陶麗紅, 李 康, 王顯助, 普 特, 史 晶,詹俊杰, 葉 敏*,, 王凱博

(1. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 云南生物資源保護(hù)與利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，昆明 650201；2. 云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 茶葉研究所，昆明 650201)

琥珀酸脫氫酶抑制劑 (succinate dehydrogenase inhibitors，SDHI) 類殺菌劑是繼甲氧基丙烯酸酯和三唑類殺菌劑之后的又一類新型殺菌劑，其通過(guò)抑制病原菌線粒體呼吸鏈電子傳遞系統(tǒng)復(fù)合體Ⅱ(即琥珀酸脫氫酶SDH) 而發(fā)揮作用[1]。自1969 年第一個(gè)商品化的SDHI 類殺菌劑萎銹靈 (carboxin)研發(fā)上市以來(lái)，SDHI 類殺菌劑經(jīng)歷了半個(gè)世紀(jì)的發(fā)展，防治譜已覆蓋由擔(dān)子菌、子囊菌和半知菌等植物病原真菌引起的灰霉、白粉、葉斑、菌核等病害，該類殺菌劑也成為了生產(chǎn)上使用最為廣泛的殺菌劑品種之一[2]。但前期研發(fā)的SDHI 類殺菌劑大都以原有活性基團(tuán)為骨架，或在羧酸部分引入苯環(huán)、雜環(huán)、鹵素等活性基團(tuán)，或?qū)Π凡糠诌M(jìn)行并環(huán)、聯(lián)苯、增長(zhǎng)鏈長(zhǎng)等結(jié)構(gòu)優(yōu)化改造[3]，其設(shè)計(jì)和結(jié)構(gòu)改造均以直接修飾為主，未考慮病原菌對(duì)化合物的抗性風(fēng)險(xiǎn)問(wèn)題。目前，植物病原真菌已對(duì)SDHI 類殺菌劑產(chǎn)生較為普遍的抗性[4]。如，引起草莓、黃瓜、番茄等作物灰霉病的灰葡萄孢Botrytis cinerea已對(duì)啶酰菌胺 (boscalid)、吡噻菌胺 (penthiopyrad)、氟吡菌酰胺 (fluopyram)、氟唑菌酰胺 (fluxapyroxad) 和苯并烯氟菌唑(benzovindiflupyr) 等SDHI 類殺菌劑產(chǎn)生了不同程度的抗性，其中對(duì)啶酰菌胺和吡噻菌胺的抗性頻率高達(dá)95%[5-6]。啶酰菌胺和吡噻菌胺在西瓜蔓枯病菌Didymella bryoniae的防治中還存在嚴(yán)重的交互抗性[7]。這些抗性和交互抗性的產(chǎn)生大多與靶標(biāo)基因突變有關(guān)，本課題組前期研究也發(fā)現(xiàn)，灰葡萄孢琥珀酸脫氫酶 (BcSDH) 的B-P225F 和B-H272R突變可能引起該菌對(duì)SDHI 類殺菌劑產(chǎn)生抗性，也可能引起SDHI 類殺菌劑之間產(chǎn)生交互抗性[8]。

通過(guò)藥效團(tuán)拼合，有望設(shè)計(jì)合成并篩選出具有高抑菌活性和低交互抗性風(fēng)險(xiǎn)的雜合分子。選擇合理的藥效團(tuán)并進(jìn)行拼合是設(shè)計(jì)高活性雜合分子的關(guān)鍵。楊光富課題組通過(guò)藥效團(tuán)拼合設(shè)計(jì)了吡嗪/吡唑-酰胺-二苯醚骨架，通過(guò)取代基優(yōu)化獲得的化合物對(duì)大豆灰霉病和小麥白粉病具有優(yōu)異的防治效果，對(duì)立枯絲核菌Rhizoctonia solani的抑制效果優(yōu)于商品化殺菌劑噻呋酰胺[9-10]；且該課題組的最新研究表明，通過(guò)碳-硅轉(zhuǎn)換策略設(shè)計(jì)合成的含三甲基硅取代基的化合物，對(duì)大豆銹病的防治效果優(yōu)于商品化殺菌劑苯并烯氟菌唑[11]。除通過(guò)化學(xué)合成獲得殺菌劑外，天然產(chǎn)物也是殺菌劑活性成分的重要來(lái)源，以香芹酚 (2-甲基-5-異丙基苯酚) 和百里香酚 (5-甲基-2-異丙基苯酚) 為代表的天然單萜酚類化合物具有廣譜的抑菌活性，已被廣泛應(yīng)用于農(nóng)藥和醫(yī)藥研究領(lǐng)域[12-16]。天然單萜酚類化合物廣泛存在于牛至屬 (Origanum) 和百里香屬 (Thymus) 植物揮發(fā)油中，對(duì)多種植物病原真菌具有廣泛的抑菌活性，具有作為先導(dǎo)化合物進(jìn)一步開(kāi)發(fā)應(yīng)用的潛力[17-18]。將單萜酚引入殺菌劑分子中能夠提高殺菌活性，如甲氧基丙烯酸酯類的醚菌酯和醚菌胺是將2-甲基苯酚和2,5-二甲基苯酚與藥效團(tuán)結(jié)合成醚[19]，由此推測(cè)，引入天然單萜酚也有可能提高SDHI 殺菌劑的抑菌活性。SDHI 類殺菌劑屬于芳基取代酰胺類化合物，選擇合理的SDHI藥效團(tuán)與作用方式獨(dú)特的單萜酚類化合物通過(guò)酰胺鍵拼合，有望獲得結(jié)構(gòu)新穎、活性高、交互抗性風(fēng)險(xiǎn)低，兼具內(nèi)吸性殺菌劑和天然產(chǎn)物優(yōu)點(diǎn)的雜合分子。

因此，本研究擬通過(guò)設(shè)計(jì)、合成“單萜酚 +SDHI 藥效團(tuán)”型的雜合分子，并測(cè)定其對(duì)幾種常見(jiàn)植物病原真菌的生物活性，以期篩選出具有活性高、與SDHI 類殺菌劑之間沒(méi)有交互抗性、可作為新型殺菌劑活性成分的化合物，旨在為植物病害抗性治理提供新的選擇。通過(guò)研究高活性雜合分子對(duì)植物病原菌SDH 的抑制活性及其與野生型和突變型SDH 間的結(jié)合模式，初步明確高活性雜合分子的抑菌機(jī)制，為雜合分子的進(jìn)一步結(jié)構(gòu)修飾奠定理論基礎(chǔ)。

目標(biāo)化合物6a～6o 和7a～7o 的合成路線如圖式1所示。

圖式1 目標(biāo)化合物6a～6o 和7a～7o 的合成路線Scheme 1 Synthetic routes of compounds 6a-6o and 7a-7o

1 材料與方法

1.1 儀器

AL104 型電子天平 (梅特勒-托利多儀器上海有限公司)；IKA PCR BASIC 型磁力攪拌器；N-1100型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 (上海泉杰儀器有限公司)；SWCJ 型超凈工作臺(tái) (蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)；HG303-3 型恒溫培養(yǎng)箱 (南京實(shí)驗(yàn)儀器廠制造)；YXQ-LS-50S II 型立式壓力蒸汽滅菌鍋 (上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)；Bruker AM-400 MHz 或500 MHz 核磁共振波譜儀；LTQOrbitrapXL 超高效液相-靜電場(chǎng)軌道傅里葉變換高分辨質(zhì)譜儀 (HRMS)。

1.2 試劑

香芹酚 (carvacrol) 和百里香酚 (thymol)，98%分析純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；其余所用試劑和溶劑均為市售分析純，試劑未經(jīng)進(jìn)一步純化直接使用；柱層析所用硅膠為200～300 目 (篩孔徑50～75 μm，青島海洋化工廠有限公司)。牛血清標(biāo)準(zhǔn)蛋白 (Sigma 公司)，考馬斯亮藍(lán)G-250 (Solarbio 公司)，SDH 試劑盒 (南京建成生物工程研究所)。

1.3 供試菌種

茄鏈格孢菌Alternaria solani，由中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院提供；尖孢鐮刀菌Fusarium oxysporum，由云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)環(huán)境資源研究所提供；立枯絲核菌Rhizoctonia solani，為云南農(nóng)業(yè)大學(xué)云南省植物病理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保藏菌種；灰葡萄孢Botrytis cinerea或BcS和山茶炭疽菌Colletotrichum camelliae，分別為玫瑰和茶葉田間采集菌種，經(jīng)純化、單孢分離、ITS 測(cè)序后保存于云南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；灰葡萄孢的啶酰菌胺高抗菌株 (BcR，EC50＞500 μg/mL) 為室內(nèi)誘導(dǎo)獲得的菌群，未進(jìn)行進(jìn)一步的單孢分離；灰葡萄孢B-P225F 突變株 (BcP225F，即sdhB 的脯氨酸 (Pro, P) 突變?yōu)楸奖彼?(Phe, F) ) 為室內(nèi)誘導(dǎo)的單孢分離菌株，經(jīng)測(cè)序鑒定為B-P225F 突變。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 化合物的合成 中間體及目標(biāo)化合物的合成參照文獻(xiàn)[20]進(jìn)行。

化合物1 (5-異丙基-2-甲基-4-亞硝基苯酚) 的合成：將30 mmol 的香芹酚溶解于75 mL 乙醇中，加入75 mL 鹽酸，0 ℃下分批緩慢加入30 mmol亞硝酸鈉，低溫?cái)嚢璺磻?yīng)2 h，待反應(yīng)完成后加入600 mL 蒸餾水，析出黃色蓬松狀固體，經(jīng)過(guò)濾、水洗、干燥后得化合物1，收率63%，m. p. 95～96 ℃，1H NMR 和熔點(diǎn)數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)值[21]一致。

化合物2 (4-氨基-5-異丙基-2-甲基苯酚) 的合成：參考文獻(xiàn)方法[20]制備，取2 mmol 化合物1 置于100 mL 圓底燒瓶中，加入20 mL 甲醇作溶劑，以36 mg 鈀碳 (10%) 作催化劑，用N2置換3 次，H2置換3 次，以氣球供氫氣，常壓過(guò)夜反應(yīng)后過(guò)濾，濃縮得白色粉末，即化合物2，收率77%，但該化合物不穩(wěn)定，常溫下易被氧化變紫，難以打譜確證。同法合成化合物3。

化合物5a (鄰碘苯甲酰氯) 的合成：將2.4 mmol鄰碘苯甲酸 (4a) 溶解于2 mL 氯化亞砜中，85 ℃下回流2 h，減壓除去殘余的氯化亞砜，所得酰氯產(chǎn)物直接溶解于2 mL 四氫呋喃中備用。同法合成5b～5o。

目標(biāo)化合物6a (N-(4-羥基-2-異丙基-5-甲基苯)-2-碘苯甲酰胺) 的合成：取2.4 mmol 中間體2 溶解于4 mL 四氫呋喃中，加入4 mmol 三乙胺。在0 ℃下將5a 的THF 溶液緩慢滴加到反應(yīng)體系中，滴加完成后在室溫下繼續(xù)攪拌，待反應(yīng)完成后加入20 mL 蒸餾水，二氯甲烷萃取 (20 mL × 3)，合并有機(jī)相，干燥濃縮柱層析 (V(石油醚) :V(乙酸乙酯)=5 : 1)，得到目標(biāo)化合物6a。同法合成6b～6o 和7a～7o。

1.4.2 化合物結(jié)構(gòu)鑒定 對(duì)目標(biāo)化合物6a～6o 和7a～7o 進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。測(cè)定1H NMR、13C NMR 數(shù)據(jù)時(shí)，TMS 為內(nèi)標(biāo)，CDCl3或DMSO-d6為溶劑；測(cè)定HRMS 數(shù)據(jù)使用甲醇為溶劑。

1.4.3 抑菌活性測(cè)定 采用菌絲生長(zhǎng)速率法[22]。以二甲基亞砜 (DMSO) 為溶劑配制質(zhì)量濃度分別為1 000 和5 000 μg/mL 的化合物母液。待PDA 培養(yǎng)基冷卻至45 ℃時(shí)，按母液與培養(yǎng)基體積比為1 :100 的量將化合物母液加入培養(yǎng)基中，充分混勻后傾倒至直徑9 cm 的培養(yǎng)皿中，每皿15 mL 左右，制成終濃度為10 和50 μg/mL 帶藥平板?？瞻讓?duì)照加入與處理組等量的DMSO。

將供試病原菌活化兩代后，在菌落邊緣打取直徑0.5 cm 的菌餅，分別接種到帶藥和空白對(duì)照PDA 平板上，每處理重復(fù)3 次。于26 ℃ ± 0.5 ℃下黑暗培養(yǎng)，待空白對(duì)照組菌落生長(zhǎng)至平板邊緣時(shí)，以十字交叉法測(cè)量菌落直徑，按式 (1) 計(jì)算化合物對(duì)菌絲生長(zhǎng)的抑制率。重復(fù)3 次，求取平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。

式 (1) 中：I表示抑制率；DC和DT分別表示對(duì)照和處理菌落直徑，cm；0.5 為菌餅直徑，cm。

對(duì)于初篩效果好的化合物，設(shè)制合理的濃度梯度以相同的方法進(jìn)行復(fù)篩，利用Probit 模型對(duì)濃度對(duì)數(shù)和抑菌率幾率值進(jìn)行線性回歸分析，求得EC50值，進(jìn)一步評(píng)價(jià)化合物的抑菌活性。

1.4.4 SDH 活性測(cè)定 參照劉曉漫[23]的方法進(jìn)行病原菌培養(yǎng)并加以改進(jìn)。于250 mL 錐形瓶中加入100 mL 已滅菌的PDB (PDA 不加瓊脂粉) 培養(yǎng)基；將已在PDA 培養(yǎng)基上培養(yǎng)3 d 的灰葡萄孢用直徑0.5 cm 的打孔器叢菌落邊緣打取菌餅，每個(gè)錐形瓶中加入5 個(gè)菌餅，在26 ℃±0.5 ℃的恒溫振蕩培養(yǎng)箱中以100 r/min 培養(yǎng)2 d；加入終濃度分別為10、50 和100 μg/mL 的啶酰菌胺和雜合分子7e，以等量的DMSO 作為空白對(duì)照，繼續(xù)培養(yǎng)2 d 后過(guò)濾收集菌絲，用蒸餾水沖洗3 次，濾紙吸除多余水分備用。每個(gè)處理平行重復(fù)3 次。

蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制及灰葡萄孢蛋白質(zhì)含量的測(cè)定參照文獻(xiàn)方法[23-24]進(jìn)行。取0.1 mL 灰葡萄孢菌不同處理的蛋白質(zhì)提取液，分別加入5 mL考馬斯亮藍(lán)G-250 溶液，室溫下反應(yīng)5 min 后于595 nm 處測(cè)定吸光度值，根據(jù)蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線算出灰葡萄孢菌各處理的蛋白質(zhì)含量。SDH 活性按照試劑盒陳述的方法測(cè)定。將配好的工作液于37 ℃恒溫水浴鍋中預(yù)溫5 min，取1 cm 厚度的石英比色皿，用分光光度計(jì)在600 nm 處以雙蒸水調(diào)零；在試管中先加入100 μL 酶液后迅速加入2.6 mL工作液，搖勻并計(jì)時(shí)，迅速倒入比色皿中，用分光光度計(jì)在600 nm 處分別讀取5 s 和65 s 時(shí)的吸光度值 (OD1和OD2)，定義每毫克蛋白每分鐘使反應(yīng)體系吸光度降低0.01 為一個(gè)酶活單位。按式(2) 計(jì)算SDH 比活力。

式 (2) 中：SDHSA 表示琥珀酸脫氫酶的比活力，CP表示待測(cè)蛋白濃度。

1.4.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 用Excel 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，用SPSS 22 軟件對(duì)各組數(shù)據(jù)進(jìn)行處理；抑菌活性數(shù)據(jù)結(jié)合Duncan’s multiple range test 進(jìn)行單向ANOVA 分析，評(píng)價(jià)處理間的差異顯著性和重復(fù)間的離散度；用Origin 2016 軟件進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 化合物的合成

以香芹酚或百里香酚為原料，通過(guò)亞硝基化反應(yīng)得單萜酚的對(duì)亞硝基衍生物，再通過(guò)催化還原得到單萜酚的對(duì)氨基衍生物。羧酸4a～4o 在氯化亞砜中回流得到羧酸酰氯產(chǎn)物5a～5o；5a～5o 與單萜酚的對(duì)氨基衍生物在堿性條件下酰胺化得到含單萜結(jié)構(gòu)的酰胺類雜合分子6a～6o 或7a～7o?；衔锝Y(jié)構(gòu)表征如下。

N-(4-羥基-2-異丙基-5-甲基苯)-2-碘苯甲酰胺(6a)為白色粉末狀固體，收率78%。1H NMR (400 MHz, Chloroformd),δ: 7.92 (d,J= 7.9 Hz, 1H), 7.54 (d,J= 7.6 Hz, 1H),7.48～7.38 (m, 2H), 7.15 (t,J= 7.7 Hz, 1H), 7.09 (s, 1H), 6.75(s, 1H), 4.86 (s, 1H), 3.18～3.06 (m, 1H), 2.24 (s, 3H), 1.23 (d,J= 6.8 Hz, 6H).13C NMR (126 MHz, Chloroform-d),δ:168.35, 152.90, 142.47, 141.97, 140.05, 131.35, 128.45,128.41, 128.34, 125.77, 121.87, 112.35, 92.35, 28.02, 23.39,15.42. HRMS, C17H19INO2[M + H]+，計(jì)算值 396.045 5，實(shí)測(cè)值396.046 0.

N-(4-羥基-2-異丙基-5-甲基苯)-2-(三氟甲基)苯甲酰胺(6b)為白色固體，收率83%。1H NMR (400 MHz, DMSOd6),δ: 9.75 (s, 1H), 9.23 (s, 1H), 7.86～7.76 (m, 2H), 7.74～7.62(m, 2H), 6.93 (s, 1H), 6.74 (s, 1H), 3.24～3.03 (m, 1H), 2.10 (s,3H), 1.13 (d,J= 6.9 Hz, 6H).13C NMR (126 MHz, DMSO-d6),δ: 166.62, 154.27, 142.93, 136.76, 132.52, 129.71, 129.62,128.55, 126.30, 126.26, 125.08, 122.79, 121.33, 111.27, 27.08,23.36, 15.51. HRMS: C18H19F3NO2[M + H]+，計(jì)算值 338.136 2,實(shí)測(cè)值338.136 8.

N-(4-羥基-2-異丙基-5-甲基苯)-2-甲基苯甲酰胺(6c)為白色粉末狀固體，收率89%。1H NMR (400 MHz,Chloroform-d),δ: 7.51 (d,J= 7.9 Hz, 1H), 7.41～7.31 (m, 2H),7.31～7.22 (m, 2H), 7.14 (s, 1H), 6.72 (s, 1H), 5.27 (s, 1H),3.07～2.93 (m, 1H), 2.54 (s, 3H), 2.20 (s, 3H), 1.21 (d,J=6.8 Hz, 6H).13C NMR (126 MHz, Chloroform-d),δ: 169.33,153.04, 141.75, 136.49, 131.28, 130.20, 128.70, 126.60,125.93, 122.08, 112.51, 28.14, 23.20, 19.91, 15.44. HRMS:C18H22NO2[M + H]+，計(jì)算值 284.164 5，實(shí)測(cè)值284.165 0.

N-(4-羥基-2-異丙基-5-甲基苯)苯甲酰胺(6d)為白色粉末狀固體，收率90%。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6),δ:9.66 (s, 1H), 9.20 (s, 1H), 7.96 (d,J= 7.3 Hz, 2H), 7.60～7.54(m, 1H), 7.50 (t,J= 7.3 Hz, 2H), 6.87 (s, 1H), 6.73 (s, 1H),3.08～2.94 (m, 1H), 2.09 (s, 3H), 1.10 (d,J= 6.8 Hz, 6H).13C NMR (126 MHz, DMSO-d6),δ: 166.04, 154.23, 143.32,134.72, 131.29, 130.38, 128.36, 127.48, 125.85, 121.23,111.29, 27.46, 23.26, 15.46. HRMS: C17H20NO2[M + H]+，計(jì)算值 270.148 9，實(shí)測(cè)值270.149 4.

N-(4-羥基-2-異丙基-5-甲基苯)-3-甲基噻吩-2-酰胺(6e) 為淺黃色結(jié)晶，收率80%。1H NMR (400 MHz,Chloroform-d),δ: 7.33 (d,J= 4.8 Hz, 2H), 7.24 (s, 1H), 6.95(d,J= 5.0 Hz, 1H), 6.71 (s, 1H), 5.43～5.06 (m, 1H), 3.09～2.94(m, 1H), 2.59 (s, 3H), 2.17 (s, 3H), 1.21 (d,J= 6.8 Hz, 6H).13C NMR (126 MHz, Chloroform-d),δ: 162.22, 152.81,142.02, 141.49, 132.33, 128.61, 126.75, 126.15, 121.95,112.44, 28.18, 23.13, 15.87, 15.41. HRMS: C16H20NO2S [M +H]+，計(jì)算值 290.120 9，實(shí)測(cè)值290.121 3.

N-(4-羥基-2-異丙基-5-甲基苯)噻吩-2-酰胺(6f)為淺黃色結(jié)晶，收率83%。1H NMR (500 MHz, DMSO-d6),δ: 9.66(s, 1H), 9.21 (s, 1H), 7.94～7.89 (m, 1H), 7.79～7.75 (m, 1H),7.17 (t,J= 4.2 Hz, 1H), 6.84 (s, 1H), 6.71 (s, 1H), 3.15～2.84(m, 1H), 2.06 (s, 3H), 1.07 (d,J= 6.8 Hz, 6H).13C NMR(126 MHz, DMSO-d6),δ: 160.77, 154.36, 143.44, 140.18,131.04, 130.38, 128.47, 128.00, 125.25, 121.33, 111.33, 27.48,23.26, 15.44. HRMS: C15H18NO2S [M + H]+，計(jì)算值 276.105 3,實(shí)測(cè)值276.105 8.

N-(4-羥基-2-異丙基-5-甲基苯)-2-甲基-4-(三氟甲基)噻唑-5-酰胺(6g)為淺黃色固體，收率77%。1H NMR (400 MHz, Chloroform-d),δ: 6.82 (s, 1H), 6.61 (s, 1H), 2.98～2.86(m, 1H), 2.81 (s, 3H), 2.13 (s, 3H), 1.18 (d,J= 6.9 Hz, 6H).13C NMR (126 MHz, Chloroform-d),δ: 170.38, 158.00,143.23, 139.46, 138.27, 123.35, 120.87, 112.64, 27.33, 22.97,19.56, 17.01. HRMS: C16H18F3N2O2S [M + H]+，計(jì)算值 359.103 6，實(shí)測(cè)值359.103 9.

N-(4-羥基-2-異丙基-5-甲基苯)噻唑-5-酰胺(6h)為淺黃色固體，收率81%。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6),δ:9.91 (s, 1H), 9.27 (d,J= 6.6 Hz, 2H), 8.63 (s, 1H), 6.88 (s,1H), 6.74 (s, 1H), 3.06～2.94 (m, 1H), 2.08 (s, 3H), 1.10 (d,J=6.8 Hz, 6H).13C NMR (126 MHz, DMSO-d6),δ: 159.50,158.16, 154.54, 143.86, 143.38, 135.82, 130.24, 124.79,121.47, 111.38, 27.50, 23.27, 15.43. HRMS: C14H17N2O2S [M+ H]+，計(jì)算值 277.100 5，實(shí)測(cè)值277.100 8.

N-(4-羥基-2-異丙基-5-甲基苯)-1-甲基-3-(三氟甲基)-1H-吡唑-4-酰胺(6i) 為淺黃色粉末狀固體，收率83%。1H NMR (400 MHz, Chloroform-d),δ: 8.12 (s, 1H), 6.82 (s, 1H),6.55 (s, 1H), 4.01 (s, 3H), 2.91～2.79 (m, 1H), 2.08 (s, 3H),1.23 (d,J= 6.8 Hz, 6H).13C NMR (126 MHz, Chloroform-d),δ: 159.42, 141.41, 141.37, 136.91, 131.44, 127.88, 118.73,117.91, 39.93, 27.67, 22.19, 15.78. HRMS: C16H19F3N3O2[M+ H]+，計(jì)算值 342.142 4，實(shí)測(cè)值342.142 9.

5-氯-N-(4-羥基-2-異丙基-5-甲基苯)-1,3-二甲基-1H-吡唑-4-酰胺(6j) 為淺黃色固體，收率78%。1H NMR (400 MHz, Chloroform-d),δ: 6.84 (s, 1H), 6.56 (s, 1H), 3.97 (s,3H), 2.95～2.77 (m, 1H), 2.09 (s, 3H), 1.24 (d,J= 6.8 Hz, 6H).13C NMR (126 MHz, Chloroform-d),δ: 160.91, 152.75,151.21, 141.17, 128.61, 125.87, 122.00, 112.30, 111.66, 36.36,28.04, 23.18, 15.44, 14.58. HRMS: C16H21ClN3O2[M + H]+，計(jì)算值 322.131 7，實(shí)測(cè)值322.132 4.

N-(4-羥基-2-異丙基-5-甲基苯)-1-甲基-1H-吡唑-4-酰胺(6k) 為淺黃色粉末狀固體，收率83%。1H NMR (400 MHz,Chloroform-d),δ: 7.54 (s, 1H), 7.39 (s, 1H), 6.72 (s, 1H), 3.85(s, 3H), 3.17～2.93 (m, 1H), 2.52 (s, 3H), 2.19 (s, 3H), 1.21 (d,J= 6.8 Hz, 6H).13C NMR (126 MHz, Chloroform-d),δ:161.57, 141.68, 141.62, 141.16, 133.90, 131.49, 128.03,118.93, 117.95, 114.50, 39.42, 27.65, 22.24, 15.82. HRMS:C15H20N3O2[M + H]+，計(jì)算值 274.155 0，實(shí)測(cè)值274.155 5.

2-氯-N-(4-羥基-2-異丙基-5-甲基苯)煙酰胺(6l)為黃色固體，收率84%。1H NMR (400 MHz, Chloroform-d),δ:8.52 (dd,J= 4.8, 2.0 Hz, 1H), 8.26 (dd,J= 7.7, 2.0 Hz, 1H),7.91 (s, 1H), 7.42 (dd,J= 7.7, 4.7 Hz, 1H), 6.76 (s, 1H),3.16～3.04 (m, 1H), 2.22 (s, 3H), 1.23 (d,J= 6.8 Hz, 6H).13C NMR (126 MHz, Chloroform-d),δ: 163.67, 153.20, 151.25,146.93, 142.09, 140.43, 131.34, 128.56, 125.50, 125.50,123.03, 122.08, 112.42, 28.15, 23.29, 15.43. HRMS:C16H18ClN2O2[M + H]+，計(jì)算值 305.105 1，實(shí)測(cè)值305.105 7.

N-(4-羥基-2-異丙基-5-甲基苯)煙酰胺(6m)為黃色粉末狀固體，收率79%。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6),δ:9.87 (s, 1H), 9.25 (s, 1H), 9.11 (s, 1H), 8.75 (d,J= 4.6 Hz,1H), 8.29 (d,J= 7.9 Hz, 1H), 7.60～7.51 (m, 1H), 6.90 (s, 1H),6.75 (s, 1H), 3.09～2.97 (m, 1H), 2.09 (s, 3H), 1.11 (d,J= 6.8 Hz,6H).13C NMR (126 MHz, DMSO-d6),δ: 164.62, 154.40,151.97, 148.56, 143.27, 135.26, 130.25, 130.22, 125.33,123.57, 121.36, 111.35, 27.47, 23.27, 15.45. HRMS:C16H19N2O2[M + H]+，計(jì)算值 271.144 1，實(shí)測(cè)值271.144 4.

N-(4-羥基-2-異丙基-5-甲基苯)-2-甲基呋喃-3-酰胺(6n)為黃色粉末狀固體，收率86%。1H NMR (500 MHz,DMSO-d6),δ: 9.16～9.11 (m, 2H), 7.54 (d,J= 2.0 Hz, 1H),6.99 (d,J= 2.1 Hz, 1H), 6.81 (s, 1H), 6.69 (s, 1H), 3.02～2.93(m, 1H), 2.50 (s, 3H), 2.06 (s, 3H), 1.07 (d,J= 6.9 Hz, 6H).13C NMR (126 MHz, DMSO-d6),δ: 162.48, 156.14, 154.15,143.36, 140.66, 130.50, 125.51, 121.15, 115.86, 111.23,109.44, 27.41, 23.25, 15.43, 13.25. HRMS: C16H20NO3[M +H]+，計(jì)算值 274.143 8，實(shí)測(cè)值274.144 4.

N-(4-羥基-2-異丙基-5-甲基苯)呋喃-3-酰胺(6o)為淺黃色粉末狀固體，收率73%。1H NMR (400 MHz, DMSOd6),δ: 9.38 (s, 1H), 9.22 (s, 1H), 8.29 (s, 1H), 7.76 (s, 1H),6.96 (s, 1H), 6.84 (s, 1H), 6.72 (s, 1H), 3.05～2.93 (m, 1H),2.07 (s, 3H), 1.08 (d,J= 6.8 Hz, 6H).13C NMR (126 MHz,DMSO-d6),δ: 161.26, 154.26, 145.43, 144.07, 143.39, 130.35,125.24, 122.88, 121.27, 111.30, 109.23, 27.42, 23.27, 15.44.HRMS: C15H18NO3[M + H]+，計(jì)算值 260.128 1，實(shí)測(cè)值260.128 2.

N-(4-羥基-5-異丙基-2-甲基苯)-2-碘苯甲酰胺(7a)為淺黃色粉末狀固體，收率80%。1H NMR (500 MHz, DMSOd6),δ: 9.58 (s, 1H), 9.17 (s, 1H), 7.90 (d,J= 7.8 Hz, 1H),7.50～7.46 (m, 2H), 7.19 (t,J= 8.5 Hz, 1H), 7.07 (s, 1H), 6.63(s, 1H), 3.19～3.09 (m, 1H), 2.17 (s, 3H), 1.14 (d,J= 6.9 Hz,6H).13C NMR (126 MHz, DMSO-d6),δ: 167.79, 152.50,143.38, 139.09, 131.69, 131.66, 130.74, 128.18, 128.03,127.07, 124.23, 116.31, 93.58, 26.31, 22.56, 17.92. HRMS:C17H19INO2[M + H]+，計(jì)算值 396.045 5，實(shí)測(cè)值396.046 1.

N-(4-羥基-5-異丙基-2-甲基苯)-2-(三氟甲基)苯甲酰胺(7b) 為淺黃色結(jié)晶，收率79%。1H NMR (500 MHz,DMSO-d6),δ: 10.06 (s, 1H), 7.84 (d,J= 7.9 Hz, 1H),7.81～7.74 (m, 2H), 7.70 (t,J= 7.2 Hz, 1H), 7.43 (s, 1H), 7.09(s, 1H), 3.18～3.09 (m, 1H), 2.21 (s, 3H), 1.13 (dd,J= 6.8, 3.3 Hz, 6H).13C NMR (126 MHz, DMSO-d6),δ: 165.97, 143.18,138.75, 136.17, 134.46, 132.56, 132.33, 130.01, 128.80,124.56, 123.86, 26.30, 23.10, 22.78, 17.25. HRMS:C18H19F3NO2[M + H]+，計(jì)算值 338.136 2，實(shí)測(cè)值338.136 8.

N-(4-羥基-5-異丙基-2-甲基苯)-2-甲基苯甲酰胺(7c)為白色固體，收率86%。1H NMR (500 MHz, DMSO-d6),δ:9.46 (s, 1H), 9.15 (s, 1H), 7.48 (d,J= 7.6 Hz, 1H), 7.34 (t,J=7.4 Hz, 1H), 7.29～7.22 (m, 2H), 6.99 (s, 1H), 6.64 (s, 1H),3.19～3.10 (m, 1H), 2.41 (s, 3H), 2.12 (s, 3H), 1.14 (d,J=6.9 Hz, 6H).13C NMR (126 MHz, DMSO-d6),δ: 167.98,152.43, 137.43, 135.19, 131.77, 131.69, 130.45, 129.30,127.50, 127.24, 125.55, 124.44, 116.33, 26.28, 22.55, 19.52,17.79. HRMS: C18H22NO2[M + H]+，計(jì)算值 284.164 5，實(shí)測(cè)值284.164 6.

N-(4-羥基-5-異丙基-2-甲基苯)苯甲酰胺(7d)為白色粉末狀固體，收率79%。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6),δ:9.70 (s, 1H), 9.18 (s, 1H), 8.00～7.93 (m, 2H), 7.57 (t,J=7.2 Hz, 1H), 7.50 (t,J= 7.4 Hz, 2H), 6.97 (s, 1H), 6.67 (s, 1H),3.23～3.11 (m, 1H), 2.08 (s, 3H), 1.15 (d,J= 6.9 Hz, 6H).13C NMR (126 MHz, DMSO-d6),δ: 165.24, 152.51, 134.68,132.22, 131.75, 131.30, 128.35, 127.62, 127.50, 124.72,116.31, 26.13, 22.57, 17.62. HRMS: C17H20NO2[M + H]+，計(jì)算值270.148 9，實(shí)測(cè)值270.149 5.

N-(4-羥基-5-異丙基-2-甲基苯)-3-甲基噻吩-2-酰胺(7e) 為淺黃色結(jié)晶，收率60%。1H NMR (400 MHz,Chloroform-d),δ: 7.37～7.28 (m, 3H), 6.95 (d,J= 5.0 Hz, 1H),6.52 (s, 1H), 5.97 (s, 1H), 3.20～3.08 (m, 1H), 2.60 (s, 3H),1.21 (d,J= 6.9 Hz, 6H).13C NMR (126 MHz, Chloroform-d),δ: 151.63, 141.80, 133.05, 132.29, 130.59, 127.49, 127.06,123.29, 117.46, 26.80, 22.55, 17.62, 15.98. HRMS:C16H20NO2S [M + H]+，計(jì)算值 290.120 9，實(shí)測(cè)值290.121 5.

N-(4-羥基-5-異丙基-2-甲基苯)噻吩-2-酰胺(7f)為淺黃色固體，收率96%。1H NMR (500 MHz, DMSO-d6),δ: 9.72(s, 1H), 9.19 (s, 1H), 7.91 (d,J= 3.7 Hz, 1H), 7.78 (d,J= 5.0 Hz,1H), 7.18 (t,J= 4.4 Hz, 1H), 6.92 (s, 1H), 6.64 (s, 1H),3.19～3.10 (m, 1H), 2.05 (s, 3H), 1.13 (d,J= 6.9 Hz, 6H).13C NMR (126 MHz, DMSO-d6),δ: 159.99, 152.65, 140.18,132.37, 131.84, 131.07, 128.48, 128.00, 127.03, 124.77,116.34, 26.09, 22.55, 17.62. HRMS: C15H18NO2S [M + H]+，計(jì)算值 276.105 3，實(shí)測(cè)值276.105 9.

N-(4-羥基-5-異丙基-2-甲基苯)-2-甲基-4-(三氟甲基)噻唑-5-酰胺(7g) 為黃色固體，收率72%。1H NMR (400 MHz, Chloroform-d),δ: 6.86 (s, 1H), 6.55 (s, 1H), 2.91～2.83(m, 1H), 2.80 (s, 3H), 2.10 (s, 3H), 1.24 (d,J= 6.8 Hz, 6H).13C NMR (126 MHz, Chloroform-d),δ: 170.36, 157.56,141.73, 141.39, 131.49, 127.62, 118.43, 117.86, 27.68, 22.16,19.55, 15.79. HRMS: C16H18F3N2O2S [M + H]+，計(jì)算值 359.103 6，實(shí)測(cè)值359.104 2.

N-(4-羥基-5-異丙基-2-甲基苯)噻唑-5-酰胺(7h)為淺黃色固體，收率77%。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6),δ:9.97 (s, 1H), 9.27 (s, 2H), 8.62 (s, 1H), 6.95 (s, 1H), 6.67 (s,1H), 3.22～3.10 (m, 1H), 2.08 (s, 3H), 1.14 (d,J= 6.9 Hz,6H).13C NMR (126 MHz, DMSO-d6),δ: 158.71, 158.15,152.84, 143.90, 135.82, 132.33, 131.96, 126.61, 124.66,116.38, 26.08, 22.53, 17.58. HRMS: C14H17N2O2S[M + H]+，計(jì)算值 277.100 5，實(shí)測(cè)值277.101 0.

N-(4-羥基-5-異丙基-2-甲基苯)-1-甲基-3-(三氟甲基)-1H-吡唑-4-酰胺(7i) 為黃色粉末狀固體，收率91%。1H NMR (500 MHz, DMSO-d6),δ: 9.45 (s, 1H), 9.17 (s, 1H), 8.43(s, 1H), 6.91 (s, 1H), 6.62 (s, 1H), 3.95 (s, 3H), 3.18～3.09 (m,1H), 2.03 (s, 3H), 1.12 (d,J= 6.9 Hz, 6H).13C NMR (126 MHz, DMSO-d6),δ: 158.74, 152.50, 134.02, 131.98, 131.76,127.03, 124.30, 116.65, 116.35, 26.15, 22.54, 17.55. HRMS:C16H19F3N3O2[M + H]+，計(jì)算值 342.142 4，實(shí)測(cè)值342.142 5.

5-氯-N-(4-羥基-5-異丙基-2-甲基苯)-1,3-二甲基-1H-吡唑-4-酰胺(7j)為淺黃色固體，收率80%。1H NMR (500 MHz, DMSO-d6),δ: 9.13 (s, 1H), 8.99 (s, 1H), 7.06 (s, 1H),6.62 (s, 1H), 3.75 (s, 3H), 3.20～3.04 (m, 1H), 2.30 (s, 3H),2.08 (s, 3H), 1.13 (d,J= 6.8 Hz, 6H).13C NMR (126 MHz,DMSO-d6),δ: 160.23, 152.19, 147.12, 131.65, 131.11, 127.49,126.39, 123.68, 116.37, 113.54, 35.97, 26.24, 22.54, 17.83,13.43. HRMS: C16H21ClN3O2[M + H]+，計(jì)算值 322.131 7，實(shí)測(cè)值322.132 3.

N-(4-羥基-5-異丙基-2-甲基苯)-1-甲基-1H-吡唑-4-酰胺(7k)為淺黃色粉末狀固體，收率84%。1H NMR (400 MHz,Chloroform-d),δ: 8.04 (s, 1H), 8.01 (s, 1H), 6.78 (s, 1H), 6.61(s, 1H), 3.98 (s, 3H), 3.01～2.89 (m, 1H), 2.13 (s, 3H), 1.17 (d,J= 6.9 Hz, 6H).13C NMR (126 MHz, Chloroform-d),δ:161.98, 142.63, 141.66, 139.74, 138.62, 133.90, 123.96,120.84, 114.57, 112.80, 39.43, 27.37, 23.02, 17.04. HRMS:C15H20N3O2[M + H]+，計(jì)算值 274.155 0，實(shí)測(cè)值274.155 5.

2-氯-N-(4-羥基-5-異丙基-2-甲基苯)煙酰胺(7l)為黃色固體，收率87%。1H NMR (500 MHz, DMSO-d6),δ: 9.82 (s,1H), 9.21 (s, 1H), 8.49 (d,J= 4.8 Hz, 1H), 8.06 (d,J= 7.5 Hz,1H), 7.52 (d,J= 7.5 Hz, 1H), 7.06 (s, 1H), 6.64 (s, 1H),3.23～3.10 (m, 1H), 2.15 (s, 3H), 1.14 (d,J= 6.7 Hz, 6H).13C NMR (126 MHz, DMSO-d6),δ: 163.85, 152.63, 150.22,146.53, 138.25, 133.55, 131.82, 131.51, 126.68, 123.93,123.12, 116.42, 26.26, 22.53, 17.66. HRMS: C16H18ClN2O2[M + H]+，計(jì)算值 305.105 1，實(shí)測(cè)值305.105 5.

N-(4-羥基-5-異丙基-2-甲基苯)煙酰胺(7m)為淺黃色粉末狀固體，收率69%。1H NMR (500 MHz, DMSO-d6),δ:9.84 (s, 1H), 9.22 (s, 1H), 9.10 (s, 1H), 8.73 (d,J= 4.8 Hz,1H), 8.27 (dt,J= 8.0, 1.9 Hz, 1H), 7.56～7.49 (m, 1H), 6.89 (s,1H), 6.73 (s, 1H), 3.05～2.98 (m, 1H), 2.07 (s, 3H), 1.09 (d,J=6.9 Hz, 6H).13C NMR (126 MHz, DMSO-d6),δ: 164.60,154.40, 151.97, 148.57, 143.26, 135.25, 130.25, 130.22,125.34, 123.56, 121.36, 111.34, 27.47, 23.28, 15.45. HRMS:C16H19N2O2[M + H]+，計(jì)算值 271.144 1，實(shí)測(cè)值271.144 0.

N-(4-羥基-5-異丙基-2-甲基苯)-2-甲基呋喃-3-酰胺(7n)為黃色粉末狀固體，收率89%。1H NMR (400 MHz,DMSO-d6),δ: 9.21 (s, 1H), 9.16 (s, 1H), 7.56 (s, 1H), 7.00 (s,1H), 6.90 (s, 1H), 6.65 (s, 1H), 3.21～3.08 (m, 1H), 2.05 (s,3H), 1.14 (d,J= 6.9 Hz, 6H).13C NMR (126 MHz, DMSO-d6),δ: 161.73, 156.19, 152.44, 140.64, 132.30, 131.71, 127.30,124.81, 116.27, 115.85, 109.44, 26.10, 22.56, 17.66, 13.26.HRMS: C16H20NO3[M + H]+，計(jì)算值 274.143 8，實(shí)測(cè)值274.144 6.

N-(4-羥基-5-異丙基-2-甲基苯)呋喃-3-酰胺(7o)為淺黃色粉末狀固體，收率72%。1H NMR (500 MHz, DMSOd6),δ: 9.42 (s, 1H), 9.18 (s, 1H), 8.27 (s, 1H), 7.75 (s, 1H),6.94 (s, 1H), 6.90 (s, 1H), 6.64 (s, 1H), 3.19～3.09 (m, 1H),2.04 (s, 3H), 1.12 (d,J= 6.9 Hz, 6H).13C NMR (126 MHz,DMSO-d6),δ: 160.46, 152.55, 145.45, 144.07, 132.29, 131.78,127.06, 124.69, 122.91, 116.32, 109.22, 26.07, 22.56, 17.64.HRMS: C15H18NO3[M + H]+，計(jì)算值 260.128 1，實(shí)測(cè)值260.128 6.

2.2 抑菌活性

在10 和50 μg/mL 質(zhì)量濃度下，目標(biāo)化合物對(duì)5 種植物病原菌的抑菌活性如表1 和表2 所示。由表1 數(shù)據(jù)可以看出：在10 μg/mL 下，目標(biāo)化合物對(duì)茄鏈格孢菌和灰葡萄孢的抑菌活性較好，但對(duì)山茶炭疽菌、尖孢鐮刀菌和立枯絲核菌的抑制率均低于50%。其中，6e、6f 和7d、7e、7n 對(duì)茄鏈格孢菌的抑菌活性較好；7e 和7n 對(duì)灰葡萄孢的抑制率為65%以上，顯著高于陽(yáng)性對(duì)照香芹酚和百里香酚；7e 較香芹酚和百里香酚對(duì)山茶炭疽菌具有更高的抑菌活性；目標(biāo)化合物對(duì)尖孢鐮刀菌的抑制率均小于30%；6g 和7g、7j 對(duì)立枯絲核菌的抑制率顯著高于香芹酚和百里香酚。

表1 目標(biāo)化合物在10 μg/mL 下對(duì)植物病原真菌的抑菌活性Table 1 The antifungal activity of hybrid molecules against pathogenic fungi at 10 μg/mL

續(xù)表1Table 1 (Continued)

由表2 數(shù)據(jù)可以看出：在50 μg/mL 下，目標(biāo)化合物對(duì)山茶炭疽菌、尖孢鐮刀菌和立枯絲核菌的抑菌活性均較低，對(duì)山茶炭疽菌和尖孢鐮刀菌的抑制率顯著低于陽(yáng)性對(duì)照香芹酚和百里香酚。6e、6f 和7a、7b、7d、7n 對(duì)茄鏈格孢菌的抑制率高于80%；7d 和7n 對(duì)灰葡萄孢的抑制率高于75%；7j 對(duì)立枯絲核菌的抑菌活性顯著高于陽(yáng)性對(duì)照百里香酚，其抑制率為75.11%。

表2 目標(biāo)化合物在50 μg/mL 下對(duì)植物病原真菌的抑菌活性Table 2 The antifungal activity of hybrid molecules against pathogenic fungi at 50 μg/mL

續(xù)表2Table 2 (Continued)

綜上所述，合成的30 個(gè)“單萜酚 + SDHI 藥效團(tuán)”型酰胺類化合物在測(cè)定質(zhì)量濃度下對(duì)茄鏈格孢菌的抑菌活性最好，對(duì)灰葡萄孢的次之，對(duì)立枯絲核菌的較差，對(duì)山茶炭疽菌和尖孢鐮刀菌的抑菌活性最低。其中，化合物6d、6e、6f 和7d、7e、7f 對(duì)茄鏈格孢菌具有優(yōu)異的抑菌活性，10 μg/mL時(shí)抑制率達(dá)60%以上，50 μg/mL 時(shí)抑制率達(dá)75%以上。化合物7d、7e、7n 對(duì)灰葡萄孢的抑菌活性較好，與陽(yáng)性對(duì)照百里香酚相比差異顯著，尤其是7e 和7n 在10 μg/mL 時(shí)抑制率已達(dá)65%以上。

選擇對(duì)茄鏈格孢菌抑菌活性較好的化合物6d、6e、6f、7d、7e、7f 和對(duì)灰葡萄孢抑菌活性較好的化合物7d、7e、7n，進(jìn)一步測(cè)定其EC50值。結(jié)果 (表3) 表明：上述化合物對(duì)茄鏈格孢菌和灰葡萄孢絲生長(zhǎng)均有很好的抑制活性，對(duì)茄鏈格孢菌的EC50值在3.28～10.76 μg/mL 之間，其中化合物7d 和7e 的活性較好，EC50值分別為3.40 和3.28 μg/mL。化合物7d、7e 和7n 對(duì)灰葡萄孢的EC50值在15.06～18.65 μg/mL 之間，其中7e 的活性最好，EC50值為15.06 μg/mL。整體而言，化合物7d、7e、7f 和7n 對(duì)茄鏈格孢菌和灰葡萄孢具有較高的抑菌保留活性，其中7e 的活性最高。

表3 化合物對(duì)茄鏈格孢菌和灰葡萄孢的毒力測(cè)定Table 3 Toxicity test of compounds to A. solani and B. cinerea

選擇對(duì)灰葡萄孢抑菌活性最好的化合物7e，測(cè)定了其對(duì)啶酰菌胺高抗菌株 (BcR) 和B-P225F 突變菌株 (BcP225F) 的抑菌活性。結(jié)果 (圖1) 表明：化合物7e 對(duì)BcR和BcP225F也具有優(yōu)異的抑菌活性，其EC50值分別為9.49 和6.07 μg/mL，即化合物7e 對(duì)BcR和BcP225F的體外抑菌活性高于對(duì)照藥劑啶酰菌胺，且7e 與啶酰菌胺之間沒(méi)有交互抗性，具有用于灰葡萄孢抗性治理的潛在價(jià)值。

圖1 化合物對(duì)灰葡萄孢不同菌株的抑制活性Fig. 1 Antifungal activity of the compounds against different strains of B. cinerea

2.3 SDH 活性測(cè)定

牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線：在595 nm 處測(cè)得吸光度隨蛋白濃度變化的回歸方程為y=0.003 6x+0.429 9，相關(guān)系數(shù)r為0.990 4，可用此推算灰葡萄孢的蛋白濃度。

2.3.1 不同處理對(duì)灰葡萄孢可溶性蛋白含量的影響 以啶酰菌胺為對(duì)照，化合物7e 對(duì)灰葡萄孢敏感、抗性和P225F 突變菌株可溶性蛋白含量的影響如圖2 所示。從圖中可以看出，啶酰菌胺和化合物7e 以不同濃度處理BcS、BcR和BcP225F后，處理組可溶性蛋白含量均高于對(duì)照組，且7e 處理組較啶酰菌胺處理組變化明顯。啶酰菌胺處理后，BcS可溶性蛋白含量隨藥劑質(zhì)量濃度升高而增大；BcR和BcP225F可溶性蛋白含量變化不明顯，這可能是造成BcR和BcP225F對(duì)啶酰菌胺產(chǎn)生抗性的重要原因之一?；衔?e 處理BcS、BcR和BcP225F的可溶性蛋白含量變化趨勢(shì)基本一致，菌體內(nèi)可溶性蛋白含量均隨藥劑濃度升高而顯著增大，其中100 μg/mL的7e 處理后菌體內(nèi)溶物大量流出，可溶性蛋白含量急劇增加，為62.71～69.10 μg/mL，推測(cè)可能是化合物7e 使菌體細(xì)胞內(nèi)溶物外泄，致使細(xì)胞凋亡。對(duì)比啶酰菌胺和化合物7e 對(duì)BcS可溶性蛋白含量的影響，不難發(fā)現(xiàn)，在相同濃度下啶酰菌胺處理組的可溶性蛋白含量?jī)H為7e 處理組的一半，說(shuō)明7e 較啶酰菌胺更能干擾灰葡萄孢體內(nèi)可溶性蛋白含量的變化，更能影響菌體的正常生命活動(dòng)。

圖2 啶酰菌胺 (a) 和7e (b) 不同濃度處理對(duì)灰葡萄孢可溶性蛋白含量的影響Fig. 2 Changes of soluble protein content of B. cinerea after treatment with boscalid and 7e at different concentrations

2.3.2 不同處理對(duì)灰葡萄孢SDH 活性的影響 由圖3 可以看出，啶酰菌胺和化合物7e 對(duì)灰葡萄孢SDH 的抑制作用顯著，7e 對(duì)SDH 的抑制活性強(qiáng)于啶酰菌胺。啶酰菌胺處理組，BcS的SDH 活性下降較BcR和BcP225F的多，對(duì)照組SDH 比活力為53.19 U/mg prot，經(jīng)10、50 和100 μg/mL 的啶酰菌胺處理后，BcS的SDH 比活力分別下降33.57%、41.73%和56.38%；而B(niǎo)cR和BcP225F的SDH 比活力較對(duì)照組下降8.51%～26.59%，雖然啶酰菌胺對(duì)BcR和BcP225F也有SDH 抑制活性，但卻遠(yuǎn)不及對(duì)BcS的抑制活性高?；衔?e 處理組BcS、BcR和BcP225F的SDH 比活力較對(duì)照組均顯著下降；BcS各濃度處理間差異顯著，BcR和BcP225F的SDH 抑制活性對(duì)7e 的濃度依賴性不強(qiáng)；經(jīng)10 、50 和100 μg/mL 7e 處理后，SDH 比活力最高下降率分別為58.78%、61.39%和66.45%；化合物7e 對(duì)BcS、BcR和BcP225F均具有很強(qiáng)的SDH 抑制活性，表明7e 是潛在的新型SDHI。

圖3 啶酰菌胺 (a) 和7e (b) 處理對(duì)灰葡萄孢SDH 活性的影響Fig. 3 Influence of boscalid and 7e on SDH activity of B. cinerea

2.4 分子對(duì)接

參照陶麗紅等[8]報(bào)道的分子對(duì)接方法，同源構(gòu)建了BcSDH 的3D 模型，將啶酰菌胺和化合物7e 分別與野生型和B-P225F 突變型BcSDH 進(jìn)行分子對(duì)接，選擇親和力最高的構(gòu)象，生成啶酰菌胺和7e 分別與蛋白大分子的復(fù)合物。由結(jié)合模式(圖4) 可知：藥物與BcSDH 的結(jié)合位點(diǎn)在B、C、D 亞基構(gòu)成的活性口袋內(nèi)。啶酰菌胺能夠與野生型BcSDH (圖4 Ⅰ) 的B-W229、C-L72、CR88、C-I89 形成疏水作用；與D-Y144 形成氫鍵；具體為啶酰菌胺酸部分的吡啶環(huán)上的碳原子與C-R88、胺部分的聯(lián)苯環(huán)的碳原子與B-W229、C-L72、C-I89 形成疏水作用；酰胺鍵上的氮原子與D-Y144 氨基酸殘基形成氫鍵。B-P225F 突變后(圖4Ⅱ)，苯丙氨酸側(cè)鏈所占空間較脯氨酸側(cè)鏈稍大，活性口袋變窄，啶酰菌胺被往外推，其構(gòu)象在活性腔口發(fā)生了翻轉(zhuǎn)，雖然還能與突變型BcSDH結(jié)合，但親和力下降了3.34 kJ/mol，這可能是灰葡萄孢對(duì)啶酰菌胺產(chǎn)生抗藥性的重要原因之一。

圖4 啶酰菌胺和7e 與野生型和突變型BcSDH 的結(jié)合模式Fig. 4 The binding modes of boscalid and 7e with wild-type or mutant BcSDH

與啶酰菌胺相比，化合物7e 能夠與野生型BcSDH 形成更多的相互作用力 (圖4Ⅲ)，參與形成疏水作用的氨基酸分別為B-P225、B-W229、BI274 和C-W81、C-I89；參與形成氫鍵的氨基酸為D-Y144；參與形成π-陽(yáng)離子作用的氨基酸為C-R88。具體為7e 的酸部分 (3-甲基噻吩) 插入B cS D H 活性腔的底部，噻吩環(huán)上的甲基和氮原子分別與B-P225 和B-I274 氨基酸殘基形成疏水作用，噻吩環(huán)與C-R88 氨基酸殘基上的磷原子形成π-陽(yáng)離子作用；酰胺鍵上的氧原子與DY144 氨基酸殘基形成氫鍵；胺部分的百里香酚與B-W229、C-W81 和C-I89 氨基酸殘基形成疏水作用。B-P225F突變后 (圖4Ⅳ)，雜合分子7e 仍能進(jìn)入BcSDH 的活性口袋，與相應(yīng)氨基酸側(cè)鏈形成強(qiáng)有力的相互作用，雖然形成相互作用力的類型和參與形成相互作用的氨基酸發(fā)生了一定改變，但結(jié)合親和力卻增強(qiáng)了0.84 kJ/mol。具體為7e 酸部分 (3-甲基噻吩) 的噻吩環(huán)不與C-R88 形成π-陽(yáng)離子作用，而與B-F225 形成π-π 堆積作用；酰胺鍵羰基不與D-Y144 形成氫鍵，胺基與B-W229 形成氫鍵；胺部分百里香酚上的甲基、苯環(huán)和異丙基能夠與B-W229、C-L72、C-W81、D-Y144 形成更多的疏水作用。這些疏水作用、氫鍵、π-陽(yáng)離子作用和π-π堆積作用的形成，可能是雜合分子7e 能夠穩(wěn)定存在野生型和突變型BcSDH 中發(fā)揮藥效、產(chǎn)生較高抑菌活性的原因。結(jié)合抑菌活性測(cè)定結(jié)果分析，可能小基團(tuán)更容易進(jìn)入植物病原菌SDH 活性口袋，噻吩環(huán)與SDH 蛋白周圍的氨基酸殘基形成π-陽(yáng)離子作用、π-π 堆積作用和疏水作用有利于提高配體與受體識(shí)別度[25]；噻吩環(huán)、噻吩環(huán)上的甲基和胺部分的百里香酚與SDH 蛋白周圍的氨基酸殘基形成的疏水作用則可能在很大程度上增加熵值、降低自由能，維持藥物與靶標(biāo)之間的結(jié)合穩(wěn)定性[26-27]。

3 討論

SDHI 類殺菌劑的作用靶標(biāo)為SDH，本研究的設(shè)計(jì)思路是將SDHI 藥效團(tuán)與具有廣譜抑菌活性的香芹酚和百里香酚拼合設(shè)計(jì)雜合分子，但目前香芹酚和百里香酚的作用機(jī)制尚不完全清楚，可能通過(guò)抑制病原菌麥角甾醇的生物合成[28]、破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)、改變胞內(nèi)外滲透壓和抑制呼吸作用等途徑導(dǎo)致病菌裂解死亡[29]。最新研究表明，百里香酚通過(guò)調(diào)節(jié)多種信號(hào)通路，包括抑制Ca2+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因表達(dá)來(lái)降低細(xì)胞內(nèi)Ca2+的濃度，抑制N-糖基化基因表達(dá)來(lái)減少蛋白質(zhì)糖基化，通過(guò)調(diào)節(jié)高滲透性甘油 (HOG) 和絲裂原活化蛋白激酶(MAPK) 信號(hào)通路來(lái)降低麥角甾醇生物合成基因的表達(dá)，從而降低內(nèi)源麥角甾醇含量[30]。本研究合成的酰胺類雜合分子7e 對(duì)茄鏈格孢菌和灰葡萄孢都有很好的抑菌活性，且對(duì)BcR和BcP225F的抑菌活性優(yōu)于BcS，對(duì)BcR和BcP225F的抑菌活性優(yōu)于對(duì)照藥劑啶酰菌胺，與啶酰菌胺之間不存在交互抗性，具有作為新型殺菌劑活性成分的潛能，能夠?yàn)橹参锊『剐灾卫硖峁┬吕碚撘罁?jù)。

本研究表明，啶酰菌胺和雜合分子7e 的酸部分能夠插入野生型BcSDH 活性腔底，與B-P225、B-I274 和C-R88 氨基酸殘基形成疏水作用或π-陽(yáng)離子作用；酰胺鍵上的氮原子或氧原子能夠與DY144 氨基酸殘基形成氫鍵；胺部分伸向活性腔口，與B-W229、C-W81 和C-I89 等形成疏水作用。本研究結(jié)果與Zhu 等[31]研究結(jié)果基本一致，他們對(duì)10 種SDHI 與SDH 的結(jié)合模式進(jìn)行了分析，結(jié)果表明：殺菌劑的酸部分能夠插入SQR 結(jié)合的q 位點(diǎn) (等同于本文SDH 的活性口袋)，與周圍C-R46、C-S42、B-I218 和B-P169 (等位于本文的C-R88、C-S84、B-I274 和B-P225) 形成范德華力；胺部分延伸到q 位點(diǎn)入口 (等同于本文的活性腔口)，與C-W35、C-I43 和C-I30 (等位于本文的C-W81、C-I89 和C-I76) 形成范德華力；酰胺的羰基氧原子與B-W173 和D-Y91 形成氫鍵 (等位于本文的B-W229 和D-Y144)。因此，在SDHI 類殺菌劑結(jié)構(gòu)修飾時(shí)，酸部分應(yīng)盡可能是富電子的芳環(huán)或雜環(huán)，骨架部分需含氫鍵受體，胺部分應(yīng)該為一個(gè)龐大的疏水基團(tuán)。

本研究還表明，啶酰菌胺處理后BcR和BcP225F的可溶性蛋白含量變化不大，啶酰菌胺對(duì)BcR和BcP225F中SDH 的抑制活性低于其對(duì)BcS中SDH 的抑制活性；結(jié)合模式分析也表明，B-P225F 突變?cè)斐葿cSDH 活性口袋變窄，啶酰菌胺不能進(jìn)入突變型BcSDH 活性口袋，且在活性口袋外的構(gòu)象發(fā)生了翻轉(zhuǎn)，導(dǎo)致啶酰菌胺與蛋白大分子的結(jié)合親和力急劇下降。這些因素很可能是共同導(dǎo)致BcR和BcP225F對(duì)啶酰菌胺產(chǎn)生抗藥性的原因。而化合物7e 處理能夠讓灰葡萄孢各菌株可溶性蛋白含量明顯外泄、SDH 抑制活性顯著下降，且化合物7e 能夠與突變型BcSDH 產(chǎn)生更為緊密的結(jié)合，其中胺部分的百里香酚與蛋白大分子氨基酸側(cè)鏈形成的疏水作用大幅上升。啶酰菌胺和化合物7e 對(duì)BcS、BcR和BcP225FSDH 抑制活性的差異和與野生型和突變型BcSDH 結(jié)合模式的不同，可能是造成菌株對(duì)啶酰菌胺抗性上升而對(duì)化合物7e 依然敏感的原因。

4 結(jié)論

本研究設(shè)計(jì)合成了30 個(gè)“單萜酚 + SDHI 藥效團(tuán)”的酰胺類雜合分子，通過(guò)1H NMR、13C NMR和HRMS 表征了其結(jié)構(gòu)，并測(cè)定這些雜合分子對(duì)5 種常見(jiàn)植物病原真菌的抑菌活性，得出如下結(jié)論：

1) 在所合成的雜合分子中，7e 的抑菌活性最高，對(duì)茄鏈格孢菌和灰葡萄孢的EC50值分別為3.28 和15.06 μg/mL，且對(duì)灰葡萄孢的體外抑菌活性優(yōu)于對(duì)照藥劑啶酰菌胺，與啶酰菌胺之間沒(méi)有交互抗性。

2) 7e 是潛在的新型SDHI，其與啶酰菌胺的用于靶標(biāo)相同，對(duì)BcS、BcR和BcP225F都具有顯著的SDH 抑制活性，且能夠與B-P225F 突變的BcSDH 結(jié)合，這也可能是其與啶酰菌胺沒(méi)有交互抗性的原因。