李 碩，白金釗，劉閏平

·藥理與臨床?

18β-甘草次酸增強(qiáng)固有免疫細(xì)胞中I型干擾素響應(yīng)進(jìn)而協(xié)同抑制肝癌生長(zhǎng)的機(jī)制研究

李 碩，白金釗#，劉閏平*

北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 100029

在固有免疫細(xì)胞中明確18β-甘草次酸對(duì)I型干擾素通路的激動(dòng)活性，并評(píng)價(jià)其在肝癌模型小鼠中的協(xié)同抑瘤作用。CCK-8法檢測(cè)18β-甘草次酸對(duì)RAW264.7巨噬細(xì)胞增殖的影響；qRT-PCR法檢測(cè)18β-甘草次酸對(duì)免疫細(xì)胞[RAW264.7細(xì)胞、小鼠骨髓來(lái)源巨噬細(xì)胞（bone marrow-derived macrophages，BMDM）、小鼠骨髓來(lái)源樹(shù)突狀細(xì)胞（bone marrow-dendritic cells，BMDC）]中干擾素β1（interferon beta 1，）、干擾素刺激基因15（interferon stimulated gene 15，）和干擾素誘導(dǎo)蛋白1（interferon-induced protein with tetratricopeptide repeats 1，）mRNA表達(dá)的影響；qRT-PCR法檢測(cè)18β-甘草次酸與干擾素α2（interferon alpha 2，IFNα2）聯(lián)用對(duì)免疫細(xì)胞中和mRNA表達(dá)的影響；Western blotting法檢測(cè)18β-甘草次酸對(duì)IFNα2誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞Janus激酶1（Janus kinase 1，JAK1）、酪氨酸激酶2（tyrosine kinase 2，TYK2）、信號(hào)傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子1（signal transducers and activators of transcription 1，STAT1）和STAT2磷酸化水平的影響。C57BL/6小鼠通過(guò)原位移植瘤手術(shù)建立肝癌模型，隨機(jī)分為模型組、奧沙利鉑組和奧沙利鉑＋18β-甘草次酸組，給予奧沙利鉑和18β-甘草次酸治療，評(píng)價(jià)小鼠體質(zhì)量變化、腫瘤質(zhì)量、脾質(zhì)量、肝質(zhì)量和肝臟系數(shù)。18β-甘草次酸顯著升高了、和的mRNA表達(dá)水平（＜0.05、0.01、0.001），協(xié)同增強(qiáng)了IFNα2誘導(dǎo)的和的mRNA表達(dá)（＜0.05、0.01、0.001）；18β-甘草次酸促I(mǎi)型干擾素的活性可能依賴(lài)于其對(duì)IFNα2誘導(dǎo)的下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)關(guān)鍵蛋白JAK1、TYK2、STAT1、STAT2磷酸化的增強(qiáng)作用（＜0.05、0.01、0.001）。18β-甘草次酸與奧沙利鉑聯(lián)用顯著抑制了小鼠肝細(xì)胞癌原位移植瘤的惡性生長(zhǎng)（＜0.01），并改善了奧沙利鉑毒性相關(guān)的體質(zhì)量下降。18β-甘草次酸能夠激活JAK-STAT信號(hào)并誘導(dǎo)I型干擾素下游ISGs的表達(dá)，同時(shí)能與奧沙利鉑協(xié)同抑制肝癌生長(zhǎng)，從而發(fā)揮激活腫瘤免疫的作用。

18β-甘草次酸；I型干擾素；巨噬細(xì)胞；樹(shù)突狀細(xì)胞；肝癌；免疫調(diào)控

中醫(yī)藥的發(fā)展源遠(yuǎn)流長(zhǎng)，歷久彌新。中醫(yī)藥已在非典型性肺炎、新型冠狀病毒肺炎、肺癌、乳腺癌、慢性炎癥等免疫相關(guān)疾病的治療中展現(xiàn)了其特色治療優(yōu)勢(shì)[1-2]。中醫(yī)對(duì)免疫的理解主要體現(xiàn)在“正氣存內(nèi)，邪不可干；邪之所湊，其氣必虛”，所謂扶正，即為提高機(jī)體免疫能力[3]。現(xiàn)代研究顯示，中藥及其活性成分在免疫相關(guān)疾病的治療中具有多層次、多靶點(diǎn)、穩(wěn)定免疫系統(tǒng)、增強(qiáng)細(xì)胞免疫同時(shí)抑制炎癥因子等特點(diǎn)[2]。如人參具有“大補(bǔ)元?dú)狻钡墓π?，其活性成分人參皂苷Rg3通過(guò)下調(diào)細(xì)胞程序性死亡-配體1（programmed cell death 1 ligand 1，PD-L1）恢復(fù)T細(xì)胞對(duì)癌細(xì)胞的細(xì)胞毒性[4]；黃芪具有“補(bǔ)氣升陽(yáng)”之效，黃芪中的黃芪多糖是中國(guó)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部批準(zhǔn)使用的免疫增強(qiáng)劑，能夠調(diào)節(jié)固有免疫和適應(yīng)性免疫系統(tǒng)[5]；甘草具有“補(bǔ)脾益氣、清熱解毒”的功效，多篇研究報(bào)道了甘草及其活性成分能夠通過(guò)調(diào)控核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）通路緩解潰瘍性結(jié)腸炎、肝缺血再灌注損傷、急性腎損傷等疾病[6-8]。

固有免疫是宿主抵御病原微生物的第一道防線，也是人類(lèi)炎癥性疾病的重要調(diào)節(jié)劑[9]。I型干擾素（type I interferons，IFN-I）通過(guò)促進(jìn)抗原呈遞和自然殺傷細(xì)胞功能，同時(shí)抑制炎癥信號(hào)和細(xì)胞因子的產(chǎn)生，在維持固有免疫穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮著重要作用。IFN-I家族由IFN-α、IFN-β、IFN-δ、IFN-ε、IFN-κ、IFN-τ和IFN-ω 7種成員構(gòu)成[10]。IFN-I可以由大多數(shù)細(xì)胞感知病原體后分泌，以巨噬細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞為代表的固有免疫細(xì)胞是其主要來(lái)源[11]。IFN-I以自分泌或旁分泌方式結(jié)合在由干擾素-α/β二聚體受體1（interferon alpha/beta receptor 1，IFNAR1）和IFNAR2亞基構(gòu)成的異質(zhì)二聚體跨膜受體上，隨后激活Janus激酶1（Janus kinase 1，JAK1）和酪氨酸激酶2（tyrosine kinase 2，TYK2），并參與信號(hào)傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子（signal transducer and activator of transcription，STAT）聚集、酪氨酸磷酸化和二聚物形成的過(guò)程。磷酸化的STAT1和STAT2形成二聚物并轉(zhuǎn)移至核內(nèi)，與干擾素調(diào)節(jié)因子9（interferon regulatory factors，IRF9）結(jié)合形成干擾素刺激基因因子3（interferon-stimulated gene factor 3，ISGF3），隨后激活干擾素刺激基因（interferon-stimulated genes，ISGs）的轉(zhuǎn)錄[12]。ISGs可以通過(guò)正負(fù)向調(diào)控的方式平衡IFN-I介導(dǎo)的病原體識(shí)別與非特異性免疫應(yīng)答，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)的ISGs分子有300多種，包括Isg15、干擾素誘導(dǎo)蛋白1（interferon-induced protein with tetratricopeptide repeats 1，Ifit1）、寡腺苷酸合成酶（oligoadenylate synthase，OAS）等[13]。因其特殊活性，近年來(lái)以IFN-α、IFN-β為代表的IFN-I作為一種細(xì)胞因子在臨床中被廣泛研究和使用。多項(xiàng)研究表明，IFN-I在多種實(shí)體腫瘤與血液系統(tǒng)惡性腫瘤中能夠抑制腫瘤生長(zhǎng)，延長(zhǎng)患者生存期。對(duì)其抗腫瘤活性機(jī)制的研究主要涉及激活免疫系統(tǒng)、抑制基因組甲基化、IFN-I通路靶點(diǎn)激活以及IFN-I產(chǎn)物ISGs作用等方面[14-16]。有研究者證明樹(shù)突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞通過(guò)非特異性免疫系統(tǒng)環(huán)鳥(niǎo)苷酸-腺苷酸合成酶（cyclic GMP-AMP synthase，cGAS）-干擾素基因刺激蛋白（stimulator of interferon gene，STING）途徑產(chǎn)生IFN-I[17]，IFN-I能夠直接或間接激活特定的免疫細(xì)胞，發(fā)揮強(qiáng)烈的T細(xì)胞反應(yīng)，發(fā)揮對(duì)腫瘤的識(shí)別與消殺作用[18]。

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，甘草水提物具有顯著的IFN-I激活作用，并初步提示發(fā)揮該作用的單體成分可能是18β-甘草次酸。因此，本研究首先在體外系統(tǒng)探究了18β-甘草次酸對(duì)IFN-I活性的調(diào)控作用及其具體作用靶點(diǎn)，隨后利用小鼠原位肝癌模型闡明其藥理作用，為中藥單體成分在IFN-I相關(guān)疾病的治療提供實(shí)驗(yàn)證據(jù)和數(shù)據(jù)支撐。

1 材料

1.1 細(xì)胞

小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7和小鼠肝癌細(xì)胞Hep1-6購(gòu)自美國(guó)ATCC。

1.2 動(dòng)物

SPF級(jí)C57BL/6雄性小鼠，體質(zhì)量20～25 g，8周齡，由斯貝福（北京）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技有限公司提供，許可證號(hào)SCXK（京）2019-0010。動(dòng)物飼養(yǎng)于符合SPF標(biāo)準(zhǔn)的12 h光暗交替環(huán)境中，自由進(jìn)食飲水。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和研究經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號(hào)BUCM-4-2020083001-3011），并嚴(yán)格按照章程執(zhí)行。

1.3 藥品與試劑

18β-甘草次酸（批號(hào)471-53-4，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）購(gòu)自成都普思生物科技股份有限公司；鼠源重組蛋白IFNα2、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子（granulocyte-macrophage colony-stimulating factor，GM-CSF）、白細(xì)胞介素-4（interleukin-4，IL-4）購(gòu)自蘇州近岸蛋白質(zhì)科技股份有限公司；DMEM培養(yǎng)基、RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)自以色列BI公司；青霉素-鏈霉素（批號(hào)10378016）購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；橄欖油（批號(hào)8001-25-0）購(gòu)自Baker Dream公司；奧沙利鉑（oxaliplatin，OXA，批號(hào)61825-94-3）購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司；CCK-8檢測(cè)試劑盒購(gòu)自新賽美公司；BCA蛋白定量試劑盒購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；RNA提取試劑盒購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司；Western blotting高靈敏度化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京蘭博利德生物技術(shù)有限公司；β-actin抗體（批號(hào)66009-1-lg）、t-JAK1抗體（批號(hào)66466-1-lg）、p-JAK1抗體（批號(hào)AP0530）、t-TYK2抗體（批號(hào)67411-1-lg）、p-TYK2抗體（批號(hào)AP0543）、t-STAT1抗體（批號(hào)A12075）、p-STAT1抗體（批號(hào)AP0453）、t-STAT2（批號(hào)A3588）、p-STAT2抗體（批號(hào)AP0284）購(gòu)自美國(guó)Proteintech公司；HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體、HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG抗體購(gòu)自上海愛(ài)必信生物科技有限公司。

1.4 儀器

HERA cellvios 160i型CO2培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）；CKX53型倒置光學(xué)顯微鏡（日本Olympus公司）；Spectramax i3x型酶標(biāo)儀（美國(guó)Molecular Devices公司）；5424R型冷凍離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司）；Quant StudioTM6 Flex型qRT-PCR儀（美國(guó)ABI公司）；ChemiDocTM MP Imaging System（美國(guó)Bio-Rad公司）。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

RAW264.7細(xì)胞和Hep1-6細(xì)胞用含1%青霉素-鏈霉素、10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)，2～3 d進(jìn)行換液。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80%～85%時(shí)，按1∶3進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

2.2 小鼠骨髓來(lái)源巨噬細(xì)胞（bone marrow-derived macrophages，BMDM）和小鼠骨髓來(lái)源樹(shù)突狀細(xì)胞（bone marrow-dendritic cells，BMDC）的提取與培養(yǎng)

選用8～10周齡雄性C57BL/6小鼠，脫頸處死后，剔除腿部肌肉及骨盆和股骨的剩余軟組織，剪開(kāi)腿骨兩端，12 000×離心2 min，收集小鼠骨髓細(xì)胞。將收集的細(xì)胞培養(yǎng)于含10 %胎牛血清、10% L929細(xì)胞上清的RPMI 1640培養(yǎng)基中，第3、5天換液。培養(yǎng)7 d后，用刮板收集成熟的BMDM。

將小鼠骨髓細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、20 ng/mL GM-CSF、10 ng/mL IL-4的RPMI 1640培養(yǎng)基中，第2、4天半量換液。第6天，收集懸浮及巰松貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞，重新鋪板后培養(yǎng)1～2 d，收集懸浮細(xì)胞即為成熟的BMDC。

2.3 CCK-8法檢測(cè)RAW264.7細(xì)胞增殖

取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的RAW264.7細(xì)胞，以1×104個(gè)/mL接種于96孔板中，每孔100 μL，細(xì)胞貼壁后，分別加入不同濃度的含藥培養(yǎng)基100 μL，使得18β-甘草次酸的最終濃度為1.25、5、20、40、60、80、120、160 μmol/L，每個(gè)濃度均設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，對(duì)照組加入不含藥物的培養(yǎng)基。培養(yǎng)24 h后，棄去培養(yǎng)基，每孔加入100 μL含10% CCK-8溶液的培養(yǎng)基，37 ℃避光孵育1 h，采用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處的吸光度（）值，計(jì)算細(xì)胞存活率。

細(xì)胞存活率＝(給藥－對(duì)照)/對(duì)照

2.4 qRT-PCR檢測(cè)RAW264.7細(xì)胞、BMDM、BMDC中Ifnb1、Isg15和Ifit1 mRNA表達(dá)

RAW264.7細(xì)胞、BMDM和BMDC分別以1×105個(gè)/孔接種于6孔板中，于37 ℃培養(yǎng)箱中孵育過(guò)夜后，更換新鮮培養(yǎng)基孵育1 h，加入不同濃度的藥物，使得18β-甘草次酸的最終濃度為20、40、60 μmol/L；培養(yǎng)1 h后，相應(yīng)的孔中加入IFNα2（50 ng/mL）。繼續(xù)培養(yǎng)8 h后，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)提取細(xì)胞總RNA并合成cDNA，進(jìn)行qRT-PCR分析。引物序列見(jiàn)表1，將次黃嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶1（hypoxanthine phosphoribosyltransferase 1，）為內(nèi)參。

表1 引物序列

Table 1 Primer sequences

基因序列 (5’-3’) Hprt1F: CAGACTTTGTTGGATTTGAAA R: GCTCATCTTAGGCTTTGTAT Ifnb1F: CAGCTCCAAGAAAGGACGAAC R: GGCAGTGTAACTCTTCTGCAT Isg15F: GGTGTCCGTGACTAACTCCAT R: TGGAAAGGGTAAGACCGTCCT Ifit1F: CTGAGATGTCACTTCACATGGAA R: GTGCATCCCCAATGGGTTCT

2.5 Western blotting檢測(cè)RAW264.7細(xì)胞中t-JAK1、p-JAK1、t-TYK2、p-TYK2、t-STAT1、p-STAT1、t-STAT2和p-STAT2蛋白表達(dá)

RAW264.7細(xì)胞以1×105個(gè)/孔接種于6孔板中，于37 ℃培養(yǎng)箱中孵育過(guò)夜后，更換新鮮培養(yǎng)基孵育1 h，加入50 ng/mL的IFNα2培養(yǎng)，分別于0.5、1、2、4、6 h棄去培養(yǎng)基，使用RIPA裂解緩沖液裂解細(xì)胞，提取總蛋白。

RAW264.7細(xì)胞以1×105個(gè)/孔接種于6孔板中，于37 ℃培養(yǎng)箱中孵育過(guò)夜后，更換新鮮培養(yǎng)基孵育1 h，加入不同濃度的藥物使得18β-甘草次酸的最終濃度為20、40、60 μmol/L；培養(yǎng)1 h后，相應(yīng)的孔中加入50 ng/mL的IFNα2。繼續(xù)培養(yǎng)1 h后，棄去培養(yǎng)基，使用RIPA裂解緩沖液裂解細(xì)胞，提取總蛋白。

蛋白與Loading Buffer預(yù)混并加熱變性，蛋白樣品經(jīng)10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜，于脫脂牛奶中封閉，分別加入相應(yīng)抗體，4 ℃孵育過(guò)夜；TBST漂洗后，加入相應(yīng)二抗孵育1 h。使用ChemiDocTM MP Imaging System軟件進(jìn)行成像，使用Quantity One軟件進(jìn)行圖像分析。

2.6 動(dòng)物分組、造模及給藥

18只8周齡雄性C57BL/6小鼠通過(guò)手術(shù)建立肝癌模型。麻醉機(jī)麻醉小鼠并剃去腹部毛發(fā)，用酒精及碘伏棉球?yàn)樘昝课幌?，沿劍突下方約0.5 cm處剪開(kāi)長(zhǎng)度約1.5 cm，用PBS潤(rùn)濕棉簽將肝大葉擠出，使用微量注射器吸取50 μL Hep1-6細(xì)胞懸液（約4×106個(gè)），沿肝臟邊緣注射。將肝大葉擠回原位后，逐層縫合傷口。再次對(duì)傷口消毒以防感染，將手術(shù)后小鼠放入干凈鼠籠中，觀察小鼠狀態(tài)。

手術(shù)后隨機(jī)分為模型組、奧沙利鉑（7.5 mg/kg）組和奧沙利鉑（7.5 mg/kg）＋18β-甘草次酸（100 mg/kg）組，每組6只。手術(shù)5 d后，奧沙利鉑組和奧沙利鉑＋18β-甘草次酸組ip奧利沙鉑，模型組ip葡萄糖生理鹽水，每2天1次，持續(xù)2周。奧沙利鉑＋18β-甘草次酸組于第1次ip奧利沙鉑后1 d開(kāi)始，ig用含5%二甲基亞砜的橄欖油配制的18β-甘草次酸溶液，其他組ig含5%二甲基亞砜的橄欖油，每2天1次，持續(xù)2周（造模及給藥流程見(jiàn)圖1），并記錄小鼠體質(zhì)量變化。末次給藥24 h后，小鼠麻醉處死，取肝脾臟，稱(chēng)定腫瘤、肝臟、脾臟質(zhì)量，計(jì)算肝臟指數(shù)。

圖1 造模及給藥流程

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 9.0軟件進(jìn)行分析，結(jié)果以表示，多組間比較采用One-way ANOVA分析。

3 結(jié)果

3.1 18β-甘草次酸對(duì)RAW264.7細(xì)胞增殖的影響

RAW264.7細(xì)胞是藥物體外評(píng)價(jià)的常用細(xì)胞系。如圖1所示，18β-甘草次酸濃度在75.33 μmol/L時(shí)RAW264.7細(xì)胞存活率下降至50%。因此，選擇無(wú)明顯細(xì)胞毒性的20、40和60 μmol/L分別作為低、中、高劑量進(jìn)行后續(xù)研究。

圖1 18β-甘草次酸對(duì)RAW264.7細(xì)胞增殖的影響

3.2 18β-甘草次酸促進(jìn)IFN-I響應(yīng)

首先在RAW264.7細(xì)胞中評(píng)價(jià)了單獨(dú)給予高、中、低3個(gè)劑量的18β-甘草次酸對(duì)IFN-I響應(yīng)的作用。如圖2-A所示，在RAW264.7細(xì)胞中，與對(duì)照組相比，18β-甘草次酸中、高劑量組、和mRNA表達(dá)水平均顯著升高（＜0.01、0.001），其中高劑量組更為明顯，呈劑量相關(guān)性。巨噬細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞均為IFN-I的主要來(lái)源，而RAW264.7細(xì)胞并無(wú)明顯的分化傾向，無(wú)法針對(duì)性評(píng)價(jià)18β-甘草次酸調(diào)節(jié)IFN-I響應(yīng)的主要靶細(xì)胞。因此，從小鼠腿骨中提取并培養(yǎng)原代BMDM與BMDC，考查18β-甘草次酸對(duì)2種免疫細(xì)胞中IFN-I的特異性作用。如圖2-B所示，在BMDM中，18β-甘草次酸各劑量組和mRNA表達(dá)水平均顯著升高（＜0.05、0.01、0.001），18β-甘草次酸低、中劑量組mRNA表達(dá)水平顯著升高（＜0.05、0.01），其中低劑量組效果最佳，以上作用并沒(méi)有顯著的劑量相關(guān)性，可能與高劑量下BMDM對(duì)18β-甘草次酸耐受較差，存在一定細(xì)胞毒性相關(guān)。如圖2-C所示，在BMDC中，18β-甘草次酸低、高劑量組mRNA表達(dá)水平顯著升高（＜0.01、0.001），而和mRNA表達(dá)水平均無(wú)明顯變化。表明與樹(shù)突狀細(xì)胞相比，18β-甘草次酸在巨噬細(xì)胞中具有更強(qiáng)的IFN-I激活作用。

C-對(duì)照組 18β-Ga-18β-甘草次酸，下同 與對(duì)照組比較：*P＜0.05 **P＜0.01 ***P＜0.001

3.3 18β-甘草次酸促進(jìn)IFNα2誘導(dǎo)的下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和ISGs表達(dá)

IFN-α是IFN-I的多效性細(xì)胞因子，目前已用于肝炎病毒、流感病毒等多種病毒感染性疾病及淋巴癌、黑色素瘤等多種癌癥的臨床治療[19]。然而，治療所需劑量大導(dǎo)致了明顯的不良反應(yīng)，嚴(yán)重限制了其在臨床的廣泛應(yīng)用[20]。與低毒性、可以增敏IFN-I活性的天然產(chǎn)物的聯(lián)用將有望降低IFN-α的使用劑量，從而提高其臨床順應(yīng)性。因此，接下來(lái)探究了18β-甘草次酸與IFNα2合用對(duì)3種免疫細(xì)胞的影響。如圖3-A所示，在RAW264.7細(xì)胞中，IFNα2增強(qiáng)了IFN-I誘導(dǎo)基因和的mRNA表達(dá)，與不同劑量的18β-甘草次酸合用后總體呈劑量相關(guān)性的增強(qiáng)：與對(duì)照組相比，高劑量的18β-甘草次酸與IFNα2合用后mRNA表達(dá)水平顯著升高（＜0.001），中、高劑量的18β-甘草次酸與IFNα2合用后mRNA表達(dá)水平顯著升高（＜0.01）。如圖3-B所示，在BMDM中，IFNα2誘導(dǎo)了IFN-I下游和的mRNA表達(dá)水平（＜0.01、0.001）；當(dāng)與不同劑量的18β-甘草次酸合用后，與對(duì)照組相比，mRNA表達(dá)水平均顯著升高（＜0.05、0.01）；中、高劑量的18β-甘草次酸與IFNα2合用后mRNA表達(dá)水平顯著升高（＜0.05、0.01）。如圖3-C所示，在BMDC中，IFNα2顯著增加了和的mRNA表達(dá)（＜0.01、0.001）；與對(duì)照組相比，各劑量的18β-甘草次酸與IFNα2合用后mRNA表達(dá)水平均顯著升高（＜0.05、0.01）；低、中劑量的18β-甘草次酸與IFNα2合用后的mRNA表達(dá)水平顯著升高（＜0.05、0.01）。18β-甘草次酸與IFNα2協(xié)同作用在BMDM和BMDC中均無(wú)顯著的劑量相關(guān)性。上述結(jié)果表明，18β-甘草次酸與IFNα2合用能夠增強(qiáng)其激活下游IFN-I誘導(dǎo)基因的作用。由于在RAW264.7細(xì)胞中18β-甘草次酸與IFNα2合用作用最強(qiáng)，且呈良好的劑量相關(guān)性，后續(xù)實(shí)驗(yàn)將選擇RAW264.7細(xì)胞作為細(xì)胞模型探究其作用機(jī)制。

圖3 18β-甘草次酸與IFNα2合用對(duì)RAW264.7細(xì)胞、BMDM和BMDC中Isg15和Ifit1 mRNA表達(dá)的影響

3.4 18β-甘草次酸促進(jìn)JAK1、TYK2與STATs依賴(lài)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)

為了確定18β-甘草次酸與IFNα2協(xié)同作用的具體分子靶點(diǎn)，首先探究了IFNα2在RAW264.7細(xì)胞中激活下游事件的最佳時(shí)間，分別考察了在給予IFNα2后0.5、1、2、4、6 h時(shí)，IFN-I下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)關(guān)鍵蛋白JAK1、TYK2與STATs的磷酸化水平。如圖4-A所示，t-JAK1在給予IFNα2后降低，而p-JAK1隨時(shí)間持續(xù)增加。與對(duì)照組相比，JAK1磷酸化水平隨作用時(shí)間而升高，在1 h時(shí)具有顯著性差異（＜0.01），并在6 h達(dá)到最高點(diǎn)（＜0.001）。IFNα2對(duì)t-TYK2無(wú)明顯影響，但顯著升高了p-TYK2的水平，在1 h時(shí)作用最強(qiáng)（＜0.001）。t-STAT1、p-STAT1、t-STAT2、p-STAT2均在1 h時(shí)達(dá)到峰值，隨后降低。IFNα2刺激細(xì)胞1 h后，與對(duì)照組相比，STAT1和STAT2的磷酸化水平均顯著升高（＜0.001）。綜合考慮上述結(jié)果，選擇1 h作為IFNα2的誘導(dǎo)時(shí)間。

接下來(lái)考察了IFNα2聯(lián)合不同劑量18β-甘草次酸對(duì)JAK1、TYK2與STATs磷酸化的影響。如圖4-B所示，IFNα2刺激1 h后，IFNα2增加了JAK1、TYK2、STAT1、STAT2的磷酸化水平（＜0.05、0.001）。與IFNα2相比，低劑量的18β-甘草次酸降低了t-JAK1的水平，低、中劑量的18β-甘草次酸顯著增強(qiáng)了JAK1磷酸化水平（＜0.05、0.001）。不同劑量的18β-甘草次酸均增加了t-TYK2水平，中、高劑量的18β-甘草次酸顯著增強(qiáng)了TYK2的磷酸化水平（＜0.05、0.001）。低劑量18β-甘草次酸增加了t-STAT1、t-STAT2的水平，而中、高劑量18β-甘草次酸降低了t-STAT1、t-STAT2的水平，中、高劑量的18β-甘草次酸顯著升高了STAT1和STAT2的磷酸化水平（＜0.01、0.001）。提示18β-甘草次酸增強(qiáng)了IFNα2誘導(dǎo)的JAK1、TYK2與STATs的激活，促進(jìn)了IFN-I下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，是18β-甘草次酸協(xié)同增強(qiáng)IFN-I響應(yīng)的內(nèi)在機(jī)制。

A-IFNα2刺激RAW264.7細(xì)胞0.5～6 h，t-JAK1、p-JAK1、t-TYK2、p-TYK2、STATs和p-STATs蛋白表達(dá)；B-18β-甘草次酸與IFNα2合用后，t-JAK1、p-JAK1、TYK2、p-TYK2、STATs和p-STATs蛋白表達(dá)

3.5 18β-甘草次酸對(duì)小鼠肝細(xì)胞癌原位移植瘤生長(zhǎng)的影響

如圖5-A、B所示，與模型組相比，單用奧沙利鉑改善了肝癌模型小鼠的體質(zhì)量下降，減小了腫瘤體積；如圖5-C所示，單用奧沙利鉑組腫瘤質(zhì)量降低為模型組的1/3（＜0.05），在一定程度上增加了脾臟質(zhì)量，并降低了肝質(zhì)量及肝臟指數(shù)（＜0.05）。18β-甘草次酸與奧沙利鉑合用后進(jìn)一步改善了小鼠的體質(zhì)量下降；且腫瘤質(zhì)量?jī)H為奧沙利鉑組的一半（＜0.01），肝質(zhì)量及肝臟指數(shù)結(jié)果也明顯優(yōu)于奧沙利鉑組（＜0.05、0.01）。此外，協(xié)同給藥后脾質(zhì)量有明顯升高（＜0.05），提示18β-甘草次酸可能增強(qiáng)了機(jī)體的免疫反應(yīng)。因此，18β-甘草次酸可能通過(guò)增強(qiáng)腫瘤免疫反應(yīng)，協(xié)同奧沙利鉑的抗腫瘤活性，抑制小鼠原位肝細(xì)胞癌的生長(zhǎng)。

O-奧沙利鉑組 與模型組比較：#P＜0.05；與奧沙利鉑組比較：*P＜0.05 **P＜0.01

4 討論

甘草是我國(guó)傳統(tǒng)中藥，有“國(guó)老”之稱(chēng)[21]，其主要活性成分18β-甘草次酸已被證明具有抗感染、消炎[22-23]、保肝[24]、抗腫瘤[25]等多種功效。目前對(duì)18β-甘草次酸的藥理作用機(jī)制的研究主要集中于Toll樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）/NF-κB、磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K）-蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）、mTOR/STAT3等經(jīng)典炎癥通路[26]。IFN-I被認(rèn)為是慢性炎癥性疾病的樞紐，然而，目前18β-甘草次酸對(duì)IFN-I的作用尚不明確。本研究中，18β-甘草次酸單獨(dú)使用或與IFNα2合用均能夠增強(qiáng)固有免疫細(xì)胞中IFN-I誘導(dǎo)基因的表達(dá)，且在合用時(shí)作用更強(qiáng)。這一發(fā)現(xiàn)不僅確定了18β-甘草次酸是一種潛在的IFN-I天然激動(dòng)劑，而且為18β-甘草次酸治療免疫低下相關(guān)疾病的作用機(jī)制提供了新的思路。

當(dāng)前研究認(rèn)為，18β-甘草次酸通過(guò)加重細(xì)胞DNA損傷、激活p53促凋亡通路、增加活性氧的形成等途徑誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡[27-28]。已有研究證明，固有免疫系統(tǒng)識(shí)別腫瘤細(xì)胞并激活適應(yīng)性免疫系統(tǒng)發(fā)揮消殺作用依賴(lài)于IFN-I信號(hào)的激活[29]。鑒于體外實(shí)驗(yàn)中18β-甘草次酸對(duì)IFN-I的免疫調(diào)節(jié)作用及IFN-I的腫瘤免疫調(diào)節(jié)作用，推測(cè)增強(qiáng)IFN-I響應(yīng)、逆轉(zhuǎn)免疫抑制性腫瘤微環(huán)境可能是其抗腫瘤的新機(jī)制。因此，基于18β-甘草次酸在IFN-I介導(dǎo)的免疫應(yīng)答中的作用，構(gòu)建小鼠肝癌模型來(lái)評(píng)價(jià)其潛在腫瘤免疫藥理作用?；瘜W(xué)誘導(dǎo)肝癌模型和移植肝癌模型是目前最為常用的小鼠肝癌模型，然而，化學(xué)誘導(dǎo)法的誘癌時(shí)間較長(zhǎng)，一般為24～48周[30]；人源腫瘤異種移植操作較為復(fù)雜且成本高，且因?yàn)槿狈ν暾拿庖吖δ芏贿m用于腫瘤免疫療法研究[31]。因此，本研究通過(guò)將鼠源肝癌細(xì)胞系Hep1-6細(xì)胞的細(xì)胞懸液直接注射到小鼠肝大葉建立同種原位移植瘤模型，該模型具有成本相對(duì)較低、成活率高、成瘤速度快、具有完整的免疫微環(huán)境和肝微循環(huán)環(huán)境等優(yōu)點(diǎn)。通過(guò)與一線化療藥物奧沙利鉑合用，18β-甘草次酸顯著抑制了原位肝癌的惡性生長(zhǎng)，并改善了奧沙利鉑毒性相關(guān)的體質(zhì)量下降。一方面，18β-甘草次酸與奧沙利鉑聯(lián)用后可能通過(guò)增強(qiáng)IFN-I介導(dǎo)的抗腫瘤免疫提高化療藥物對(duì)癌細(xì)胞的化學(xué)敏感性；另一方面，奧沙利鉑是一類(lèi)免疫治療藥物，通過(guò)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生免疫原性細(xì)胞死亡，在細(xì)胞表面產(chǎn)生一種“吃我”的信號(hào)分子，使得腫瘤細(xì)胞更容易被固有免疫細(xì)胞識(shí)別并吞噬[32-33]，18β-甘草次酸增強(qiáng)IFN-I介導(dǎo)的固有免疫的作用有助于奧沙利鉑誘導(dǎo)抗腫瘤免疫應(yīng)答。盡管奧沙利鉑已廣泛用于直腸癌、肺癌、肝癌等惡性腫瘤的治療，但是還存在一些不良反應(yīng)，單獨(dú)給藥存在著患者響應(yīng)率低、可能引起細(xì)胞因子風(fēng)暴等隱患，與其他小分子化療藥的聯(lián)用也產(chǎn)生了患者依從性差、失敗率高等問(wèn)題[29]。本研究提示，與18β-甘草次酸的聯(lián)合用藥有望改善奧沙利鉑的不良反應(yīng)，還為IFN-I的天然小分子激動(dòng)劑與化療藥物聯(lián)用在抗腫瘤中的作用機(jī)制提供了新的思路。

綜上所述，本研究證明了18β-甘草次酸能夠顯著激活JAK-STAT信號(hào)并誘導(dǎo)IFN-I下游ISGs的表達(dá)，同時(shí)闡明了18β-甘草次酸與奧沙利鉑協(xié)同激活腫瘤免疫從而抑制肝癌生長(zhǎng)的作用。這些發(fā)現(xiàn)不僅為全面理解18β-甘草次酸的免疫調(diào)節(jié)作用提供了新的見(jiàn)解，并且為18β-甘草次酸與具有腫瘤細(xì)胞免疫原性的化療藥物聯(lián)用的抗腫瘤新策略研究提供了實(shí)驗(yàn)證據(jù)和新的思路。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

[1] 林躍家, 秦鑒. 中藥對(duì)新型冠狀病毒疾病防治及相關(guān)藥物研發(fā)的啟示 [J]. 中國(guó)中醫(yī)藥現(xiàn)代遠(yuǎn)程教育, 2022, 20(9): 205-208.

[2] 楊菊, 范治國(guó). 中藥對(duì)機(jī)體免疫功能的調(diào)節(jié)作用 [J]. 中國(guó)藥業(yè), 2021, 30(22): 125-127.

[3] 徐曉楠, 方鈺發(fā), 王妍. 中醫(yī)陰陽(yáng)與免疫的關(guān)系初探 [J]. 四川中醫(yī), 2019, 37(2): 25-27.

[4] 鄭厚勝, 鄭斯文, 王英平, 等. 人參皂苷Rg3對(duì)環(huán)磷酰胺致免疫功能低下小鼠的免疫調(diào)節(jié)作用 [J]. 中成藥, 2021, 43(11): 3202-3206.

[5] 秦書(shū)敏, 林靜瑜, 黃可兒. 黃芪的免疫調(diào)節(jié)作用研究概述 [J]. 中華中醫(yī)藥學(xué)刊, 2017, 35(3): 699-702.

[6] 禹鐵牛. 異甘草素預(yù)處理對(duì)大鼠肝缺血再灌注損傷炎癥反應(yīng)及TLR4/NF-κB通路的影響 [D]. 衡陽(yáng): 南華大學(xué), 2021.

[7] 陳儀.甘草瀉心湯對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎大鼠TLR4/MyD88/NF-κB炎癥信號(hào)通路的調(diào)控作用研究 [D]. 福州: 福建中醫(yī)藥大學(xué), 2021.

[8] 文丹, 廖媛, 李健春, 等. 異甘草素通過(guò)Smad3/Arid2-IR/NF-κB軸改善順鉑誘導(dǎo)的急性腎損傷小鼠炎癥反應(yīng) [J]. 中國(guó)比較醫(yī)學(xué)雜志, 2020, 30(6): 25-30.

[9] Turvey S E, Broide D H. Innate immunity [J]., 2010, 125(2): S24-S32.

[10] Pestka S, Krause C D, Walter M R. Interferons, interferon-like cytokines, and their receptors [J]., 2004, 202: 8-32.

[11] Taki S. Type I interferons and autoimmunity: Lessons from the clinic and from IRF-2-deficient mice [J]., 2002, 13(4/5): 379-391.

[12] Jiang J, Zhao M, Chang C,. Type I interferons in the pathogenesis and treatment of autoimmune diseases [J]., 2020, 59(2): 248-272.

[13] Ivashkiv L B, Donlin L T. Regulation of type I interferon responses [J]., 2014, 14(1): 36-49.

[14] Borden E C. Interferons α and β in cancer: Therapeutic opportunities from new insights [J]., 2019, 18(3): 219-234.

[15] Bracci L, Proietti E, Belardelli F. IFN-alpha and novel strategies of combination therapy for cancer [J]., 2007, 1112: 256-268.

[16] Tagliaferri P, Caraglia M, Budillon A,. New pharmacokinetic and pharmacodynamic tools for interferon-alpha (IFN-alpha) treatment of human cancer [J]., 2005, 54(1): 1-10.

[17] Woo S R, Fuertes M B, Corrales L,. STING-dependent cytosolic DNA sensing mediates innate immune recognition of immunogenic tumors [J]., 2014, 41(5): 830-842.

[18] Duong E, Fessenden T B, Lutz E,. Type I interferon activates MHC class I-dressed CD11b+conventional dendritic cells to promote protective anti-tumor CD8+T cell immunity [J]., 2022, 55(2): 308-323.

[19] Borden E C. Interferons α and β in cancer: Therapeutic opportunities from new insights [J]., 2019, 18(3): 219-234.

[20] Ferrantini M, Capone I, Belardelli F. Interferon-alpha and cancer: Mechanisms of action and new perspectives of clinical use [J]., 2007, 89(6/7): 884-893.

[21] 羅子宸, 張?chǎng)? 楊瑞, 等. 甘草“調(diào)和諸藥”生物藥劑學(xué)機(jī)制的研究進(jìn)展[J]. 中草藥, 2021, 52(1): 267-277.

[22] Quan W Y, Kong S Z, Ouyang Q Q,. Use of 18β-glycyrrhetinic acid nanocrystals to enhance anti-inflammatory activity by improving topical delivery [J]., 2021, 205: 111791.

[23] Chen B D, Zhu D C, Xie C L,. 18β-Glycyrrhetinic acid inhibits IL-1β-induced inflammatory response in mouse chondrocytes and prevents osteoarthritic progression by activating Nrf2 [J]., 2021, 12(18): 8399-8410.

[24] Wu S Y, Wang W J, Dou J H,. Research progress on the protective effects of licorice-derived 18β-glycyrrhetinic acid against liver injury [J]., 2021, 42(1): 18-26.

[25] Cai Y E, Xu Y Q, Chan H F,. Glycyrrhetinic acid mediated drug delivery carriers for hepatocellular carcinoma therapy [J]., 2016, 13(3): 699-709.

[26] 徐宛婷. 18β-甘草次酸抗肺癌活性及其相關(guān)機(jī)制的研究 [D]. 大慶: 黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué), 2021.

[27] 趙冬, 劉秋夢(mèng), 梁慧芳, 等. 18β-甘草次酸通過(guò)抑制信號(hào)傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3的激活能夠增強(qiáng)人肝癌細(xì)胞對(duì)索拉非尼的敏感性 [J]. 中華實(shí)驗(yàn)外科雜志, 2018, 35(8): 1445-1447.

[28] 李?yuàn)檴? 18β-甘草次酸誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡的機(jī)制探討 [D]. 廣州: 廣州中醫(yī)藥大學(xué), 2016.

[29] Gajewski T F, Corrales L. New perspectives on type I IFNs in cancer [J]., 2015, 26(2): 175-178.

[30] 單鵬, 寧厚法. 小鼠原發(fā)性肝癌模型的研究進(jìn)展 [J]. 醫(yī)學(xué)綜述, 2018, 24(20): 4010-4015.

[31] 蔣林含, 譚曉霞, 李俊, 等. 肝癌人源腫瘤異種移植模型的應(yīng)用研究進(jìn)展 [J]. 解放軍醫(yī)學(xué)雜志, 2021, 46(10): 1029-1033.

[32] 馮兵. 基于奧沙利鉑前藥的納米載藥系統(tǒng)增強(qiáng)腫瘤化療—免疫治療效果的研究[D]. 上海: 中國(guó)科學(xué)院大學(xué)(中國(guó)科學(xué)院上海藥物研究所), 2019.

[33] Ahmad S. Platinum-DNA interactions and subsequent cellular processes controlling sensitivity to anticancer platinum complexes [J]., 2010, 7(3): 543-66.

18β-Glycyrrhetinic acid enhances response of type I interferon in innate immune cells and inhibits hepatocellular carcinoma growth

LI Shuo, BAI Jin-zhao, LIU Run-ping

School of Chinese Materia Medica, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100029, China

To identify the regulative effects of 18β-glycyrrhetinic acid (18β-Ga) on type I interferon (IFN-I) responses in innate immune cells, and evaluate its antitumor effects in hepatocellular carcinoma (HCC) model mice.CCK-8 assay was performed to detect the effect of 18β-Ga on proliferation of RAW264.7 cells. qRT-PCR was used to detect the effect of 18β-glycyrrhetinic acid on interferon beta 1 (), interferon stimulated gene 15 () and interferon-induced protein 1 () mRNA expressions in immune cells [RAW264.7 cells, mouse bone marrow-derived macrophages (BMDM), mouse bone marrow-derived dendritic cells (BMDC)]. qRT-PCR analysis was used to detect the mRNA levels ofandupon 18β-Ga and IFNα2 administration in immune cells. The phosphorylation levels of Janus kinase 1 (JAK1), tyrosine kinase 2 (TYK2), signal transducers and activators of transcription 1 (STAT1) and STAT2 were detected by western blotting. Hepatocellular carcinoma model was established by orthotopic tumor transplantation, and model mice were randomly divided into model group, oxaliplatin group, oxaliplatin + 18β-Ga group. Mice were treated with oxaliplatin and 18β-Ga after modeling. Body weight, tumor weight, spleen weight, liver weight and liver coefficient were evaluated.18β-Ga significantly increased the mRNA levels of,andexpression (< 0.05, 0.01, 0.001) and facilidated IFNα2-inducedandexpressions (< 0.05, 0.01, 0.001). IFN-I-promoting activity of 18β-Ga may depend on the enhancement of JAK1, TYK, STAT1, and STAT2 phosphorylation (< 0.05, 0.01, 0.001). The combination of 18β-Ga and oxaliplatin significantly inhibited the tumor growth of hepatocellular carcinoma orthotopic xenograft tumors in mice (< 0.01), and improved the weight loss associated with oxaliplatin toxicity.18β-Ga has significant stimulatory effects on immune response by enhancing JAK-STAT signaling and inducing the ISGs expression in response to IFN-I. Meanwhile, 18β-Ga can synergistically inhibit the growth of liver cancer with oxaliplatin, thereby activating tumor immunity.

18β-glycyrrhetinic acid; type I interferon; macrophage; dendritic cell; hepatocellular carcinoma; immunoregulation

R285.5

A

0253 - 2670(2022)16 - 5034 - 10

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.16.013

2022-05-25

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（82004029）；北京市科技新星項(xiàng)目（Z201100006820025，Z211100002121167）；中華中醫(yī)藥學(xué)會(huì)青年人才托舉工程（CACM-2020-QNRC2-04）

李 碩，碩士研究生，研究方向?yàn)樘烊划a(chǎn)物的免疫活性。E-mail: ls18845611672@163.com

劉閏平，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)橄到y(tǒng)疾病機(jī)制和潛在治療靶點(diǎn)的轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究。E-mail: liurunping@bucm.edu.cn

#共同第一作者：白金釗，碩士研究生，研究方向?yàn)橹兴幭幚怼-mail:baijz@foxmail.com

[責(zé)任編輯 李亞楠]