劉 玉，劉 影，伍志發(fā)，鹿靜雅

中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)附屬第一醫(yī)院影像科，合肥 230001

骨髓間充質(zhì)干細胞(bone mesenchymal stem cells，BMSCs)是干細胞家族成員之一，不僅具有分化為神經(jīng)元樣細胞的潛能，還可通過攜帶并表達外源治療基因來促進受損神經(jīng)功能的恢復(fù)，為腦梗死的治療提供了一種新方法[1-2]。此外，BMSCs能夠修復(fù)血管損傷，防止組織缺血，且能夠分泌血管內(nèi)皮生長因子，誘導(dǎo)缺血組織的血管再生和功能恢復(fù)[3-4]。許多動物實驗[5-6]和臨床研究[7]表明干細胞移植可促進腦缺血時神經(jīng)功能的恢復(fù)。相關(guān)實驗表明，其治療效果可能與BMSCs的分泌功能有關(guān)，BMSCs會分泌不同類型的營養(yǎng)因子，導(dǎo)致神經(jīng)發(fā)生和血管生成。腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)是重要的神經(jīng)元保護因子和維持海馬功能不可或缺的多肽物質(zhì)，具有較強的刺激和促進神經(jīng)細胞生長分化的作用，同時參與突觸間神經(jīng)遞質(zhì)的傳遞和突觸重建。BDNF在腦缺血的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，對腦卒中后活動能力改善具有重要意義[8-11]。酪氨酸酶基因(tyrosinase，TYR)作為MR報告基因已引起眾多學(xué)者的關(guān)注，它是以內(nèi)源性Fe3+為成像基礎(chǔ)，成像過程中避免了外源性示蹤劑會隨著細胞的分裂分化信號逐漸丟失的缺點，也不需要分子探針作用于底物，因此是一種較為理想的MR成像基因。

BMSCs可以分泌內(nèi)皮生長因子和BDNF，但分泌水平低。我們希望開發(fā)一種基于慢病毒載體技術(shù)的骨髓間充質(zhì)干細胞BDNF過度表達和分泌系統(tǒng)，提高BMSCs的治療效果，促進功能恢復(fù)。本實驗構(gòu)建攜帶報告基因TYR及治療基因BDNF的重組慢病毒載體，且載體中含有熒光素酶(luciferase)報告基因。體外轉(zhuǎn)染BMSCs，構(gòu)建過表達TYR和BDNF的細胞株。建立大鼠中動脈梗塞模型，利用載體中含有的熒光蛋白進行光學(xué)顯像，示蹤干細胞腦內(nèi)分布情況，為下一步以TYR為報告基因的MR分子成像及評價細胞與基因雙重治療腦梗死的療效奠定實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物和細胞株 7～8周齡SD大鼠24只，購自南京大學(xué)模式研究所，于SPF級動物房內(nèi)飼養(yǎng)。BMSCs細胞株購自北納生物公司。

1.1.2 主要試劑與儀器 質(zhì)粒DNA提取試劑盒、T4 DNA連接酶、DNA凝膠回收試劑盒(TaKaRa，日本)，EcoRⅠ和BamHⅠ限制性內(nèi)切酶、MluⅠ和BsiWI限制性內(nèi)切酶(Fermantas，中國)，E.coliDH5a感受態(tài)細胞、293T細胞、含綠色熒光蛋白的慢病毒載體H7656由和元生物公司提供。ELISA試劑盒(Biosciences，中國)，TTC(T8877，Sigma，美國)。凝膠成像分析儀(培清科技)，PCR儀(Applied Biosystems，美國)，Western blot及IP細胞裂解液(碧云天)，Pierce BCA Protein Assay Kit(ThermoFisher，美國)，熒光顯微鏡(DMI8，LEICA，中國)，激光多普勒血流儀(Moor，美國)，光學(xué)活體成像儀(IVIS Lumina Ⅱ，美國)。

1.2 重組慢病毒載體構(gòu)建與鑒定

在GenBank中查詢目的基因以及上下游的序列，用VectorNTI軟件進行引物設(shè)計。設(shè)計包含酶切位點的TYR和BDNF擴增引物。PCR擴增獲取目的基因。慢病毒載體H7656(PLENTI-CBH-3XFLAG-LUC2-TCMV-MNEONGREEN-F2A-PURO-WPRE)中包含熒光素酶報告基因luc2和綠色熒光蛋白基因mNeonGreen。利用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和BamHⅠ，MluⅠ和BsiWⅠ將PCR產(chǎn)物和慢病毒載體H7656進行雙酶切，PCR酶切產(chǎn)物回收備用，通過凝膠回收法回收大片段載體，用T4 DNA連接酶進行連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞，挑取陽性克隆，提取質(zhì)粒，測序鑒定。

1.3 慢病毒的包裝及病毒滴度測定

取對數(shù)生長期的293T細胞，接種于細胞培養(yǎng)皿中，細胞密度達60%～70%時，將重組慢病毒共轉(zhuǎn)染293T細胞，轉(zhuǎn)染48 h后離心5 min收集含病毒顆粒的上清液，標定滴度。在倒置熒光顯微鏡下觀察。

1.4 慢病毒載體感染BMSCs

BMSCs細胞培養(yǎng)液為RPMI-1640+10%FBS，在37℃，5%CO2中培養(yǎng)。將BMSCs細胞接種到24孔板，配成6×104個/mL的細胞懸液，鋪板，12～20 h后感染病毒。每孔加2.5 μL 1 mg/mL polybrene，病毒載體H7656以感染復(fù)數(shù)MOI=10、20、40、80、100體外轉(zhuǎn)染BMSCs，感染72 h后熒光顯微鏡下觀察綠色熒光表達以判斷轉(zhuǎn)染是否成功，選取最佳MOI。

1.5 RT-PCR檢測TYR及BDNF mRNA的表達

RT-PCR檢測重組慢病毒H16189感染BMSCs后目的基因的表達，GAPDH為內(nèi)參基因。引物序列見表1。采用RNA提取試劑盒提取細胞總RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄、擴增cDNA，PCR檢測細胞中TYR和BDNF的表達情況。對照組為空細胞和H7656質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的BMSCs。通過對樣本Ct值的測算，用相對定量法檢測目的基因mRNA的表達水平。

1.6 Western blot檢測TYR蛋白表達

細胞加入預(yù)冷的PBS及IP細胞裂解液，冰上裂解細胞30 min，轉(zhuǎn)移至含裂解細胞的離心管，置于預(yù)冷的高速離心機，4℃，12000 r/min離心5～10 min，提取細胞總蛋白，測定蛋白濃度。蛋白樣品水浴變性后，10%聚丙烯酰胺凝膠電泳。蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，加入一抗，4℃孵育過夜，洗膜3次，加入二抗，室溫孵育1～2 h，用TBST在室溫下脫色搖床上洗3次，每次10 min，進行化學(xué)反應(yīng)。將發(fā)光液滴加在膜上，充分覆蓋膜表面，然后放入成像儀中拍照。

1.7 ELISA法檢測BDNF蛋白的表達

按照ELISA試劑盒操作說明，將抗原用包被稀釋液稀釋到適當(dāng)濃度，每孔抗原加入100 μL；棄去孔中液體。5%小牛血清置37℃封閉40 min。封閉結(jié)束后。將稀釋好的樣品加入酶標反應(yīng)孔中。每孔加入酶標試劑50 μL，溫育并洗滌。每孔先加入顯色劑A 50 μL，再加入顯色劑B 50 μL，輕輕振蕩混勻，37℃避光顯色15 min。每孔加入終止液終止反應(yīng)。以空白孔調(diào)零，450 nm波長依序測量各孔的吸光度(A)值。

1.8 制備大鼠大腦中動脈梗塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)模型

SD大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后進行手術(shù)，手術(shù)過程中大鼠注射5%異氟醚后補注1%～1.5%異氟醚進行麻醉，術(shù)中直腸溫度維持在(37.0±0.5)℃；將單纖維絲插入左側(cè)頸內(nèi)動脈并經(jīng)頸總動脈引起局灶性腦缺血，并用激光多普勒血流儀監(jiān)測MCA區(qū)腦血流；缺血處理60 min后，去除單纖維絲，縫合皮膚切口。MCAO為模型組，Sham組為假手術(shù)組。

1.9 腦組織TTC染色

在腦缺血手術(shù)完成72 h后處死大鼠，取新鮮腦組織，切成1 mm左右冠狀面切片。使用2，3，5-三苯基氯化四氮唑(TTC)染色，在活組織中，TTC在脫氫酶的作用下還原為紅色的甲氧嘧啶產(chǎn)物，而蒼白的區(qū)域則對應(yīng)于梗死區(qū)域。

1.10 神經(jīng)功能學(xué)評分

神經(jīng)功能缺損采用48分制評分。該評分系統(tǒng)由一般狀態(tài)(自發(fā)活動、身體對稱性、步態(tài)；0～12分)、簡單運動缺陷(前肢不對稱、旋轉(zhuǎn)、后肢放置；0～14分)、復(fù)雜運動障礙(垂直爬屏、游梁；0～8分)和感覺缺陷(后肢、軀干、振動和面部觸摸；0～14分)組成?？偡譃?個單項得分之和，0分代表無缺陷，48分代表最大缺陷。

1.11 紋狀體細胞注射

將成年雄性大鼠24只隨機分為4組，假手術(shù)組(Sham組)8只，模型組(組)16只，兩組中大鼠再平均分為BMSCs-H7656組和BMSCs-H16189組。大鼠接受5%異氟醚注射和1%～1.5%異氟醚補充。用5 μL漢密爾頓注射器將含200萬個細胞的5 μL生理鹽水注射到內(nèi)側(cè)紋狀體，持續(xù)10 min，然后取出注射器，縫合大鼠。Sham組注射右側(cè)，MCAO組注射左側(cè)。

1.12 小動物成像觀察BMSCs腦內(nèi)分布

MCAO組及Sham組分別注射H16189-BMSCs及H7656-BMSCs入紋狀體，在72 h內(nèi)收集腦組織，用PE IVIS Lumina系統(tǒng)檢測干細胞分布和干細胞熒光強度。在BMSC-H16189組損傷區(qū)域及未損傷區(qū)域半球的紋狀體上切取20 μm腦片，采用熒光顯微鏡觀察，并拍照。

1.13 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 5.0軟件對數(shù)據(jù)進行分析，計量資料采用均數(shù)±標準差表示，組內(nèi)比較采用總體均數(shù)的假設(shè)檢驗(t-test)，多組間比較采用Anova方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 慢病毒載體構(gòu)建及鑒定

H7656質(zhì)粒(PLENTI-CBH-3XFLAG-LUC2-TCMV-MNEONGREEN-F2A-PURO-WPRE)、H16188質(zhì)粒(PLENTI-CBH-TYR-3XFLAG-P2A-LUC2-TCMV-MNEONGRE-F2A-PURO-WPRE)及H16189質(zhì)粒(PLENTI-CBH-TYR-3XFLAG-P2A-LUC2-TCMV-BDNF-6XHIS-F2A-PURO-WPRE)圖譜如圖1所示。引物序列見表1。

圖1 H7656、H16188及H16189載體圖譜Fig.1 The vector maps of H7656，H16188 and H16189

表1 目的基因引物序列Table 1 The primer sequences of target genes

2.2 重組慢病毒的包裝及病毒滴度測定

將慢病毒表達質(zhì)粒和包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細胞，24 h后在熒光顯微鏡下觀察到綠色熒光表達(圖2)，說明重組病毒包裝成功。重組慢病毒載體轉(zhuǎn)染293T細胞后，測定慢病毒滴度約為2.6×108TU/mL。

A：熒光視野；B：白光視野圖2 慢病毒載體轉(zhuǎn)染293T細胞24 h后熒光表達(×200)Fig.2 The fluorescence expression of 293T cells was observed 24 h after transfection with lentiviral vector(×200)

2.3 病毒載體MOI篩選

BMSCs細胞感染慢病毒H7656 72 h后，MOI為10時感染效率未達到80%，MOI為20、40、80、100時感染效率均達到80%(圖3)。以感染效率高、MOI值低、對細胞毒性低為前提，實驗結(jié)果提示最佳感染條件是MOI為20。

圖3 不同MOI值慢病毒載體轉(zhuǎn)染BMSCs(×100)Fig.3 BMSCs were transfected by lentiviral vectors with different MOI(×100)

2.4 重組慢病毒中TYR和BDNF mRNA及蛋白表達

慢病毒感染BMSCs后，以GAPDH為內(nèi)參，BMSC-H16189組、BMSCs-H7656組及BMSCs組的TYR基因相對表達值分別為(134483.40±3904.50)、(1.03±0.29)、(0.37±0.23)，BDNF的基因相對表達(756.60±8.02)、(1.00±0.03)、(1.41±0.05)，顯示BMSC-H16189組TYR和BDNF mRNA表達量明顯高于BMSCs-H7656組及BMSCs組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)。

以GAPDH為內(nèi)參，Western blot檢測細胞中TYR-3XFLAG-P2A蛋白質(zhì)表達情況，發(fā)現(xiàn)在70～100 kD之間檢測到蛋白條帶，預(yù)測蛋白大小約為66 kD(圖4)。Western blot未檢測到BDNF蛋白的表達，利用ELISA實驗檢測到BDNF蛋白表達(表2)。

1：Marker；2：BMSCs；3：BMSCs-H7656；4：BMSCs-H16189圖4 Western blot檢測TYR蛋白的表達結(jié)果Fig.4 The expression level of TYR protein detected by Western blotting

表2 ELISA檢測BDNF表達Table 2 The expression level of BDNF protein detected by ELISA

2.5 SD大鼠腦梗死模型的建立

SD大鼠MCAO模型構(gòu)建成功，激光多普勒檢測大腦中動脈區(qū)腦血流改變?nèi)鐖D5A。72 h后，取新鮮腦組織TTC染色，如圖5B所示，MCAO組右側(cè)梗死區(qū)為蒼白色，正常區(qū)域為紅色。兩組大鼠神經(jīng)功能評分如圖5C所示。Sham組神經(jīng)功能無缺陷，MCAO組神經(jīng)功能評分19～22分。

A：激光多普勒血流儀監(jiān)測MCAO區(qū)腦血流；B：TTC染色顯示MCAO組右側(cè)梗死區(qū)為蒼白色，正常區(qū)域為紅色；C：MCAO模型神經(jīng)功能學(xué)評分圖5 大鼠腦梗死模型的建立Fig.5 Establishment of cerebral infarction model in rats

2.6 熒光成像

紋狀體注射后，用PE IVIS Lumina系統(tǒng)檢測顯示，Sham組注射BMSC-H16189和BMSC-H7656后，BMSCs可擴散到對側(cè)，但MCAO組注射BMSC-H16189、BMSC-H7656后主要集中在損傷一側(cè)(圖6)，說明干細胞具有梗死區(qū)聚集現(xiàn)象，后續(xù)的腦切片紋狀體熒光觀察也證明了這一點。MCAO組BMSC-H16189腦片結(jié)果顯示：3 d后腦損傷紋狀體區(qū)域有大量綠色熒光標記的干細胞(圖7)。

圖像分別來源于4只BMSC-H7656大鼠和4只BMSC-H16189大鼠圖6 熒光成像觀察干細胞腦內(nèi)分布Fig.6 Fluorescent imaging was used to observe the distribution of stem cells in the brain

圖7 MCAO組BMSC-H16189的腦切片熒光標記結(jié)果(×200)Fig.7 Brain section fluorescence results of MBSC-H16189 in MCAO group(×200)

3 討論

腦梗死是臨床上最常見的心腦血管疾病，發(fā)病率和死亡率高。目前，急性腦梗死最有效的治療方法是在代謝半暗帶恢復(fù)血流，靜脈注射組織纖溶酶源激活劑。然而，其狹窄的治療時間窗使得治療對較少患者有效?；诩毎闹委煴徽J為是急性缺血性卒中的潛在治療方法[12]。腦梗死可導(dǎo)致神經(jīng)功能障礙，影響生活質(zhì)量，因此在腦梗死早期提供一種強有力的促進血管生成的治療方法非常必要，血管生成可以改善腦梗死區(qū)域的血流灌注，促進中樞神經(jīng)再生。BMSCs能夠在許多非造血組織中自我更新，并且具有分化為多種組織的多能性。BMSCs能分泌許多生長因子和細胞因子，可以促進各種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的功能恢復(fù)[12]。越來越多研究表明，干細胞療法有望修復(fù)各種原因引起的腦損傷[13-14]。BDNF是主要的神經(jīng)營養(yǎng)因子，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)起著極其重要的作用[15]。采用活體示蹤技術(shù)是干細胞移植治療從基礎(chǔ)走向臨床需要解決的問題，報告基因只有在活細胞中表達后才能在影像上表現(xiàn)出來，故可以反映移植干細胞的運動、存活能力及功能等。我們希望通過基因重組技術(shù)，將細胞治療和基因治療相結(jié)合，將BDNF輸送到腦梗死部位，使BDNF長期穩(wěn)定表達和分泌，增強BMSCs治療效果的同時，采用無創(chuàng)性成像技術(shù)在體內(nèi)對干細胞進行實時檢測。

慢病毒載體是一種高效、低毒且穩(wěn)定的病毒載體系統(tǒng)，是目前基因治療最有效的載體之一。本研究成功構(gòu)建攜帶TYR和BDNF的重組慢病毒載體，轉(zhuǎn)染293T細胞進行慢病毒包裝，以最佳MOI為20的病毒顆粒轉(zhuǎn)染BMSCs，可見細胞呈熒光陽性，RT-PCR和Western blot、ELISA檢測結(jié)果表明，TYR和BDNF基因成功轉(zhuǎn)染至BMSCs中，并可穩(wěn)定表達TYR和BDNF蛋白。Western blot中沒有檢測到BDNF，采用ELISA能檢測到蛋白的表達，分析可能的原因是BDNF為分泌蛋白，蛋白已分泌到細胞外，細胞內(nèi)蛋白量少，運用Western blot法難以檢測到。我們構(gòu)建的慢病毒載體H16189，帶有熒光素酶報告基因，為后續(xù)熒光成像奠定了實驗基礎(chǔ)。

大鼠腦MCAO可以通過顱內(nèi)、動脈內(nèi)和靜脈內(nèi)途徑進行BMSCs移植治療。靜脈或動脈內(nèi)注射途徑在侵襲和安全性方面似乎優(yōu)于顱內(nèi)，但缺血區(qū)的細胞密度低，循環(huán)損失的體積大，注射所需的細胞量也較大。此外，靜脈或動脈內(nèi)注射的途徑可能會因毛細血管微血管血栓形成而增加實驗大鼠的死亡率[12]。因此，為了減少體內(nèi)干細胞數(shù)量的循環(huán)損傷，我們采用了立體定向輔助注射到大腦的代謝半暗帶，注射產(chǎn)生效果所需時間更短，需要的細胞數(shù)量更少。我們構(gòu)建大鼠MCAO模型，腦組織TTC染色顯示模型組大鼠大腦右側(cè)可見白色梗死組織，且模型組神經(jīng)功能缺損評分明顯高于假手術(shù)組，表明模型構(gòu)建成功。將攜帶目的基因的BMSCs原位移植，注入大腦紋狀體內(nèi)，通過PE IVIS Lumina系統(tǒng)檢測顯示Sham組注射BMSCs后，是可以擴散到對側(cè)的，這一結(jié)果表明移植的BMSCs具有遷移能力；但MCAO組注射后干細胞主要集中在損傷一側(cè)，說明移植的干細胞具有梗死區(qū)聚集現(xiàn)象，且可以在缺血區(qū)存活。

綜上所述，我們的重組質(zhì)粒同時具有熒光素酶和TYR兩種報告基因，可以進行光學(xué)及MRI成像，在該研究中我們利用載體中含有的熒光蛋白進行光學(xué)顯像，成功示蹤BMSCs在腦內(nèi)分布情況，同時表明BMSCs可以將重組質(zhì)粒運輸?shù)饺毖Ｋ绤^(qū)。熒光成像敏感度高，但分辨率低，MRI敏感度和分辨率都較高，我們下一步將進行MRI顯像，對干細胞在梗死治療效果方面進行可視化研究。利用TYR基因產(chǎn)生黑色素在MRI T1WI中呈高信號，動態(tài)觀察干細胞的分布及存活情況，并評價治療效果。