。

2 結(jié) 果

2.1 PCR電泳結(jié)果 在河北省邯鄲市和承德市分別采集50只野鼠，根據(jù)形態(tài)學(xué)特征與線(xiàn)粒體cytb基因分析，邯鄲市捕捉到的老鼠為黑線(xiàn)姬鼠，承德市捕捉到的為褐家鼠。將100只鼠的脾臟組織分別提取DNA做模板，采用PCR擴(kuò)增立克次體的16SrRNA基因，然后擴(kuò)增陽(yáng)性標(biāo)本的ompA基因及gltA基因，擴(kuò)增產(chǎn)物使用1.5%瓊脂糖凝膠電泳成像。結(jié)果檢出6只野鼠樣本的3個(gè)目的基因擴(kuò)增均為陽(yáng)性(圖1)，4個(gè)目的基因擴(kuò)增片段分別約為950 bp、700 bp、750 bp和1 000 bp，與預(yù)期目的片段大小相符。承德市褐家鼠的立克次體感染率為8%(4/50)，邯鄲市黑線(xiàn)姬鼠的立克次體感染率為4%(2/50)。

M:DL2000 maker; 1-6:鼠脾臟樣本

2.2 16SrRNA基因測(cè)序結(jié)果分析 將6株立克次體的16SrRNA基因進(jìn)行同源性分析，它們之間的同源性為99.9%～100%。此外，這6條16SrRNA基因序列與GenBank中勞氏立克次體相應(yīng)基因之間的序列同源性最高，為99.9%～100%。下載GenBank中立克次體的已知16SrRNA基因序列，用MEGA 6.0中的ML方法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)(圖2)。在16SrRNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)上，本研究中檢出的6個(gè)菌株與勞氏立克次體有最密切的親緣關(guān)系，位于同一分支。提示從河北兩地野鼠中檢出立克次體均為斑點(diǎn)熱群的勞氏立克次體。本研究中獲得的16SrRNA基因序列的GenBank登記號(hào)為MZ292055～MZ292060。

圖2 基于立克次體16S rRNA基因序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

2.3ompA基因和gltA基因測(cè)序結(jié)果分析 本研究中獲得的6條立克次體的ompA基因的同源性為99.7%～100%；此外，這6條ompA基因序列與GenBank中勞氏立克次體相應(yīng)基因序列之間的同源性最高，為98.8%～100%。采用ompA基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)上，結(jié)果顯示河北6個(gè)立克次體菌株與勞氏立克次體有最密切的親緣關(guān)系，與我國(guó)其它地區(qū)檢出的勞氏立克次體位于同一分支。本研究中獲得的6條立克次體的gltA基因的同源性為100%；此外，這6條gltA基因序列與GenBank中勞氏立克次體相應(yīng)基因序列之間的同源性最高，為99.9%～100%。采用gltA基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)上，結(jié)果顯示河北立克次體與勞氏立克次體的位于同一分支，與我國(guó)其它地區(qū)發(fā)現(xiàn)的勞氏立克次體的親緣關(guān)系最近(圖3)。本研究中獲得的ompA與gltA基因序列的GenBank登記號(hào)為MZ297803～MZ297814。

圖3 基于立克次體ompA基因(左)與gltA基因(右)序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

3 討 論

本課題從河北省南部和東北部?jī)蓚€(gè)代表性地區(qū)捕捉野鼠提取鼠脾臟的DNA樣本，采用PCR方法擴(kuò)增鼠樣本的立克次體16SrRNA、ompA和gltA基因進(jìn)行立克次體的檢測(cè)與鑒定。脾臟是重要的機(jī)體免疫器官，是血液循環(huán)過(guò)程的一個(gè)過(guò)濾器官，因此血液中的病原體會(huì)經(jīng)過(guò)脾臟，它們可能被脾臟免疫活性細(xì)胞吞噬清除，某些病原體可以在脾臟細(xì)胞內(nèi)生長(zhǎng)繁殖，再次進(jìn)入血液。因此，脾臟組織是否帶菌可以作為機(jī)體是否曾發(fā)生過(guò)或正存在菌血癥的一種反映。同時(shí)，有研究結(jié)果顯示，脾臟組織檢查適合監(jiān)測(cè)依靠鼠作為貯存宿主而傳播的病原體[12]。因此，通過(guò)動(dòng)物宿主研究病原體存在狀況時(shí)，我們應(yīng)根據(jù)所研究病原體的組織親嗜性特征選擇對(duì)應(yīng)靶器官或組織。因此，本研究選取了脾臟組織標(biāo)本進(jìn)行立克次體的檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果表明邯鄲與承德市的嚙齒動(dòng)物立克次體感染陽(yáng)性率為6%，同源性與系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)分析證明野鼠攜帶的立克次體病原體為勞氏立克次體。本研究中，鼠的立克次體感染率與內(nèi)蒙古西部口岸地區(qū)嚙齒動(dòng)物攜帶立克次體的陽(yáng)性率一致(6.18%)[13]，高于云南省瀘西縣和黑龍江省遜克縣嚙齒動(dòng)物中立克次體的陽(yáng)性率[14-15]，但遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于新疆北疆地區(qū)嚙齒動(dòng)物中立克次體的陽(yáng)性率(34%)[16]。

能夠感染人的立克次氏體目成員包括無(wú)形體科與立克次體科。其中的立克次體科又包含立克次體屬和東方體屬。而立克次體屬又可分為斑疹傷寒群立克次體和斑點(diǎn)熱群立克次體。目前國(guó)際上已經(jīng)鑒定出30余種斑點(diǎn)熱群立克次體，其中已經(jīng)證明對(duì)人致病的有20多種[9]。在我國(guó)，已發(fā)現(xiàn)的立克次體也有10多種[17]。在2015-2016年，內(nèi)蒙古、河南、山東等地已報(bào)道勞氏立克次體感染的病例[18]。在此次研究中，河北檢出的6株立克次體與黑龍江、內(nèi)蒙古分離出的勞氏立克次體有最密切的親緣關(guān)系。河北省位于中國(guó)華北地區(qū)，東南部、南部銜山東和河南省，北部與內(nèi)蒙古交界。我們的研究證明河北省部分區(qū)域的野鼠攜帶立克次體，野生嚙齒動(dòng)物為立克次體貯存宿主，因此這些野鼠生活地區(qū)可為立克次體感染的自然疫源地。下一步我們將擴(kuò)大河北省區(qū)域篩查范圍，除檢查野生嚙齒動(dòng)物外，也檢測(cè)蜱作為傳播媒介攜帶立克次體種類(lèi)和感染水平，以判斷哪些立克次體病原體有傳播的可能性，為河北省立克次體病的預(yù)防和控制提供可靠數(shù)據(jù)支持。

利益沖突：無(wú)

引用本文格式：刁丹紅,王蔣麗,郭文平，等.河北省野鼠立克次體感染調(diào)查[J].中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào)，2022，38(1)：84-88.DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2021.00.168