曹彬彬蔡 瑤王寶珠饒 喻王 超茍克勉王 濤?

(1.揚州大學獸醫(yī)學院,江蘇 揚州 225009;2.江蘇高校動物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心,江蘇 揚州 225009)

生殖能力下降是人和動物共同面臨的健康問題,不僅對畜牧業(yè)造成經濟損失,而且對人類健康構成嚴重威脅。 因此,尋找動物生殖過程中關鍵的調控基因,探討其生殖發(fā)生過程中的調控機制成為該領域內關注的焦點之一。 在過去的半個多世紀里,許多在動物生殖過程中發(fā)揮重要作用的精子因子相繼被發(fā)現(xiàn),在動物發(fā)生受精時,精子中的某些因子會通過融合孔進入卵母細胞胞質中,啟動卵母細胞內鈣離子釋放系統(tǒng),從而激活卵母細胞[1]。 研究發(fā)現(xiàn),哺乳動物受精的特征是在精子-卵子融合后,卵子內持續(xù)2~4 h 不同程度的Ca2+振蕩[2],該過程是恢復第一次減數(shù)分裂和胚胎發(fā)育的前提,同時還阻止多精入卵的發(fā)生[3]。

磷脂酶C zeta(PLCζ)是Saunders 等[4]在研究小鼠睪丸中PLC 時發(fā)現(xiàn)的新亞型,隨后證實PLCζ不僅存在于睪丸中,并且擁有其他亞型中的基本結構域。 該蛋白結構域由4 個位于N 端的EF 手型結構域、位于中心的特征性X 和Y 催化域以及碳基端的C2 結構域構成[5]。 其中EF 手型區(qū)域對低濃度Ca2+敏感,使PLCζ 在靜息狀態(tài)的Ca2+水平具有活性。 通過C2 結構域與PI(3)P、PI(5)P 或一種未知的膜蛋白相互作用可能實現(xiàn)PLCζ 與特定囊泡膜的結合[6],帶正電的XY 連接區(qū)與第一個EF 手型結構域相互作用,催化XY 結構域進行PIP2的酶促水解,生成三磷酸肌醇(IP3)[7],促進內質網中Ca2+的釋放, 進而誘導細胞內 Ca2+振蕩的發(fā)生[8]。Saunders 等[4]將PLCζ 功能受到抑制的精子注入卵母細胞中,發(fā)現(xiàn)Ca2+的振蕩不明顯,而將完整的PLCζ cRNA 注入小鼠卵母細胞后產生了與正常體外受精相類似的Ca2+振蕩現(xiàn)象,表明PLCζ 介導的Ca2+振蕩在體外受精過程中發(fā)揮重要作用。 研究顯示,在牛[9]、雞[10]和豬[11]等家畜中已經發(fā)現(xiàn)PLCζ基因。

體外授精實驗結果表明,Plcz1基因缺陷的精子會導致小鼠受精失敗,進而導致不育,最近研究發(fā)現(xiàn),在缺失PLCζ 蛋白的情況下,自然交配的小鼠也會導致體內受精產生后代,但產仔數(shù)明顯下降[12]。因此,自然受精的情況下Plcz1基因缺陷雄鼠是否具有生育能力尚未完全闡明。 本研究利用CRISPR/Cas9 技術構建Plcz1-/-小鼠模型,并對Plcz1-/-小鼠進行擴繁和基因型鑒定,探討Plcz1基因在雄性小鼠生育過程中的作用,為解決Plcz1基因突變帶來的生殖能力障礙提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SPF 級C57BL/6 雄鼠6 只,8~12 周齡,體重23~28 g;SPF 級C57BL/6 雌鼠12 只,4~8 周齡,體重14~22 g;SPF 級ICR 雄鼠3 只,10 周齡,體重32~37 g;SPF 級ICR 雌鼠3 只,10 周齡,體重30~35 g,均購自揚州大學比較醫(yī)學中心[SCXK(蘇)2017-0007],實驗操作在揚州大學獸醫(yī)學院獸醫(yī)大樓的實驗室進行[SYXK(蘇)2017-0044]。 實驗小鼠均飼養(yǎng)于揚州大學比較醫(yī)學中心的SPF 級動物房,光照周期采用5:00 am~7:00 pm,環(huán)境溫度控制在20℃~25℃,自由飲水、進食,每周更換1 次墊料。

動物實驗倫理審核由揚州大學審批(NSFC2020-SYXY-20),并按照實驗動物使用的3R 原則給予人道的關懷。

1.2 主要試劑與儀器

pX330A-1x2、pX330S-2 載體購自Addgene;限制性內切酶BpiⅠ(批號:10020723)、T4 DNA 連接酶(批號:10037474)及限制性內切酶Eco31I(批號:0431712)購自New England Biolabs 公司;2×Es Taq MasterMix(Dye)(批號:01031/50351)、DH5α 感受態(tài)細胞(批號:50525)及高純度質粒小提試劑盒(批號:50433)購自康為世紀生物科技股份有限公司;EndoFree Plasmid Maxi Kit(批號:163013537)購自QIAGEN;普通瓊脂糖(批號:EZ6688C178)購自賽國生物科技有限公司;純化試劑盒(批號:123722)購自 MP Biomedicals; DL2000 marker ( 批 號:AKF0781A)購自TaKaRa Bio;Spe 抗生素(批號:EB15BA0006)購自生工生物工程(上海)股份有限公司。

T100 Thermal Cycler PCR 儀購自美國Bio-Rad公司;ABI PCR 儀miniAmp 及ABI 經典型PCR 儀2720 購自美國Thermo Fisher 公司;天能1600 型凝膠成像+電腦、HE-90 電泳槽購自上海天能生物科技有限公司;恒溫水浴鍋購自寧波新芝生物科技有限公司;臺式冷凍離心機5424R、臺式離心機5424、微型離心機MiniSpin 購自德國Eppendorf 公司;ZHTY-50 N 恒溫振蕩培養(yǎng)箱購自上海知楚儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 設計sgRNA 及sgRNA 雙鏈合成

從NCBI(https:/ /www.ncbi.nlm.nih.gov/)上查詢到C57BL/6 小鼠的Plcz1基因的序列(NM_054066.4),由于第一個外顯子不存在氨基酸,因此本試驗從第二個外顯子開始統(tǒng)計外顯子數(shù)量并標記的。 通過張峰sgRNA 設計的網站(http:/ /crispr.mit.edu/)在第6、7 外顯子上選擇sgRNA 靶點序列,選擇出得分較高的2 條sgRNA,并在其兩端添加限制性內切酶BpiⅠ酶切位點,由擎科有限公司合成(如表1 所示)。 其中,如圖1 所示的基因敲除示意圖,Plcz1-sgRNA6 位于Plcz1基因第6 外顯子,Plcz1-sgRNA7 位于Plcz1基因第7 外顯子。

表1 Plcz1 基因sgRNA 寡核苷酸鏈Table 1 SgRNA oligonucleotide chain of Plcz1 gene

將合成的上游引物和下游引物各8 μL、Taq DNA Polymerase Buffer 4 μL 在PCR 管中混合,進行PCR 退火反應:99℃ 10 min,16℃ 10 min。

1.3.2 pX330-sgRNA 重組載體的構建

將退火的寡核苷酸分別插入pX330A 和pX330S 載體,反應體系共2 μL:25 ng/μL pX330A/S 載體0.3 μL,10 μmol/L 退火的寡核苷酸0.5 μL,10×T4 DNA 連接酶緩沖液0.2 μL,BpiI 0.1 μL,T4 DNA 連接酶0.1 μL,無菌蒸餾水0.8 μL。 進行PCR 擴增反應:37℃ 5 min,16℃ 10 min 進行3 個循環(huán),循環(huán)反應后,在37℃下進行額外的BpiI 酶消化1 h, 即得到連接產物 pX330A-1x2-sgRNA6 與pX330S-2-sgRNA7,用于后續(xù)步驟。

1.3.3 連接產物轉化感受態(tài)細胞

取冷凍的感受態(tài)細胞置于冰浴中,待感受態(tài)細胞在冰上融化后,在超凈臺中向感受態(tài)細胞懸液中加入連接產物,用移液器輕輕吹打混勻,置于冰上30 min。 42℃熱擊90 s,迅速將離心管轉移到冰浴中,冰上靜置2 min。 在超凈臺里向每個離心管中加入700 μL 無菌的LB 培養(yǎng)基,不含抗生素,混勻后置于37℃搖床,220 r/min 振蕩培養(yǎng)1 h 使菌體復蘇。 在超凈臺中取50 μL 已轉化的感受態(tài)細胞,加到含Amp 或者Spe 抗生素的LB 固體瓊脂培養(yǎng)基上,用無菌的涂布棒將菌液均勻涂開,直至干燥,倒置平板,37℃ 12~16 h 培養(yǎng)。

1.3.4 質粒的提取與鑒定

用滅菌過后的槍頭挑取上述培養(yǎng)出的單菌落,接種于5 mL Amp 或Spe 抗生素的LB 液體瓊脂培養(yǎng)基置于37℃搖床,220 r/min 振蕩培養(yǎng)10~12 h。在超凈臺中保菌,余下菌液用質粒小提試劑盒提取質粒,取過夜培養(yǎng)的菌液加入離心管(自備)中,13000 r/min 離心30 s 收集菌體沉淀,盡量吸棄上清。 向留有菌體沉淀的離心管中加入250 μL 含RNase A 的Buffer P1,使用渦旋振蕩器充分混勻,懸浮菌體沉淀。 加入250 μL Buffer P2,輕輕地上下顛倒混勻6 次,充分混勻使菌體裂解,此時溶液應變得清亮粘稠。 加入350 μL Buffer N3,立即輕柔地上下顛倒混勻10 次,充分混勻,此時應出現(xiàn)白色絮狀沉淀。 13000 r/min 離心5 min。 將所得的上清液轉移到已裝入收集管的吸附柱(Spin Columns DM)中,13000 r/min 離心30 s,倒掉收集管中的廢液,將吸附柱重新放回收集管中。 向吸附柱中加入150 μL Buffer PB,13000 r/min 離心30 s。 向吸附柱中加入400 μL Buffer PW,13000 r/min 離心1 min,倒掉收集管中的廢液。 將吸附柱置于1 個新的離心管中,向吸附膜的中間部位加入60 μL Buffer EB,室溫放置2 min,13000 r/min 離心1 min,將質粒溶液收集到離心管中,-20℃保存質粒。 質粒送至南京擎科生物科技有限公司進行測序,測序引物為通用引物U6-F。

注:Plcz1 基因的外顯子由豎線表示。圖1 Plcz1 基因的基因結構(NM_054066.4)和CRISPR/CAS9 的靶序列Note.Exons are represented by vertical bars.Figure 1 Gene structure of the mouse Plcz1 gene (NM_054066.4) and target sequences for CRISPR/Cas9

1.3.5 Golden Gate assembly

為構建靶向2 個Plcz1基因組位點的CRISPR/Cas9-核酸酶載體, 將測序正確的pX330A-1x2-sgRNA6 與pX330S-2-sgRNA7 統(tǒng)一到單個載體中。將pX330A/S 載體、Eco31I、T4 DNA 連接酶與10×T4 DNA 連接酶緩沖液在PCR 管中混合,并進行如下熱循環(huán)反應: 37℃ 5 min,16℃ 10 min 進行25 個循環(huán),循環(huán)反應后,在37℃下進行額外的Eco31I 消化1 h,即得到連接產物pX330A-2(如圖2 所示),用于后續(xù)步驟。

1.3.6 顯微注射

測序正確的質粒經純化后,用注射用水稀釋至3 ng/μL,存于-20℃?zhèn)溆谩?將注射過PMSG 和hCG的C57BL/6 雌鼠(供體)與C57BL/6 雄鼠合籠,同時將未注射過激素的ICR 雌鼠與結扎的雄鼠合籠,從而獲得假孕雌鼠(受體)。 處死超數(shù)排卵的供體雌鼠,取出受精卵,使用顯微注射儀將質粒注射到受精卵原核中。 麻醉假孕雌鼠,將受精卵移植至受體卵巢內。 3 周后移植成功的受體雌鼠可生出F0代小鼠。

1.3.7 基因敲除小鼠的篩選

提取鼠尾基因組DNA,通過PCR 檢測目的片段。 由南京擎科生物科技有限公司合成檢測sgRNA 的引物(如表2 所示)。 PCR 反應體系:2×Es Taq MasterMix(Dye)10 μL,F(10 μmol/L)1 μL,R(10 μmol/L)1 μL,DNA(<0.2 μg)1 μL,ddH2O 7 μL。 PCR 反應程序:預變性94℃ 2 min,變性94℃ 30 s、退火60℃ 30 s、延伸72℃ 30 s,循環(huán)33 次,終延伸72℃ 2 min。 PCR 擴增產物送至南京擎科生物科技有限公司進行測序, 用SnapGene 軟件分析。

注:圖片由SnapGene 提供。圖2 pX330A-2 質粒圖譜Note.The picture was support by SnapGene software.Figure 2 Plasmid map of pX330A-2

表2 檢測目的片段的引物序列Table 2 Primer sequences for detection of target fragment

1.3.8Plcz1-/-雄性小鼠的飼養(yǎng)和繁育

繁育出F0 代小鼠后,與野生型C57BL/6 小鼠合籠,得到F1 代雜合小鼠。 然后將純合和純合小鼠、純合和雜合小鼠、純合和野生型、雜合和雜合小鼠以及野生型和野生型小鼠等不同基因型間進行合籠,從繁殖情況分析Plcz1基因敲除雄性小鼠的生育能力。

1.4 統(tǒng)計學方法

應用IBM SPSS Statistics 22 統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析,組間兩兩比較采用配對雙尾t檢驗,數(shù)據(jù)以平均值±標準差(±s)顯示。 當P<0.05 時表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 pX330A-sgRNA 重組載體構建

目的序列Plcz1-sgRNA6 和sgRNA7 與載體pX330A 載體連接,通過序列測定驗證目的基因,并用SnapGene 軟件進行序列比對,結果表明正確插入兩對sgRNA 序列(圖3)。

2.2 Plcz1 基因敲除小鼠的測序篩選

獲得受精卵82 枚,顯微注射活胚54 枚,胚胎移植兩只ICR 受體(C102、C103),其中C102受體產仔6 只,編號1~6,C103 受體生的8 只后代均被吃。 PCR 擴增包含sgRNA 的片段后進行瓊脂糖凝膠電泳(如圖4 所示),電泳結果顯示:用檢測sgRNA6 或sgRNA7 引物進行PCR 擴增,3號小鼠沒有電泳條帶,其余小鼠電泳條帶大小為289 bp;而用檢測sgRNA6 上游引物和sgRNA7 下游引物進行PCR 擴增,3 號小鼠在268 bp 處顯示電泳條帶。 經測序3~4 次鑒定出3、4、5 號小鼠為Plcz1基因敲除小鼠,分別為:(1)Plcz1m3:Plcz1基因第6、7 外顯子區(qū)域缺失3078 bp,在第295 個氨基酸處開始突變;(2)Plcz1m4:Plcz1基因第7 外顯子區(qū)域缺失7 bp,在第356 個氨基酸處開始突變,該小鼠在飼養(yǎng)過程中死亡。 (3)Plcz1m5:Plcz1基因第6 外顯子區(qū)域缺失1 bp,在第295 個氨基酸處開始突變。 同時預測Plcz1m3、Plcz1m4與Plcz1m5的等位基因表達產生的截短蛋白結構域(如圖5所示):Plcz1m3和Plcz1m5小鼠的PLCζ 蛋白在X 結構域處產生缺失;Plcz1m4小鼠的PLCζ 蛋白在X-Y連接區(qū)產生缺失。

2.3 Plcz1-/-雄性小鼠的生育能力分析

表3 和表4 顯示了小鼠Plcz1m3和Plcz1m5后代的生育能力。 結果發(fā)現(xiàn),Plcz1m3和Plcz1m5雄鼠與野生型雌鼠交配雖然可以產生后代,但與野生型雄鼠(8.5±1.4)相比,后代數(shù)量極顯著性降低(Plcz1m3:2.5±0.5;Plcz1m5:2.3±1.1)。 同時與野生型雄鼠相比(受精率100%;后代死亡率4.7%),Plcz1m3雄鼠受精率13.3%;Plcz1m5雄鼠受精率50%,后代死亡率24%。Plcz1m3雄鼠和Plcz1m3雌鼠交配,后代數(shù)量極顯著性降低(3.0±2.2),Plcz1m3雄鼠受精率30%,后代死亡率高達100%,而Plcz1m5雄鼠與Plcz1m5雌鼠交配不產生后代。 由此可見,Plcz1m3和Plcz1m5雄鼠可以和不同基因型雌鼠進行交配,但其受精率、出生率以及死亡率均顯著性下降。 結果表明,Plcz1-/-雄鼠自然交配可以產生后代,但是生育能力顯著性下降,同時Plcz1m5雄鼠較Plcz1m3雄鼠受精率高,但后代死亡率也高。

表4 小鼠Plcz1m5 后代生育能力參數(shù)(±s)Table 4 Fertility parameters of mouse Plcz1m5 offspring

表4 小鼠Plcz1m5 后代生育能力參數(shù)(±s)Table 4 Fertility parameters of mouse Plcz1m5 offspring

注:雜合:Plcz1+/m3 或Plcz1+/m5;純合:純合子Plcz1m3 或 Plcz1m5;WT:野生型;雄性和雌性小鼠之間根據(jù)指定的基因型建立交配對。 與野生型小鼠每窩產仔數(shù)相比,???P<0.001。Note.Het, Plcz1+/m3 or Plcz1+/m5.Mut, homozygote Plcz1m3 or Plcz1m5.WT, Wild-type.Mating pairs were set up between males and females with genotypes as indicated.Compared with the litter size of wild-type mouse,???P<0.001.

交配Crosses雄性×雌性Male×Female受精率(%)Fertilization rate產仔窩數(shù)Number of litters 每窩產仔數(shù)Litter size出生小仔死亡率(%)Infant mortality rate WT(n=6)×WT(n=7) 100.0 10 8.5±1.4 4.7 Het(m5)(n=10)×Het(m5)(n=11) 80.0 13 8.0±2.3 14.4 Het(m5)(n=6)×Mut(m5)(n=4) 75.0 3 6.7±1.3 10.0 Mut(m5)(n=13)×WT(n=22) 50.0 11 2.3±1.1??? 24.0 Mut(m5)(n=9)×Het(m5)(n=10) 18.2 2 2.5±0.5??? 0 Mut(m5)(n=5)×Mut(m5)(n=5) 0 0 0 0

注:A:sgRNA6 的測序結果與預測構建的載體的序列比對;B:sgRNA7 的測序結果與預測構建的載體的序列比對。圖3 載體測序對比圖Note.A, Sequencing results of sgRNA6 were compared with the predicted vector.B, Sequencing results of sgRNA7 were compared with the predicted vector.Figure 3 Comparison of vector sequencing

表3 小鼠Plcz1m3 后代生育能力參數(shù)(±s)Table 3 Fertility parameters of mouse Plcz1m3 offspring

表3 小鼠Plcz1m3 后代生育能力參數(shù)(±s)Table 3 Fertility parameters of mouse Plcz1m3 offspring

注:與野生型小鼠每窩產仔數(shù)相比, ?P<0.05,???P<0.001。Note.Compared with the litter size of wild-type mouse, ?P<0.05,???P<0.001.

交配Crosses雄性×雌性Male × Female受精率(%)Fertilization rate產仔窩數(shù)Number of litters每窩產仔數(shù)Litter size出生小仔死亡率(%)Infant mortality rate WT(n=6)×WT(n=7) 100.0 10 8.5±1.4 4.7 Het(m3)(n=16)×Het(m3)(n=15) 75.0 25 6.3±1.5??? 21.0 Het(m3)(n=6)×Mut(m3)(n=7) 55.6 9 6.9±1.5? 16.1 Mut(m3)(n=15)×WT(n=15) 13.3 2 2.5±0.5??? 0 Mut(m3)(n=17)×Het(m3)(n=17) 17.7 3 3.0±0.8??? 0 Mut(m3)(n=10)×Mut(m3)(n=6) 30.0 3 3.0±2.2??? 100.0

注:A、C、E:野生型Plcz1(Plcz1WT)等位基因和3 個核苷酸缺失突變Plcz1 等位基因的基因組序列比較,虛線標紅為缺失序列;B、D、F:預測了野生型小鼠PLCζ 蛋白(PLCζWT)和突變的PLCζm3(B)、PLCζm4(D)以及PLCζm5(F)等位基因表達的截短蛋白的結構域。圖5 小鼠Plcz1m3、Plcz1m4 以及Plcz1m5 突變等位基因的表達分析Note.A, C, E, Comparison of genomic sequences from wild-type Plcz1(Plcz1WT) allele and three mutant Plcz1 alleles harbouring nucleotide deletions, the missing sequence is marked red by a dotted line.B, D, F, Predicted protein-domain structures for wild-type mouse PLCζ protein (PLCζWT) and truncated proteins resulting from expression of mutant PLCζm3(B), PLCζm4(D) and PLCζm5(F) alleles.Figure 5 Expression analysis of mouse Plcz1m3, Plcz1m4and Plcz1m5mutant alleles

注:M:DL5000 Marker;WT:野生型;1~6:原代小鼠的鼠尾DNA。圖4 PCR 法鑒定小鼠Plcz1 基因突變位點Note.M, DL5000 Marker.WT, Wild type.1~6, Tail DNA of primary mice.Figure 4 Identification of mouse Plcz1 gene mutation site by PCR

3 討論

不孕癥是一種影響男性和女性的復雜和多因素的疾病,全球臨床數(shù)據(jù)顯示,每7 對夫婦中就有1 對經歷不孕不育[13]。 即使采用胞漿內單精子注射(ICSI),高達5%的ICSI 治療周期仍然失敗,僅在英國每年就有至少1000 對夫婦受到影響[14]。 目前,卵子激活過程中的缺陷被認為是這一失敗的主要來源[15]。 許多臨床報告已將人類PLCζ 缺陷與卵母細胞激活失敗聯(lián)系在一起,同時某些類型的男性不育與人類精子中PLCζ 的異常表達、功能、結構以及定位密切相關[16]。 因此,本研究構建的Plcz1基因敲除小鼠模型對研究PLCζ 在精子和卵母細胞中的表達和功能活性的調控機制,以及找出不孕癥的潛在治療方案具有臨床意義。

利用基因組靶向編輯技術制備動物模型是當今研究的熱點領域之一。 CRISPR/Cas9 系統(tǒng)使用RNA 引導的核酸酶切割外源基因[17],相較于其他基因編輯技術,具有易于定制、更高的靶向效率以及促進多重基因組編輯的能力[18-19],操作更加簡單,成本較低[20]。 Sakuma 等[21]用CRISPR/Cas9 構建的系統(tǒng)為多重基因組/表觀基因組編輯、同時激活/抑制多個基因等提供了有效的靶向策略。Golden Gate 載體構建方法,使構建質粒更加便利[22]。 為保證CRISPR/Cas9 的切割效率,本研究選擇脫靶位點較少、sgRNA 與其互補序列錯配率也較少的靶點,且得分較高的靶點,同時也控制CRISPR/Cas9 的劑量,因為劑量也是影響脫靶突變的另一個因素,最大限度地減少脫靶突變。 此外,通過利用Cas9 與多個sgRNA 一起使用的優(yōu)勢,可成功地實現(xiàn)sgRNA 靶點之間的大片段缺失或倒置[23]。

利用顯微注射方法將質粒注射到胚胎原核中[24],21 d 后,6 只F0 代小鼠出生,鼠尾DNA 經過PCR 后瓊脂糖凝膠電泳和測序分析,證明3 只小鼠有Plcz1基因缺失,成功構建出Plcz1基因敲除小鼠模型。 野生型或Plcz1-/-雄性小鼠分別與野生型雌性小鼠交配,結果表明Plcz1-/-雄性小鼠可以繁育后代,但是與野生型雄性小鼠相比其產仔數(shù)量顯著性下降,此結果與Hachem 等[12]的研究結果相符,為闡明Plcz1基因突變帶來的生殖能力障礙提供理論依據(jù)。

目前,研究者越來越重視卵母細胞激活途徑的選擇與優(yōu)化,在體外激活卵母細胞的過程中,研究者往往通過選取不同的激活方式獲得動物的胚胎,而卵母細胞的人工激活效率會直接影響胚胎的發(fā)育質量。 受精時,PLCζ 作為精子中一種重要的因子在激活卵母細胞第二次減數(shù)分裂過程中發(fā)揮重要作用。 精卵融合后,PLCζ 通過精子進入卵質,并催化PIP2水解生成IP3。 IP3觸發(fā)的細胞內Ca2+釋放,產生特有的胞質Ca2+振蕩,導致卵子激活,從而啟動胚胎發(fā)育過程。 Nomikos 等[25]證明在表達功能障礙的PLCζ 不能激活的卵母細胞中顯微注射重組人PLCζ,可以有效地挽救失敗的激活,并正常發(fā)育至囊胚階段。 在人類生殖過程中,PLCζ 蛋白缺陷的男性會不育[26-27]。 Hachem 等[12]首次在哺乳動物上證明,在沒有卵母細胞激活的情況下,自然交配和受精可以產生后代,與本文研究結果相符,相較于野生型雄鼠,Plcz1-/-雄鼠在受精率和繁殖率上均有顯著性下降,是否存在別的途徑激活小鼠體內的卵母細胞還有待商榷,需要對Plcz1基因敲除小鼠進行深入的機制研究。 同時,Dai 等[28]證明催化結構域變異的精子會受到損害,失去水解PIP2的功能,導致異常的Ca2+振蕩,不能激活卵母細胞使受精失敗。 Unnikrishnan 等[29]表明PLCζ 在精子中的分布在不同物種中存在差異:在人類精子頭部的頂體、赤道段和頂體后區(qū)域,以及尾部區(qū)域;在小鼠精子的頂體和頂體后區(qū)域。 但是,PLCζ 的不同結構區(qū)域調節(jié)PLCζ 定位的機制,以及對于精子獲能的具體作用尚不清楚。

本研究利用CRISPR/Cas9 系統(tǒng)構建的Plcz1基因敲除(Plcz1-/-)小鼠模型,為進一步揭示Plcz1基因缺失導致的生殖障礙發(fā)病機制提供理論依據(jù),同時為治療生育能力障礙等問題的研究提供了有效的動物模型。 但是關于PLCζ 的確切作用機制及其在卵母細胞激活過程中的作用程度仍然存在許多問題,所以需要進一步探索。