李軍麗 ，付麗麗 ，楊陽(yáng) ，王國(guó)治 ，趙愛(ài)華

1.中國(guó)食品藥品檢定研究院結(jié)核病疫苗和過(guò)敏原產(chǎn)品室，北京 102629；2.國(guó)家藥品監(jiān)督管理局生物制品質(zhì)量研究與評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 102629；3.國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)生物技術(shù)產(chǎn)品檢定方法及其標(biāo)準(zhǔn)化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 102629

20 世紀(jì) 80年代，科學(xué)家 SHIMADA 等［1］首次從牛型結(jié)核分枝桿菌中提取出具有抗腫瘤活性的DNA 片段MY-1，并合成了許多具有類似活性的不同序列寡脫氧核苷酸（oligodeoxynucleotide，ODN）。隨著進(jìn)一步的深入研究發(fā)現(xiàn)，病毒、細(xì)菌及無(wú)脊椎動(dòng)物的DNA 中也廣泛存在含有1個(gè)或多個(gè)回文序列的CpG 二核苷酸片段，且CpG 序列是否未甲基化或低甲基化是決定CpG-DNA 免疫活性的關(guān)鍵，這打破了以往認(rèn)為DNA 免疫原性較弱，難以引起機(jī)體較強(qiáng)免疫反應(yīng)的偏見(jiàn)。

CpG-ODN（CpG oligodeoxynucleotide）是人工合成的含有未甲基化胞嘧啶鳥嘌呤二核苷酸的寡脫氧核苷酸，長(zhǎng)度為20 ～30個(gè)堿基對(duì)，能夠模擬細(xì)菌CpG-DNA 的免疫刺激活性，作為一種病原相關(guān)分子模式（pathogen-associated molecular pattern，PAMP）與許多哺乳動(dòng)物包括人體免疫細(xì)胞中的模式識(shí)別受體（pattern recognition receptors，PRRs），如 Toll 樣受體 9（Toll-like receptor，TLR9）結(jié)合，直接激活 B 細(xì)胞和單核巨噬細(xì)胞，間接激活NK 細(xì)胞和T 細(xì)胞等多種免疫效應(yīng)細(xì)胞，刺激細(xì)胞因子分泌，增強(qiáng)抗原的加工、提呈，誘導(dǎo)Th1 型免疫應(yīng)答，產(chǎn)生較強(qiáng)的體液免疫和細(xì)胞免疫，從而增強(qiáng)機(jī)體固有和適應(yīng)性免疫應(yīng)答［2-6］。但CpG-ODN 易被核酸外切酶酶解，且生產(chǎn)過(guò)程中對(duì)核苷酸進(jìn)行硫代硫酸酯修飾增加了合成成本。同時(shí)，單一的堿基序列導(dǎo)致CpG-ODN 存在明顯種屬特異性，這些均成為CpG-ODN 被廣泛用作疫苗免疫佐劑的瓶頸。新型生物佐劑BC01（BCG CpG DNA compound combination adjuvant system 01）是一種源自卡介苗（Bacillus Calmette-Guérin，BCG）基因組，含 15.75% ～ 24.75%未甲基化 CpG 基序、3 000 ～10 000個(gè)堿基對(duì)的DNA 片段，其具有結(jié)構(gòu)天然、穩(wěn)定性強(qiáng)且無(wú)明顯物種特異性等優(yōu)點(diǎn)。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，BC01 佐劑具有廣譜佐劑特性，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明其對(duì)病毒抗原、細(xì)菌抗原、寄生蟲抗原等均具有較好的免疫增強(qiáng)作用［7-10］，與 COVID-19 DNA 疫苗配伍后也同樣發(fā)現(xiàn)其具有很強(qiáng)的佐劑效應(yīng)［11］。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)也證明，BC01 佐劑通過(guò)TLR9 受體的介導(dǎo)激活固有免疫應(yīng)答中核轉(zhuǎn)錄因子-κB（nuclear factorκB，NF-κB）和促分裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號(hào)通路，誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞TNF-α 和MCP-1 產(chǎn)生及增強(qiáng)細(xì)胞表面分子MHC-Ⅱ、CD40、CD80 和 CD86 的表達(dá)［12］。此外，BC01 佐劑與A（lOH）3佐劑或Poly I：C 佐劑等配伍成復(fù)合佐劑，其成分也具有協(xié)同增強(qiáng)機(jī)體免疫應(yīng)答的作用［13-15］。

盡管新型生物佐劑BC01 具有眾多優(yōu)勢(shì)，但其在動(dòng)物體內(nèi)的作用機(jī)制研究較少。因此，本研究在前期體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探討B(tài)C01 佐劑經(jīng)肌肉注射免疫后不同時(shí)間內(nèi)對(duì)機(jī)體免疫的激活作用，通過(guò)對(duì)其在體內(nèi)作用相關(guān)分子機(jī)制的深入研究以加快推進(jìn)該佐劑的臨床轉(zhuǎn)化。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF 級(jí) C57BL ／ 6 小鼠，雌性，6 ～ 8周齡，體重18 ～20 g，購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物資源研究所，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（京）2017-0013。本研究中涉及的所有動(dòng)物操作均遵循實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理審查指南，并得到本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 主要試劑及儀器 BC01 生物佐劑由中國(guó)食品藥品檢定研究院結(jié)核病疫苗和過(guò)敏原產(chǎn)品室保存；RNA later 購(gòu)自美國(guó) Thermo Scientific 公司；Trans-Script One-Step gDNA Removal、cDNA Synthesis Super-Mix 試劑盒和 TransTap High Fidelity（Hifi）PCR SuperMixⅠ試劑盒購(gòu)自北京TransGen Biotech 公司；Mouse Transcriptome Assay 2.0 基因芯片購(gòu)自美國(guó)Affymetrix 公司。

1.3 動(dòng)物分組及免疫 將C57BL ／ 6 小鼠隨機(jī)分為4 組，每組6 只，各組小鼠分別肌肉注射75 μg BC01佐劑。免疫組分別于免疫后6 、12 和24 h 安樂(lè)死小鼠，對(duì)照組于BC01 佐劑注射后0 h 安樂(lè)死小鼠。解剖取各組小鼠脾臟，分為4 份，于-20 ℃預(yù)冷的RNA later 溶液中保存。

1.4 總RNA 提取及cDNA 合成 將小鼠脾臟經(jīng)PBS洗滌2 次，充分剪碎，用1 mL Trizol 裂解研磨液研磨，將裂解物與200 μL 氯仿充分混勻，室溫靜置3 min；4 ℃，12 000 × g 離心 10 min，分離水相與有機(jī)相；吸取水相至新離心管中，按1 ∶1 比例將異丙醇加至水相中，顛倒混勻后-20 ℃放置2 h；4 ℃，12 000 × g 離心 10 min；收集總 RNA 沉淀，加入 1 mL 75%乙醇洗滌 2 次，4 ℃，7 500 × g 離心 5 min；棄上清，RNA 沉淀室溫干燥 5 ～ 10 min 后，溶于無(wú) RNase水。采用 Nanodrop 分別計(jì)算 A260／280和 A260／230值，并分析純化后總RNA 數(shù)量和質(zhì)量。cDNA 合成按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

1.5 基因芯片操作及數(shù)據(jù)分析 生物素標(biāo)記片段化的 cDNA 后，用 GeneChip?Hybriding Oven 645 將標(biāo)記的cDNA 與基因芯片45 ℃雜交16 h；雜交結(jié)束后，芯片經(jīng)GeneChip?Fluidics Station 450 進(jìn)行Streptavidin-phycoerythrin 洗染，用 GeneChip?Scanner 3000 7G 和 Affymetrix Command Console 軟件掃描獲取圖像?；蛐酒瑪?shù)據(jù)經(jīng)Robust Multi-Array Average（RMA）算法歸一化后，用Partek?GenomicsSuite?對(duì)每組4個(gè)獨(dú)立樣本的基因表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。顯著差異表達(dá)基因（significantly differentially expressed gene，SDEG）進(jìn)行基因本體分析（gene ontology，GO）或全基因轉(zhuǎn)錄組芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行基因集富集分析（gene set enrichment analysis，GSEA）。

1.6 qPCR 檢測(cè) 無(wú)RNase 水調(diào)平反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA模板濃度，按 20 μL 反應(yīng)體系中 10 μL ChamQ SYBR qPCR Master Mix、6.5 μL 去離子水、3 μL 10 倍稀釋的cDNA 模板和0.5 μL 引物進(jìn)行目的基因的擴(kuò)增，以β-actin 為內(nèi)參基因，試驗(yàn)重復(fù)3 次。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性 4 min；94 ℃變性 30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸 45 s，循環(huán) 35 次；72 ℃后延伸 10 min。引物采用Premier 5.0 軟件設(shè)計(jì)并由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列見(jiàn)表1。

表1 不同生物過(guò)程相關(guān)上調(diào)基因qPCR 引物Tab.1 Primers for amplification of up-regulated genes related to different biological processes by qPCR

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 16.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果以均數(shù) ± 標(biāo)準(zhǔn)差（）表示。不同實(shí)驗(yàn)處理組之間差異比較采用單因素方差分析，以P ＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。柱形圖采用美國(guó)GraphPad Software 公司GraphPad Prism 8 軟件制作。

2 結(jié) 果

2.1 小鼠全基因組轉(zhuǎn)錄譜整體分析 主成分分析（principal component analysis，PCA）顯示，PC1、PC2和PC3 在X、Y 和Z 軸方差的可重復(fù)性分別為25.5%、22.2%和15.3%。BC01 佐劑免疫后，不同時(shí)間點(diǎn)小鼠組間數(shù)據(jù)集聚類彼此不同，組內(nèi)生物學(xué)重復(fù)樣本數(shù)據(jù)集聚類緊密，見(jiàn)圖1A。進(jìn)一步比較不同時(shí)間點(diǎn)免疫后小鼠轉(zhuǎn)錄譜總體變化，在調(diào)整原始背景信號(hào)參數(shù)后，通過(guò)One-way ANOVA 分析各微陣列中24 362個(gè)探針的表達(dá)值并制作火山圖，見(jiàn)圖1B ～D。以上下調(diào)倍數(shù) ≥ 2 或P ＜0.05 為閾值，分別鑒定出80、386 和 1 544個(gè) SDEG，其中相較于對(duì)照組，6、12 和24 h 免疫組中各有約 0.185%（45 ／24 362）、1.481%（361 ／ 24 362）和 4.73%（1 153 ／ 24 362）的基因表達(dá)被上調(diào)，而約有0.144%（35／24 362）、0.103%（25 ／24 362）和 1.60%（391 ／ 24 362）的基因表達(dá)被下調(diào)。GSEA 中GO 基因集分組歸類分析顯示，其中生物過(guò)程（biological process，BP）匯集 GO 條目數(shù)分別為 275、55 和 41，細(xì)胞成分（cellular component，CC）匯集GO 條目數(shù)分別為131、27 和25，分子功能（molecular function，MF）匯集 GO 條目數(shù)分別為 310、68和67。見(jiàn)表2。

圖1 BC01 佐劑免疫后不同時(shí)間點(diǎn)小鼠全基因組轉(zhuǎn)錄譜整體分析Fig.1 Global transcriptome analysis of mice at various time points after immunization with BC01 adjuvant

表2 GSEA 中GO 基因集分組歸類基因富集結(jié)果Tab.2 Grouping and classification results of GO gene sets in GSEA

2.2 BC01 佐劑對(duì)免疫細(xì)胞活化的增強(qiáng)作用 BC01佐劑免疫小鼠后24 h，GSEA 分析發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，細(xì)胞活化、細(xì)胞活化調(diào)控、細(xì)胞活化正調(diào)控、淋巴細(xì)胞活化及白細(xì)胞活化等生物學(xué)過(guò)程相關(guān)基因顯著富集。ES 分別為 0.33、0.38、0.36、0.33 和 0.34，校正后的富集分?jǐn)?shù)（normalized enrichment score，NES）分別為 1.65、1.88、1.69、1.56 和 1.65，且名義 P 值（nominal P value，NOM P-value）和錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率（false discovery rate，F(xiàn)DR q-value）均 ＜ 0.05?；蚣患驍?shù)分別為 440、344、214、272 和 324，且與對(duì)照組相比，基因集前 20個(gè)基因中，Ccl19、Cd3d、Lat、Ly6d、Cd3g、Rab27a、Atg5、Klrk1、F2rl1、Rpl22、Amica1、Tnfrsf4、Anxa1、Fas、Cd2 和 Lepr 基因在淋巴細(xì)胞活化和白細(xì)胞活化生物過(guò)程中均被上調(diào)表達(dá)。見(jiàn)圖 2A ～ E。qPCR 進(jìn)一步驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，Cd3d、Atg5、Rpl22、Tnfrsf4 和Fas 與對(duì)照相比均變化顯著，且變化比率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F 分別為9.155、10.191、11.475、17.018 和 12.193，P 均 ＜ 0.05），見(jiàn)圖 2F。

圖2 BC01 佐劑細(xì)胞活化作用GSEA 分析結(jié)果Fig.2 GSEA of activation of cells by BC01 adjuvant

2.3 BC01 佐劑對(duì)固有免疫和適應(yīng)性免疫應(yīng)答的活化作用 BC01 佐劑免疫小鼠后24 h，GSEA 分析發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，免疫反應(yīng)正調(diào)控、固有免疫反應(yīng)及適應(yīng)性免疫反應(yīng)等生物學(xué)過(guò)程相關(guān)基因顯著富集。ES 值分別為 0.31、0.31 和 0.41，NES 值分別為 1.57、1.54 和 1.84，且 NOM P-value 和 FDR q-value均＜0.05。基因集所富集基因數(shù)分別為407、340 和161，且與對(duì)照組相比，基因集前20個(gè)基因中，Klrk1基因在3個(gè)生物過(guò)程中均被上調(diào)表達(dá)；Igj、Rab27a和Klrk1 基因在固有免疫反應(yīng)及適應(yīng)性免疫反應(yīng)中被上調(diào)表達(dá)。見(jiàn)圖3A ～C。qPCR 進(jìn)一步驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，Klrk1、Igj 和Rab27a 與對(duì)照相比均變化顯著，且變化比率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F 分別為11.079、10.291 和12.083，P 均 ＜ 0.05），見(jiàn)圖 3D。

圖3 BC01 佐劑活化免疫應(yīng)答GSEA 分析結(jié)果Fig.3 GSEA of activation of immune response by BC01 adjuvant

2.4 BC01 佐劑對(duì)炎癥相關(guān)反應(yīng)的活化作用 與對(duì)照組相比，BC01 佐劑免疫小鼠后24 h，炎癥反應(yīng)及炎癥反應(yīng)正調(diào)控生物學(xué)過(guò)程相關(guān)基因被顯著富集。ES 值分別為 0.36 和 0.47，NES 值分別為 1.76 和1.88，且 NOM P-value和 FDR q-value均 ＜ 0.05。基因集所富集基因數(shù)分別為279 和186，且與對(duì)照組相比，基因集前 20個(gè)基因中，Ccr2、Mefv、Ccl5、Sema7a和Anxa1 基因在炎癥反應(yīng)和炎癥反應(yīng)正調(diào)控生物學(xué)過(guò)程中均被上調(diào)表達(dá)。見(jiàn)圖4。

圖4 BC01 佐劑活化炎癥反應(yīng)GSEA 分析結(jié)果Fig.4 GSEA of activation of inflammatory reaction by BC01 adjuvant

2.5 BC01 佐劑對(duì)免疫細(xì)胞遷移與趨化作用的激活情況 BC01 佐劑免疫小鼠后24 h，GSEA 分析發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，白細(xì)胞遷移調(diào)控、白細(xì)胞趨化調(diào)控、中性粒細(xì)胞遷移調(diào)控及單核細(xì)胞趨化作用等生物學(xué)過(guò)程相關(guān)基因顯著富集。ES 值分別為0.45、0.49、0.61 和 0.69，NES 值分別為 1.92、1.94、1.92 和 1.99，且 NOM P-value 和 FDR q-value 均 ＜ 0.05。4個(gè)生物過(guò)程對(duì)應(yīng)基因集所富集基因數(shù)分別為105、67、23和17，且與對(duì)照組相比，Ccl19 和Xcl1 基因均被上調(diào)表達(dá) ；Ccl19、Grem1、Jam3、Ccr2、Ccl5、Klrk1、Pla2g7、F2rl1、Rarres2、Xcl1、Vegfc、Nbl1、Thbs4、C5ar1、Gas6和Ccr6 基因在白細(xì)胞遷移調(diào)控和白細(xì)胞趨化調(diào)控中均被上調(diào)表達(dá)，見(jiàn)圖 5A 和 B；Ccl19、Jam3、Xcl1、Thbs4 和C5ar1 基因在白細(xì)胞遷移調(diào)控和中性粒細(xì)胞遷移調(diào)控中均被上調(diào)表達(dá)，見(jiàn)圖5A 和C；而Ccl19、Ccl5 和Xcl1 基因在白細(xì)胞趨化調(diào)控和單核細(xì)胞趨化作用中均被上調(diào)表達(dá)，見(jiàn)圖5B 和D。

圖5 BC01 佐劑增強(qiáng)細(xì)胞遷移與趨化作用GSEA 結(jié)果Fig.5 GSEA of activation of cell migration and chemotaxis by BC01 adjuvant

2.6 BC01 佐劑對(duì)免疫細(xì)胞吞噬功能的增強(qiáng)作用BC01 佐劑免疫小鼠后24 h，GSEA 分析發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，免疫細(xì)胞吞噬作用生物過(guò)程相關(guān)基因顯著富集。ES 值為 0.37，NES 值為 1.64，且 NOM P-value和FDR q-value均＜0.05，吞噬作用生物學(xué)過(guò)程基因集富集基因數(shù)為141，見(jiàn)圖6A。qPCR 進(jìn)一步驗(yàn)證基因集前 5個(gè)基因發(fā)現(xiàn)，Cd36、Brk1、Cd3g、Gsn和Cd247 與陰性對(duì)照相比均變化顯著，且變化比率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F 分別為 13.032、9.273、7.791、12.091 和 15.066，P 均 ＜ 0.05），見(jiàn)圖 6B。

圖6 BC01 佐劑增強(qiáng)免疫細(xì)胞吞噬功能GSEA 分析結(jié)果Fig.6 GSEA of activation of phagocytosis of immune cells by BC01 adjuvant

2.7 BC01 佐劑對(duì) MAPK 和 ERK1／2 信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)的激活作用 BC01 佐劑免疫小鼠后24 h，GSEA分析發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，MAPK 信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)調(diào)控、MAPK 信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)正調(diào)控、ERK1 ／ 2 信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)調(diào)控和G 蛋白偶聯(lián)受體信號(hào)通路生物過(guò)程相關(guān)基因顯著富集。ES 值分別為 0.33、0.34、0.36 和0.34，NES 值分別為 1.67、1.66、1.62 和 1.68，且NOM P-value和 FDR q-value均 ＜ 0.05。4個(gè)生物過(guò)程基因集所富集基因數(shù)分別為468、328、157 和335，且與對(duì)照組相比，基因集前20個(gè)基因中，Ccl19、Cd36、Prkcdbp、Bmp4、Pla2g5、Ccl5、Klf4、Atf3、F2rl1、Ctgf 和Xcl1 基因在MAPK 信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)調(diào)控和ERK1 ／ 2 信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)調(diào)控過(guò)程中均被上調(diào)表達(dá)。見(jiàn)圖7。

圖7 BC01 佐劑增強(qiáng)MAPK 和ERK1 ／ 2 信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)GSEA 分析結(jié)果Fig.7 GSEA of activation of MAPK and ERK1 ／ 2 signal cascade reaction by BC01 adjuvant

3 討 論

疫苗佐劑是能夠非特異性地改變或增強(qiáng)機(jī)體對(duì)抗原的特異性免疫應(yīng)答、發(fā)揮輔助作用的一類物質(zhì)。佐劑能夠誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生長(zhǎng)期、高效的特異性免疫反應(yīng)，提高機(jī)體保護(hù)能力，同時(shí)又能減少免疫物質(zhì)的用量，降低疫苗的生產(chǎn)成本。長(zhǎng)期以來(lái)，由于傳統(tǒng)滅活或減毒活疫苗具備較好的免疫原性，一般不需額外添加佐劑。因此，很長(zhǎng)一段時(shí)間內(nèi)免疫佐劑并未引起人們廣泛的注意，其研究和使用也僅局限于較小的范圍。隨著現(xiàn)代生物醫(yī)藥技術(shù)的迅速發(fā)展，針對(duì)不同疾病已開展了各種新型核酸疫苗、基因工程疫苗、合成肽疫苗的研制，但這些疫苗普遍存在分子量小、免疫原性弱、難以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生有效免疫應(yīng)答等不足，從而需要某種物質(zhì)來(lái)增強(qiáng)其免疫作用。因此，免疫佐劑尤其是新型免疫佐劑的研究就顯得尤為迫切。

傳統(tǒng)佐劑如鋁鹽佐劑作為抗原的儲(chǔ)存庫(kù)，緩慢釋放抗原以延長(zhǎng)誘導(dǎo)機(jī)體的免疫應(yīng)答，但缺點(diǎn)是其僅誘導(dǎo)Th2 型免疫應(yīng)答，抗體以IgG1 類型為主，細(xì)胞免疫反應(yīng)較弱。弗氏佐劑和油乳佐劑雖然能明顯提高機(jī)體免疫應(yīng)答能力，但易出現(xiàn)注射部位腫脹、疼痛、發(fā)熱或過(guò)敏等異常不良反應(yīng)。為適應(yīng)新型疫苗的需求，佐劑已從傳統(tǒng)、單一的形式向新型、多元化形式發(fā)展，尤其用于黏膜疫苗、DNA 疫苗及腫瘤疫苗的佐劑研究成為了熱點(diǎn)。CpG-ODN 作為一種新型佐劑以提高疫苗的免疫效果，其既可以單獨(dú)使用也可與Al（OH）3佐劑或其他新型佐劑聯(lián)合使用發(fā)揮協(xié)同作用，具有序列已知、用量低、副作用小等優(yōu)點(diǎn)［13-15］。此外，其突破了傳統(tǒng)佐劑主要是倉(cāng)儲(chǔ)、緩釋的作用機(jī)理，具有很大的開發(fā)及應(yīng)用前景。2017年底，Dynavax 公司CpG 佐劑乙肝疫苗HEPLISAV-B 成功獲批上市，極有力地增強(qiáng)了以PRRs 天然配體或合成激動(dòng)劑，特別是以CpG 作為疫苗免疫佐劑的信心。

本研究中，新型生物佐劑BC01 經(jīng)肌肉注射給藥途徑免疫小鼠，分別于免疫后不同時(shí)間點(diǎn)解剖取小鼠脾臟并分離總RNA 進(jìn)行全基因轉(zhuǎn)錄組分析。以上下調(diào)倍數(shù) ≥2 或P ＜0.05 作為閾值時(shí)分別富集到6、12 和24 h 免疫組與對(duì)照組間的SDEG 數(shù)為80、386 和 1 544。SDEG 經(jīng) GO 分析和 KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）分析后發(fā)現(xiàn)，部分差異表達(dá)不顯著卻有重要生物學(xué)意義的基因被遺漏，一些基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)之間的關(guān)系及基因功能等有價(jià)值的信息被忽略。因此，本研究采用不需要指定明確的差異基因閾值的GSEA 分析法。從GSEA 中GO 基因集分組歸類情況來(lái)看，6 和12 h 免疫組中生物過(guò)程、細(xì)胞成分和分子功能基因集下富集到的GO 條目中ES ＞0 的數(shù)量較少，而免疫后24 h 其生物過(guò)程相關(guān)GO 條目被大量富集。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，該生物過(guò)程中細(xì)胞活化、固有免疫和適應(yīng)性免疫應(yīng)答調(diào)控、炎癥反應(yīng)調(diào)控及活化、免疫細(xì)胞遷移與趨化調(diào)節(jié)、細(xì)胞吞噬功能活化等相關(guān)基因被大量富集，表明BC01 佐劑免疫24 h 后，其對(duì)機(jī)體具有較強(qiáng)的免疫激活作用。

CpG 序列經(jīng)內(nèi)吞的形式進(jìn)入細(xì)胞，并進(jìn)一步與內(nèi)體融合，最終與受體TLR9 結(jié)合。CpG 序列進(jìn)入內(nèi)體的酸性環(huán)境后，可引發(fā)細(xì)胞內(nèi)的2 條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的激活：一條為NF-κB 激活途徑，另一條為MAPK途徑［16］。NF-κB 激活途徑中，TLR9 與配體 CpG 序列結(jié)合后，將銜接子蛋白MyD88 募集至IRAK-4 的TIR 結(jié)構(gòu)域，導(dǎo)致IRAK-1 磷酸化，通過(guò)涉及TRAF-6等一系列反應(yīng)導(dǎo)致 NF-κB 激活［17-18］。NF-κB 從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞核，調(diào)節(jié)參與各種細(xì)胞過(guò)程（如細(xì)胞活化、增殖和促炎性細(xì)胞因子調(diào)節(jié)等）的基因表達(dá)［19］。此外，TLR 傳導(dǎo)信號(hào)還可誘導(dǎo)包括p38 激酶、c-Jun-N 端激酶（SPAK ／ JNK）和 ERK1 ／ 2 等分子在內(nèi)的蛋白發(fā)生磷酸化［18，20］，最終通過(guò)宿主免疫細(xì)胞中的各種轉(zhuǎn)錄網(wǎng)絡(luò)直接或間接激活MAPK 信號(hào)通路［21-22］。而本研究中BC01 佐劑免疫后24 h，MAPK 和ERK1 ／2 信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)相關(guān)基因均被顯著富集，這與前期研究結(jié)果一致［12］。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，新型生物佐劑BC01作為一種有效的TLR9 激動(dòng)劑，在機(jī)體免疫后24 h，能顯著上調(diào)免疫細(xì)胞活化、遷移與趨化、吞噬作用調(diào)節(jié)等固有免疫和適應(yīng)性免疫相關(guān)功能基因，具有明顯的免疫激活作用。這些研究結(jié)果為更好地了解BC01 佐劑在體內(nèi)的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制，加速該佐劑的臨床應(yīng)用提供了數(shù)據(jù)支撐。