楊振清，劉喜蘋，文韜，李濤，艾晗，段黎恒，張玉平，王文慧，王晶晶

中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院醫(yī)學生物學研究所，云南 昆明 650118

KMB17 細胞是由中國醫(yī)學科學院醫(yī)學生物學研究所于1973年研制的人二倍體細胞株，1974年經(jīng)我國衛(wèi)生部批準，可用于人用疫苗生產(chǎn)［1］。目前，該細胞株已用于多種病毒疫苗的生產(chǎn)，并證明具有較好的安全性［2］。由中國醫(yī)學科學院醫(yī)學生物學研究所自行研制的F 基因型腮腺炎減毒活疫苗就是以該細胞為培養(yǎng)基質(zhì)，目前已完成Ⅰ期和Ⅱ期臨床試驗，顯示出較好的免疫原性［3］。為了進一步提高產(chǎn)能，在即將開展的Ⅲ期臨床試驗樣品制備中，采用了聚苯乙烯細胞工廠作為細胞培養(yǎng)容器，因此，首先要確定KMB17 細胞在聚苯乙烯細胞工廠的增殖情況，才能為后續(xù)疫苗的工藝研究提供依據(jù)［4-5］。

細胞工廠培養(yǎng)技術(shù)近10年來才在我國開始普及應(yīng)用，其特點在于可在有限的空間內(nèi)將培養(yǎng)面積最大化，單層培養(yǎng)面積為632 cm2，國外的細胞工廠廠家可提供1、10、40 層的選擇，使得疫苗的規(guī)?；糯笊a(chǎn)更具有可操作性。為了保證疫苗質(zhì)量的安全性，細胞工廠多為一次性使用，增加了生產(chǎn)成本，目前國內(nèi)已有廠家獲準其生產(chǎn)的聚苯乙烯細胞工廠用于疫苗生產(chǎn)［6-10］。

本實驗應(yīng)用不同廠牌細胞工廠，在細胞培養(yǎng)液中加入不同濃度的血清，對人二倍體細胞進行連續(xù)傳代培養(yǎng)，觀察其生長情況和細胞得率，判斷不同細胞工廠在不同血清條件下對細胞生長的影響，并在不同細胞工廠中制備病毒收獲液和疫苗原液，比較病毒滴度和熱穩(wěn)定性，同時按照《中國藥典》三部（2020 版）要求進行相關(guān)檢測，以期為后續(xù)F 基因型腮腺炎減毒活疫苗產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 細胞及毒種 人胚肺二倍體細胞KMB17 由本所保存；腮腺炎病毒SP-A 株為中國醫(yī)學科學院醫(yī)學生物學研究所于2005年分離，經(jīng)全基因測序為F 基因型（GenBank 登錄號：DQ 649478），本研究使用的毒株為24 代，復(fù)蘇時細胞代次為16 代。

1.2 主要試劑及儀器 新生牛血清購自蘭州民海生物工程有限公司（批號：20180724），經(jīng)本所QC 檢定符合內(nèi)控要求；MEM 培養(yǎng)購自美國Gibco 公司；硫酸卡那霉素購自遂成藥業(yè)股份有限公司；胰蛋白酶、EDTA、氫氧化鈉和谷氨酰胺購自美國Sigma 公司；鱟試劑購自湛江安度斯生物有限公司；0.01 mol ／ L PBS 由本所配制；96 孔細胞培養(yǎng)板購自美國Thermo公司；無菌檢查用培養(yǎng)基購自北京三藥科技開發(fā)公司；集菌儀購自默克密理博公司；無菌隔離器購自上海東富龍愛瑞思科技有限公司；細胞工廠分別購自無錫耐思生物科技有限公司（醫(yī)療器械生產(chǎn)許可證號：蘇食藥監(jiān)械生產(chǎn)許20190045 號）和美國康寧公司（符合醫(yī)用包裝材料EN ISO13485 檢測標準）；顯微鏡購自德國Leica 公司；無菌檢查用培養(yǎng)箱購自重慶雅馬拓科技有限公司。

1.3 細胞復(fù)蘇及傳代 將細胞從液氮罐取出，置于37 ～40 ℃注射用水中，至細胞種子融化，置入T225培養(yǎng)瓶中，加入150 mL 含10%新生牛血清、100 UI／mL硫酸卡那霉素、3%谷氨酰胺、6.6%碳酸氫鈉的MEM 培養(yǎng)基，于37 ℃放置24 h 后，再次加入新配制的MEM 培養(yǎng)基，待細胞長成致密單層后進行傳代：用PBS 清洗1 次，加入0.25%胰蛋白酶消化液，其中1 L 細胞消化液中含83 mL PBS 使用液，12 mL 1%胰蛋白酶，3 mL 1 mol／L NaOH，3 mL 4%EDTA·2Na，至細胞均勻分散后繼續(xù)傳代。

1.4 10 層細胞工廠培養(yǎng) 將傳代后的KMB17 細胞分為細胞工廠A 組（無錫耐思生物科技有限公司）和細胞工廠B 組（美國康寧公司），培養(yǎng)基血清濃度分為10%、8%和5%，每個血清濃度8個細胞工廠，將細胞按照2 × 105個 ／ mL 的終濃度接種于細胞工廠中，共傳代 3 次，其余成分為 100 UI ／ mL 硫酸卡那霉素、3%谷氨酰胺、6.6%碳酸氫鈉，于37 ℃培養(yǎng)4 d，顯微鏡下觀察細胞生長情況。

1.5 細胞計數(shù) 將生長為致密單層的KMB17 細胞用0.25%胰蛋白酶消化3 ～5 min，分散均勻后，按照一定稀釋倍數(shù)加入計數(shù)室（4個大方格），每個計數(shù)室數(shù)左上、右上、左下、右下大方格中的細胞，壓線細胞按數(shù)上不數(shù)下，數(shù)左不數(shù)右的原則進行計數(shù)，按下式計算每毫升溶液中所含細胞數(shù)。

每毫升溶液中所含細胞數(shù)=8個大方格中的細胞數(shù)／8×稀釋倍數(shù)× 104

1.6 病毒接種 待KMB17 細胞長成單層后計數(shù)，按照0.020 MOI 接種腮腺炎病毒，加入無血清病毒維持液，于37 ℃培養(yǎng)7 ～9 d，收集病毒收獲液，經(jīng)50 μm + 10 μm 兩級澄清過濾后，即為疫苗原液。

1.7 病毒滴度檢測 病毒滴定采用微量細胞病變法。將毒種10 倍系列稀釋，取至少3個稀釋度病毒液接種KMB17 細胞，每個稀釋度接種8 孔，0.10 mL／孔，置（37 ± 0.5）℃培養(yǎng)10 d，判定結(jié)果。同時將病毒收獲液和疫苗原液樣品于4 ℃條件下放置14 d、37 ℃條件下放置7 d，再檢測病毒滴度。

1.8 安全性指標檢查 對A 組和B 組細胞工廠制備的3 批病毒收獲液和疫苗原液，按照《中國藥典》三部（2020 版）方法進行全面安全性指標檢查，包括無菌檢查、分枝桿菌、支原體和細菌內(nèi)毒素檢查。

1.9 統(tǒng)計學分析 應(yīng)用SPSS 12.0 軟件進行統(tǒng)計學分析，細胞收獲量的比較采用配對t 檢驗，病毒滴度的比較采用方差分析，以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 細胞生長狀態(tài) A 組和B 組細胞工廠培養(yǎng)KMB17細胞至24 h，細胞已成片生長；至第48 h 時，細胞匯合度達70%；至第72 h 時，達100%，并可見細胞形態(tài)呈梭狀特征，界限清晰，排列整齊，細胞立體感和折光性均較好。見圖1。

圖1 不同細胞工廠培養(yǎng)KMB17 細胞不同時間的顯微鏡觀察（× 100）Fig.1 Microscopy of KMB17 cells in different cell factories for various hours（× 100）

2.2 細胞收獲量的比較 使用A 組和B 組細胞工廠培養(yǎng)KMB17 細胞，在培養(yǎng)基血清濃度分別為10%、8%和5%的條件下，細胞連續(xù)傳代3 次的收獲量均值均大于4.00 × 108個 ／ 細胞工廠，在相同血清濃度下，A 組與B 組細胞工廠獲得的細胞數(shù)均值差異無統(tǒng)計學意義（t 分別為 0.14、0.88 和 0.47，P 均 ＞0.05），能滿足后續(xù)生產(chǎn)要求所需細胞量，見圖2。

圖2 不同血清培養(yǎng)條件下KMB17 細胞在不同細胞工廠中收獲量的比較Fig.2 Comparison of cell harvests of KMB17 cells in different cell factories under different serum culture conditions

2.3 病毒滴度的變化 使用5%血清濃度的培養(yǎng)基培養(yǎng)KMB17 細胞，兩組細胞工廠培養(yǎng)的病毒收獲液和疫苗原液感染性滴度均高于10%和8%血清濃度，感染性滴度均值為 6.50 LgCCID50／ mL。4 ℃放置14 d 后，A 組細胞工廠病毒收獲液滴度下降0.46 LgCCID50／mL，疫苗原液下降 0.41 LgCCID50／mL；B 組細胞工廠病毒收獲液滴度下降0.41 LgCCID50／mL，疫苗原液下降0.37 LgCCID50／mL。37 ℃放置7 d 后，A 組細胞工廠病毒收獲液滴度下降1.50 LgCCID50／mL，疫苗原液下降 1.38 LgCCID50／ mL；B 組細胞工廠病毒收獲液滴度下降1.63 LgCCID50／ mL，疫苗原液下降1.38 LgCCID50／ mL。不同細胞工廠在10%、8%和5%血清濃度下制備的病毒收獲液和疫苗原液病毒滴度差異均無統(tǒng)計學意義（t 分別為0.02、0.92 和0.85，P 均 ＞0.05），表明兩組細胞工廠均可用于制備SP-A 株F 基因型腮腺炎減毒活疫苗。見表1。

表1 不同血清條件下不同細胞工廠制備的病毒收獲液和疫苗原液病毒滴度變化（LgCCID50／ mL）Tab.1 Changes of virus titers in virus harvests and bulk prepared in different cell factories under different serum culture conditions（LgCCID50 ／ mL）

2.4 安全性指標 兩組細胞工廠制備的3 批病毒收獲液和疫苗原液的無菌、分枝桿菌和支原體檢查結(jié)果均為陰性，細菌內(nèi)毒素均不超過50 EU ／ 劑，檢測結(jié)果均符合《中國藥典》三部（2020 版）標準。

3 討 論

目前，國際公認人二倍體細胞為人用疫苗生產(chǎn)最安全的細胞基質(zhì)，是傳統(tǒng)工藝疫苗開發(fā)的首選。但人二倍體細胞培養(yǎng)條件和技術(shù)要求較高，目前尚未攻克應(yīng)用生物反應(yīng)器進行大規(guī)模工業(yè)化培養(yǎng)的技術(shù)難題，制約了以人二倍體細胞為基質(zhì)的疫苗產(chǎn)量及其在疫苗開發(fā)方面的應(yīng)用［11-12］。細胞工廠是貼附型細胞培養(yǎng)系統(tǒng)，在國外已應(yīng)用30 多年，近10年在我國逐步開始應(yīng)用，可用于多種貼附型細胞的培養(yǎng)。國內(nèi)已有多個疫苗生產(chǎn)企業(yè)獲準利用細胞工廠制備人用疫苗，細胞工廠可高效利用有限的恒溫培養(yǎng)空間提供最大限度的細胞培養(yǎng)表面，在無需改造現(xiàn)有生產(chǎn)設(shè)施和新建生產(chǎn)車間的情況下，短期內(nèi)即能實現(xiàn)產(chǎn)能提升［6-10］。進口細胞工廠的一次性使用雖可最大限度地降低每個培養(yǎng)單元之間及批間差異，保證細胞和病毒產(chǎn)量及質(zhì)量的穩(wěn)定性和一致性［13-14］，但也增加了疫苗生產(chǎn)單位的成本，因此有必要尋求既能保證產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定性又能保證最小批間差異的培養(yǎng)容器。

本實驗分別使用細胞工廠A 組（無錫耐思生物科技有限公司）和細胞工廠B 組（美國康寧公司）在10%、8%和5%的血清濃度下培養(yǎng)人二倍體細胞，并對病毒收獲液和疫苗原液進行病毒滴度檢測及穩(wěn)定性考察，結(jié)果表明，人二倍體細胞KMB17 在兩種細胞工廠中均能良好生長；兩種細胞工廠在細胞培養(yǎng)基血清濃度為5%時制備的病毒收獲液和疫苗原液感染性滴度明顯優(yōu)于10%和8%血清濃度的培養(yǎng)基；在 4 ℃放置 14 d、37 ℃放置 7 d 后，兩種不同廠牌細胞工廠制備的病毒收獲液和疫苗原液病毒滴度差異無統(tǒng)計學意義（P ＞0.05）；對兩種不同廠牌細胞工廠制備的3 批病毒收獲液和疫苗原液進行安全性指標檢查，結(jié)果均符合《中國藥典》三部（2020 版）相關(guān)要求［15］。

綜上所述，使用不同廠牌細胞工廠在細胞培養(yǎng)階段使用5%血清濃度即可獲得生長狀態(tài)良好的細胞，腮腺炎病毒SP-A 株在人二倍體細胞KMB17 中能夠良好地增殖，病毒培養(yǎng)至7 d 可獲得高滴度的病毒收獲液，A 組和B 組細胞工廠均可用于制備F基因型腮腺炎減毒活疫苗。本實驗結(jié)果為以人二倍體細胞為基質(zhì)的F 基因型腮腺炎減毒活疫苗規(guī)?；a(chǎn)提供了實驗依據(jù)。