高建輝 崔小鋒 張超凡 屈玉疆 劉俊昌 王 程△

(1.新疆醫(yī)科大學附屬中醫(yī)醫(yī)院推拿科，新疆 烏魯木齊 830000；2.新疆醫(yī)科大學中醫(yī)學院針推骨傷教研室，新疆 烏魯木齊 830000)

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選取新疆醫(yī)科大學動物實驗中心Wistar大鼠共64只，雌雄各半，體質量(300±50)g，實驗動物生產許可證號SCXK(新)2018-0002，飼養(yǎng)條件適宜，溫度控制在18～22 ℃，通風及光線條件良好。

1.2 試劑及器械 戊巴比妥鈉(國藥集團化學試劑有限公司)，Orexin-A檢測試劑盒、多巴胺(DA)檢測試劑盒、5-羥色胺(5-HT)檢測試劑盒(武漢華美生物工程有限公司)，乙酰膽堿(Ach)檢測試劑盒、去甲腎上腺素(NA)檢測試劑盒、γ-氨基丁酸(GABA)檢測試劑盒、組胺(HA)檢測試劑盒(南京建成生物科技有限公司)，食欲素受體拮抗劑Suvorexant(MK-4305)(大連美侖生物技術有限公司)。微量移液器(大龍醫(yī)療設備有限公司)，高速冷凍離心機(上海力申科學儀器制造廠)，酶標儀(美國Bio-Rad公司)，電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海精宏試驗設備有限公司)，微量振蕩器(江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠)。

1.3 實驗方法

1.3.1 分組及造模 大鼠適應性喂養(yǎng)3 d，稱質量編號后采用分層隨機分組方法分為正常對照組、模型對照組、摩腹手法組、受體拮抗劑組，每組16只，雌雄各半。除正常對照組外，其余3組制備睡眠剝奪模型。造模期間每日8:00開燈，20:00關燈，采用自制改良平臺水環(huán)境法：準備48個塑料圓桶，高度40 cm，桶口直徑30 cm，并在其底部固定1個高度10 cm，直徑6 cm的金屬圓體水平臺，圓桶內注水，水面低于水平臺面約1 cm，水溫保持在20 ℃左右，將正常對照組之外的其他3組大鼠放置在此造模平臺上，每桶放1只大鼠，并將直徑25 cm，網(wǎng)格大小1 cm的圓形金屬網(wǎng)固定在距桶底25 cm處，金屬網(wǎng)上放置飲用水和飼料，每日定期更換污水，連續(xù)造模8 d。采用戊巴比妥鈉協(xié)同睡眠實驗判定造模是否成功[12]。

1.3.2 干預方法 造模完成后立即進行如下操作：摩腹手法組大鼠仰臥位固定于外固定架上，操作者位于大鼠左側，右手中指末節(jié)羅紋面作用于大鼠關元穴，通過肩關節(jié)在前外方向的小幅度環(huán)轉，帶動中指在大鼠腹部做環(huán)形平移摩擦。移動范圍：鳩尾穴→帶脈穴→關元穴→帶脈穴→鳩尾穴的閉合圓環(huán)，5～7圈/min，順、逆時針各操作5 min，每日操作1次，連續(xù)治療2周。受體拮抗劑組予食欲素受體拮抗劑10 mg/kg灌胃，每日1次，2 h后固定于外固定架上予摩腹療法，操作同摩腹手法組。正常對照組、模型對照組每日僅固定于外固定架上10 min，不進行任何操作。

1.4 觀察指標及方法 ①4組大鼠干預2周后，各大鼠完全麻醉后腹主動脈采血2 mL，置于真空采血管，離心收集血清，采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測血清DA、NA、5-HT、Ach、GABA、HA、Orexin-A水平。②各大鼠依次斷頭處死，取腦組織，分離出下丘腦、腦干等組織，每只大鼠均取少量的下丘腦組織，勻漿后采用ELISA法檢測GABA、HA、Orexin-A含量；各組取少量的腦干組織，勻漿后采用ELISA法檢測DA、NA、5-HT、Ach含量。檢測過程均嚴格按照試劑盒說明書進行。

2 結果

2.1 大鼠的一般情況 造模過程中摩腹手法組和受體拮抗劑組各脫落1只。模型對照組、摩腹手法組、受體拮抗劑組造模后大鼠出現(xiàn)明顯的失眠癥狀：精神欠佳，毛發(fā)無光澤，易脫落，體質量減輕,對外界刺激敏感，易激惹，動物之間打斗頻繁，攻擊性增強，不時有動物從水平臺掉落水中，晝夜規(guī)律顛倒；正常對照組精神良好，無明顯攻擊性，毛發(fā)潤澤，行動正常。

2.2 各組大鼠血清DA、NA、5-HT、Ach、GABA、HA含量比較 與正常對照組比較，模型對照組血清DA、NA、Ach、HA含量均升高(P<0.05)，5-HT、GABA含量均降低(P<0.05)；與模型對照組比較，摩腹手法組和受體拮抗劑組DA、Ach含量均降低(P<0.05)，5-HT含量均升高(P<0.05)，NA、GABA、HA含量比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；摩腹手法組與受體拮抗劑組組間各檢測指標比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組大鼠血清DA、NA、5-HT、Ach、GABA、HA含量比較

2.3 各組大鼠腦干DA、NA、5-HT、Ach含量比較 與正常對照組比較，模型對照組腦干DA、NA、Ach含量均升高(P<0.05)，5-HT含量降低(P<0.05)，摩腹手法組、受體拮抗劑組Ach含量均升高(P<0.05)，5-HT含量均降低(P<0.05)；與模型對照組比較，摩腹手法組腦干DA、NA、Ach含量和受體拮抗劑組腦干DA、NA含量均降低(P<0.05)，5-HT含量均升高(P<0.05)；摩腹手法組與受體拮抗劑組組間各檢測指標比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 各組大鼠腦干DA、NA、5-HT、Ach含量比較

2.4 各組大鼠下丘腦GABA、HA含量比較 與正常對照組比較，模型對照組下丘腦HA含量升高(P<0.05)，GABA無變化(P>0.05)；模型對照組、摩腹手法組和受體拮抗劑組3組組間下丘腦HA、GABA含量比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表3。

表3 各組大鼠下丘腦GABA、HA含量比較

2.5 各組大鼠血清、下丘腦Orexin-A含量比較 與正常對照組比較，模型對照組血清、下丘腦Orexin-A含量均升高(P<0.05)；與模型對照組比較，摩腹手法組下丘腦Orexin-A含量降低(P<0.05)，血清Orexin-A含量無明顯變化(P>0.05)，受體拮抗劑組血清、下丘腦Orexin-A含量均降低(P<0.05)；摩腹手法組與受體拮抗劑組組間血清、下丘腦Orexin-A含量比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表4。

表4 各組大鼠下丘腦、血清Orexin含量比較

3 討論

現(xiàn)代醫(yī)學認為，睡眠周期的產生與維持主要依賴于腦內的睡眠和覺醒系統(tǒng)，失眠的發(fā)病機制主要表現(xiàn)為腦皮質過度覺醒，即抑制性作用的減弱和易化性作用的增強[13]。Orexin系統(tǒng)作為覺醒啟動區(qū)，對于覺醒系統(tǒng)，能分泌神經(jīng)肽Orexin-A和Orexin-B促進腦區(qū)的覺醒[14-15]，增強大腦皮質對單胺能神經(jīng)元功能活動的“易化”影響，促進單胺類神經(jīng)遞質(DA、NA、Ach、5-HT等)的分泌，從而維持覺醒狀態(tài)[16]，其中DA、NA、Ach、HA遞質促進大腦的覺醒，5-HT、GABA維持睡眠狀態(tài)，Orexin 系統(tǒng)統(tǒng)一調控睡眠中樞與單胺能覺醒中樞，食欲素受體拮抗劑通過胃腸道吸收，阻斷Orexin神經(jīng)肽調控單胺類神經(jīng)遞質的分泌。本研究結果表明，與正常對照組比較，模型對照組血清DA、NA、Ach、HA含量均升高(P<0.05)，5-HT、GABA含量均降低(P<0.05)；腦干DA、NA、Ach含量均升高(P<0.05)，5-HT含量降低(P<0.05)；下丘腦HA、血清和下丘腦Orexin-A含量均升高(P<0.05)。提示改良平臺水環(huán)境法建立的大鼠失眠模型影響血清和中樞神經(jīng)的多種遞質，并可增加覺醒啟動區(qū)Orexin-A水平。與模型對照組比較，受體拮抗劑組血清DA、Ach含量均降低(P<0.05)，5-HT含量升高(P<0.05)；腦干DA、NA含量均降低(P<0.05)，5-HT含量升高(P<0.05)；血清、下丘腦Orexin-A含量均降低(P<0.05)。提示失眠模型大鼠灌胃食欲素受體拮抗劑后，Orexin-A含量在血清和下丘腦中均下降，并且對DA、NA、Ach、5-HT含量也產生影響。但是上述的結果與其他的研究有所差別，陳樺等[17]研究表明，失眠大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)組織中Orexin、NA的含量均升高，雖然與本實驗研究結果相一致，但是5-HT的含量有差異，可能與2個實驗取材的組織差異相關。對于睡眠系統(tǒng)，Orexin系統(tǒng)通過增加單胺神經(jīng)能的興奮來抑制GABA投射，從而抑制膽堿能神經(jīng)元活性，維持睡眠狀態(tài)，其水平降低可能與該神經(jīng)遞質的合成、傳導、受體結合及降解相關。本實驗研究表明，GABA在水環(huán)境造模及治療中變化不大，唐漢慶等[18]研究表明，失眠大鼠血清中GABA的含量明顯下降，而本實驗因為樣本不符合正態(tài)分布，選擇秩和檢驗，也是兩者實驗存在差異的一個影響因素。

失眠屬中醫(yī)學“不寐”范疇?！峨y經(jīng)》曰：“人之安臥，神歸心，魄歸肺，魂歸肝，意歸脾，志歸腎，五臟各安其位而寢?！备共客颇弥苯幼饔糜诟共浚罁?jù)中醫(yī)經(jīng)絡臟腑學說，通過對腹部的經(jīng)絡腧穴進行推按和點穴，能夠貫通身體上下氣機，調節(jié)五臟六腑功能，從而起到治療“不寐”的作用?！澳X腸軸”是將胃腸道和中樞神經(jīng)系統(tǒng)連接起來的神經(jīng)-內分泌系統(tǒng)，有雙向調節(jié)作用，一方面，高級神經(jīng)中樞通過腦腸軸傳遞信號作用于胃腸道，并影響其感覺、動力及分泌；另一方面，胃腸道也可以通過該軸反作用到中樞神經(jīng)系統(tǒng)，而推拿手法正是通過機械力作用于皮膚觸壓感受器，刺激內臟神經(jīng)，使其發(fā)生編碼作用和機械能轉換為電能的過程，并產生電沖動傳導至中樞神經(jīng)[19]。趙祥等[20]研究表明，腹部推拿手法可以提高腸動力障礙兔模型腸道Ach神經(jīng)纖維的含量；臟腑推拿手法不僅可以改善局部微循環(huán)，還刺激椎前神經(jīng)節(jié),以減輕交感神經(jīng)興奮的癥狀，并能減少NA對交感神經(jīng)的影響[21]；摩腹療法可以即刻激活兔模型的丘腦，累積后逐漸擴展到扣帶前回和腦島皮質[22]，以上說明腹部推拿手法可以通過腦腸軸來影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)。而本研究結果顯示，與模型對照組比較，摩腹手法組血清DA、Ach和腦干DA、NA、Ach含量均降低(P<0.05)，血清和腦干5-HT含量均升高(P<0.05)，下丘腦Orexin-A含量降低(P<0.05)，提示摩腹手法治療失眠模型大鼠療效確切，可明顯改善血清和腦干多種神經(jīng)遞質水平，降低下丘腦Orexin水平。

綜上所述，摩腹療法治療失眠大鼠的機制可能是摩腹療法降低外周血清和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的Orexin水平，進而興奮5-HT能神經(jīng)元，抑制NA、DA、Ach能神經(jīng)元來實現(xiàn)的，這為臨床中推廣使用摩腹療法治療失眠提供了實驗依據(jù)和理論基礎。此外，本實驗仍存在一些不足，本次實驗只研究了對Orexin和神經(jīng)遞質的影響，缺少大腦電活動及電位變化，以及相關靶點如何影響神經(jīng)遞質尚待進一步研究，本次研究可能只涉及其中的部分機制，后續(xù)將在現(xiàn)有基礎上開展進一步研究。