郭航煒，徐康維，李星星，周瑞雪，謝瑩，權(quán)婭茹，趙慧，李長貴

1.中國食品藥品檢定研究院國家衛(wèi)生健康委員會生物技術產(chǎn)品檢定方法及其標準化重點實驗室國家藥品監(jiān)督管理局生物制品質(zhì)量研究與評價重點實驗室，北京 102629；2.山西省食品藥品檢驗所，山西 太原 030031

預防流感最有效的手段為疫苗接種。疫苗接種不僅可降低高危人群的發(fā)病率和死亡率，也可減輕癥狀，降低并發(fā)癥的發(fā)生，減少流感病毒在人群中的傳播［1-3］。目前主要有全病毒流感滅活疫苗、裂解流感疫苗、亞單位疫苗、流感減毒活疫苗及重組蛋白疫苗等［4-7］。其中流感減毒活疫苗采用鼻腔接種，類似自然感染過程，不僅可誘導機體產(chǎn)生體液免疫和細胞免疫，還可激發(fā)黏膜免疫，并避免了肌肉注射的種種不便，提高了接種的依從性［8-11］。

流感病毒表面抗原HA、NA 易發(fā)生突變，為應對這種突變，WHO 在全球設立流感監(jiān)測網(wǎng)絡實驗室，根據(jù)每年病毒流行情況預測并推薦流感疫苗生產(chǎn)用疫苗株［1，5］。疫苗株通常由重配技術制備，近年來，反向遺傳技術也用于疫苗株制備，其中8 質(zhì)粒系統(tǒng)應用最為廣泛［12-13］。本研究采用8 質(zhì)粒反向遺傳技術，以冷適應 A ／ Ann Arbor ／ 6 ／ 60（H2N2）流感病毒作為供體株，制備了含 A ／Puerto Rico／8 ／34（H1N1）HA、NA 表面抗原的AA-PR8 冷適應流感病毒疫苗株，并對該疫苗株進行了質(zhì)量評價。

1 材料與方法

1.1 細胞、病毒及載體 E.coli DH5α 感受態(tài)細胞購自天根生化科技（北京）有限公司。293T 細胞由中國食品藥品檢定研究院呼吸道病毒疫苗室保存；MTY6 細胞由該室構(gòu)建，是一種能夠穩(wěn)定表達牛胰蛋白酶原的MDCK 細胞系；A ／Puerto Rico ／8 ／34（H1N1）病毒（簡稱PR8 野病毒）、雙向表達載體pHW2000 由該室保存。

1.2 實驗動物 9 ～11 日齡SPF 雞胚購自北京勃林格殷格翰維通生物技術有限公司；SPF 級BALB ／ c小鼠，雌性，4 ～ 6 周齡，體重 13 ～ 15 g，由中國食品藥品檢定研究院提供，在ABLS-2 實驗室進行實驗操作。動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2019-0017；動物使用許可證號：SYXK（京）-2017-0013；實驗動物福利倫理審查批復號：中檢動（福）第 2022（B）004 號。

1.3 主要試劑 DMEM 培養(yǎng)基、Opti-MEM 減血清培養(yǎng)基、胎牛血清、雙抗（青霉素-鏈霉素）、HEPES、胰酶購自美國Gibco 公司；BsmBⅠ限制內(nèi)切酶購自美國 NEB 公司；QIAamp Viral RNA Mini Kit 病毒 RNA提取試劑盒、膠回收試劑盒、PCR 純化試劑盒、質(zhì)粒中提試劑盒購自德國QIAGEN 公司；SuperScript?ⅢFirst-Strand Synthesis System for RT-PCR 試劑盒、Lipo3000 轉(zhuǎn)染試劑盒、Agarose 瓊脂糖、LB 肉湯基礎培養(yǎng)基、Leibovitz′s L-15 培養(yǎng)基購自美國 Invitrogen公司；PrimeSTAR?Max DNA 聚合酶、In-Fusion 無縫克隆試劑盒、DNA marker、RNase-free Water 購自日本TaKaRa 公司。

1.4 重組質(zhì)粒的構(gòu)建

1.4.1 冷適應骨架質(zhì)粒構(gòu)建 在NCBI 數(shù)據(jù)庫中下載 A ／ Ann Arbor ／ 6 ／ 60（H2N2）冷適應株的 PB2（KT383437.1）、PB1（KT383438.1）、PA（KT383439.1）、NP（KT383440.1）、M（KT383441.1）及 NS（KT383442.1）6個基因序列，在序列5′端添加CGTCTCCGGGA，3′端添加AATAGGAGACG。序列委托安升達公司合成。采用In-Fusion 無縫克隆試劑盒連接至經(jīng)BsmBⅠ酶切線性化的PHW2000 載體上，轉(zhuǎn)化并進行克隆培養(yǎng)。提取質(zhì)粒，送安升達公司測序。序列正確的質(zhì)粒命名為PHW2000-AA-PB2、PHW2000-AAPB1、PHW2000-AA-PA、PHW2000-AA-NP、PHW2000-AA-M 和 PHW2000-AA-NS。

1.4.2 PHW2000-PR8-HA、PHW2000-PR8-NA 質(zhì)粒的構(gòu)建 用QIAamp Viral RNA Mini Kit 試劑盒提取 PR8RNA，SuperScript?ⅢFirst-Strand Synthesis System for RT-PCR 試劑盒及通用引物（5′-AGCAAAAGCAGG-3′）逆轉(zhuǎn)錄合成 cDNA，以其為模板，利用PR8-HA ／NA 引物（見表 1）和Prime STAR?Max DNA聚合酶 PCR 擴增 PR8-HA 和 PR8-NA 基因片段。PCR 反應條件：98 ℃變性 5 min；98 ℃ 10 s，52 ℃ 15 s，72 ℃ 30 s，共 35個循環(huán)；72 ℃ 5 min。用 In-Fusion 無縫克隆試劑盒連接至PHW2000 載體上，轉(zhuǎn)化并進行克隆培養(yǎng)。提取質(zhì)粒并送安升達公司測序。序列正確的質(zhì)粒命名為PHW2000-PR8-HA 和PHW2000-PR8-NA。

1.5 細胞轉(zhuǎn)染及病毒拯救 將293T 細胞稀釋至約1 × 106個 ／mL，MTY6 細胞稀釋至約 1 × 105個 ／mL，等體積混合后，接種 6 孔板，2 mL ／ 孔，37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)約24 h 至細胞長滿板底；將PHW2000-AA-PB2、PHW2000-AA-PB1、PHW2000-AA-PA、PHW2000-AA-NP、PHW2000-AA-M、PHW2000-AANS、PHW2000-PR8-HA 和 PHW2000-PR8-NA 共 8個質(zhì)粒各500 ng 混勻，按Lipo3000 轉(zhuǎn)染試劑盒說明書轉(zhuǎn)染24 h；更換為不含胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基并轉(zhuǎn)移至33 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)6 h；加入終濃度為1 μg ／mL 的TPCK-胰酶消化細胞。轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)72 h 凍融2 次后，取細胞懸液接種雞胚（200 μL ／枚），33 ℃孵箱培養(yǎng)72 h；取尿囊液進行血凝試驗，驗證是否重配出病毒。提取血凝試驗陽性的尿囊液總RNA，按照 1.4.2 項方法，利用引物（見表 1）進行PCR 擴增，擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，連接至PHW2000 載體后進行測序。

表1 PCR 引物序列Tab.1 Primer sequences for PCR

1.6 病毒的克隆化培養(yǎng) 將測序正確的重配流感病毒尿囊液經(jīng)10 倍系列稀釋后接種雞胚，每個稀釋度接種6 枚，33 ℃培養(yǎng)48 h 后收獲尿囊液，檢測HA滴度。選擇最高稀釋度HA 陽性雞胚的尿囊液，得到克隆化培養(yǎng)產(chǎn)物，重復進行1 次克隆化培養(yǎng)，將第2 次克隆化培養(yǎng)尿囊液稀釋106倍后接種10 枚雞胚，33 ℃培養(yǎng)48 h 后收獲尿囊液，混合后分裝，得到AA-PR8 冷適應流感病毒疫苗株（簡稱AA-PR8 疫苗株）。

1.7 遺傳穩(wěn)定性評價 將AA-PR8 疫苗株稀釋10 000倍后接種雞胚，200 μL ／ 枚，傳代 5 次，1 ～ 5 代分別記為 E1、E2、E3、E4 和 E5。檢測各代次血凝效價和病毒滴度（采用雞胚法：將尿囊液系列稀釋后接種雞胚，33 ℃培養(yǎng)48 h；取尿囊液進行血凝試驗，Reed-Muench 公式計算雞胚半數(shù)感染劑量，即EID50）。按1.4.2 項方法對E1 和E5 代全部基因進行測序，檢測8個基因氨基酸序列有無突變，以及冷適應相關位點是否發(fā)生改變。

1.8 溫度敏感性及冷適應表型評價 將AA-PR8 疫苗株進行10 倍系列稀釋后接種雞胚，每個稀釋度接種 18 枚，各取 6 枚分別在 26、33 和 39 ℃條件下培養(yǎng)48 h 后，取尿囊液進行血凝試驗，并檢測病毒滴度。以PB8 野病毒作為對照。

1.9 小鼠中減毒特性評價 將BALB／c 小鼠用異氟烷麻醉，左右 2個鼻孔各滴入 25 μL 104、105、106EID50／50 μL 3個免疫劑量的 AA-PR8 疫苗株或 PR8 野病毒進行攻毒，以PBS 作為陰性對照，每組6 只小鼠。每日觀察小鼠體重變化及死亡情況，共觀察14 d。以106EID50／ 50 μL 劑量對 10 只小鼠進行攻毒，在感染后第3 和6 天各處死5 只小鼠，取右側(cè)肺臟稱重后，加入9 倍肺臟體積的Leibovitz′sL-15 培養(yǎng)基勻漿后，檢測病毒滴度（方法同1.7 項）。

1.10 季節(jié)性流感病毒冷適應疫苗株的制備及溫度敏感性、冷適應表型評價 采用上述方法，從GISAID數(shù)據(jù)庫中下載2020 — 2021 北半球流行毒株A ／Hawaii ／ 70 ／ 2019（H1N1）、A ／ Hong Kong ／ 45 ／ 2019（H3N2）以及 2021 — 2022 北半球流行毒株 A ／ Wisconsin ／ 588 ／ 2019（H1N1）、A ／ Cambodia ／ e0826360 ／2020（H3N2）的 HA、NA 基因序列并進行合成，制備冷適應疫苗株。對制備得到的疫苗株溫度敏感性和冷適應表型進行評價。

1.11 統(tǒng)計學分析 使用GraphPad Prism 8 和Excel 2010 軟件繪圖并進行數(shù)據(jù)分析，組間比較采用t 檢驗，以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 質(zhì)粒鑒定及病毒拯救 質(zhì)粒PHW2000-AA-PB2、PHW2000-AA-PB1、PHW2000-AA-PA、PHW2000-AANP、PHW2000-AA-M、PHW2000-AA-NS、PHW2000-PR8-HA 和PHW2000-PR8-NA 經(jīng)測序證明構(gòu)建正確。8個質(zhì)粒等比轉(zhuǎn)染MDCK ／ 293T 混合細胞，接種SPF 雞胚，33 ℃培養(yǎng)72 h 后，尿囊液血凝效價為512，表明病毒拯救成功。擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析，8個基因片段大小均與預期一致，見圖1。擴增片段連接至PHW2000 載體進行測序，PB2、PB1、PA、NP、M 及 NS 基因序列均與 A ／ Ann Arbor ／ 6 ／ 60（H2N2）冷適應株一致，HA 及NA 基因序列均與PR8野病毒一致。

圖1 AA-PR8 疫苗株目的基因PCR 產(chǎn)物電泳圖Fig.1 Electrophoretic profile of PCR products of target genes of AA-PR8 vaccine strain

2.2 病毒的克隆 第1 次克隆化培養(yǎng)時，尿囊液稀釋108倍后，6 枚雞胚中2 枚血凝試驗陽性，收獲該稀釋度其中1 枚雞胚的尿囊液進行第2 次克隆化培養(yǎng)，稀釋108倍后，6 枚雞胚中1 枚血凝試驗陽性，收獲該稀釋度其中1 枚雞胚的尿囊液，稀釋106倍后接種10 枚雞胚進行擴大培養(yǎng)，收獲的尿囊液血凝效價為256，混合后分裝，得到AA-PR8 疫苗株。

2.3 遺傳穩(wěn)定性 E1 ～E5 代AA-PR8 疫苗株血凝效價分別為 256、128、256、512、384，病毒滴度分別為 8.10、8.06、8.45、8.54、8.39 lgEID50／ mL，均較為穩(wěn)定。E1 和E5 代基因測序結(jié)果顯示，PB2 核苷酸序列有 3個突變：G963A、A1194G、C1933T；PA 核苷酸序列有1個突變：G75T；NP 核苷酸序列有2個突變：C627A、G909C，其余位點未發(fā)生突變。上述突變均為同義突變，8個基因的氨基酸序列均未發(fā)生改變。

2.4 溫度敏感性及冷適應表型 AA-PR8 疫苗株在33 ℃培養(yǎng)時滴度為 8.10 lgEID50／ mL，39 ℃培養(yǎng)時滴度為0，而PR8 野病毒在2個溫度培養(yǎng)時滴度接近，表明AA-PR8 疫苗株具有溫度敏感性。在26 ℃培養(yǎng)時，AA-PR8 疫苗株滴度為 4.45 lgEID50／ mL，PR8 野病毒滴度為0，表明AA-PR8 能夠在低溫下生長，具有冷適應表型。見表2。

2.5 AA-PR8 疫苗株在小鼠中的減毒特性

2.5.1 感染后小鼠體重變化及死亡情況 PB8 野病毒感染后，小鼠體重降低，3個感染劑量組小鼠均在第6 天達到體重最低值，且體重降低程度與感染病毒劑量呈正相關；104、105、106EID50劑量組小鼠在感染后第6 天，平均體重分別降低了13.6%、18.8%和25.1%。而AA-PR8 疫苗株感染后，小鼠體重降低幅度較少；104、105、106EID50劑量組小鼠在感染后第6 天，平均體重分別降低了0.7%、1.6%和5.2%。PBS 對照組小鼠體重持續(xù)增長。PB8 野病毒106EID50劑量組小鼠感染后第6 和7 天各死亡1 只，其余各組小鼠均健存。見圖2。

圖2 AA-PR8 疫苗株和PB8 野病毒感染后小鼠體重變化（A）及存活情況（B）Fig.2 Bodyweight change（A）and survival（B）of mice infected with AA-PR8 vaccine strainand PR8 wild virus

2.5.2 感染后小鼠肺臟病毒載量 AA-PR8 疫苗株和PR8 野病毒感染后第3 天，小鼠肺臟病毒載量平均值分別為 1.95 和 5.78 lgEID50／ mL，AA-PR8 疫苗株病毒載量較PR8 野病毒降低6 760 倍（t=34.54，P ＜ 0.000 1）；感染后第 6 天，病毒載量平均值分別為 1.43 和 4.82 lgEID50／ mL，AA-PR8 疫苗株病毒載量較 PR8 野病毒降低 2 455 倍（t = 34.69，P ＜0.000 1）。見圖 3。

圖3 感染后小鼠肺臟病毒載量Fig.3 Viral load in lung of mice after infection

2.6 季節(jié)性流感病毒冷適應疫苗株的溫度敏感性及冷適應表型 成功制備了2020—2021 及2021—2022年度北半球流行的4 株甲型流感病毒冷適應疫苗株 AA-A ／ Hawaii ／ 70 ／ 2019（H1N1）、AA-A ／Hong Kong ／ 45 ／ 2019（H3N2）、AA-A ／ Wisconsin ／588 ／ 2019（H1N1）和 AA-A ／ Cambodia ／ e0826360 ／2020（H3N2），均具有溫度敏感性和冷適應表型，見表2。

表2 溫度敏感性及冷適應表型檢測結(jié)果Tab.2 Test results of temperature sensitivity and cold-adapted phenotype

3 討 論

冷適應流感減毒活疫苗能夠有效激發(fā)細胞免疫及黏膜免疫，產(chǎn)生更為廣泛的免疫反應，具有應對流感病毒抗原變異的潛在優(yōu)勢［10-11］。冷適應流感減毒株能夠在人體鼻腔較低溫度下正常生長，而在下呼吸道39 ℃體溫條件下不能復制。因此，接種冷適應流感減毒活疫苗后，病毒僅在鼻腔等上呼吸道黏膜局部復制，并激發(fā)免疫反應，而不能進入肺臟生長。該疫苗在美國和俄羅斯已使用多年，我國長春百克生物科技股份公司生產(chǎn)的流感減毒活疫苗也已獲批上市。

本研究采用8 質(zhì)粒反向遺傳技術，合成A ／ Ann Arbor ／ 6 ／ 60（H2N2）冷適應流感病毒 PB2、PB1、PA、NP、M 及 NS 6個基因作為骨架，與 PR8 病毒 HA、NA 基因共同進行病毒拯救，經(jīng)雞胚克隆培養(yǎng)2 次，成功制備了AA-PR8 冷適應流感病毒疫苗株。將該病毒在雞胚中進行5 次傳代，所有基因氨基酸位點未發(fā)生突變，具有良好的遺傳穩(wěn)定性。與PR8 野病毒相比，AA-PR8 疫苗株能在26 ℃條件下生長，不能在39 ℃條件下生長，表明該病毒具有溫度敏感性及冷適應表型。本研究還對AA-PR8 疫苗株在小鼠中的減毒特征進行了評價，與接種同等劑量的PR8 野病毒的小鼠相比，接種AA-PR8 疫苗株的小鼠體重降低幅度明顯減小，未發(fā)生動物死亡；肺部病毒載量降低1 000 倍以上。上述結(jié)果表明，AA-PR8 疫苗株降低了對小鼠的致病性，其免疫原性和保護效果仍需要進一步研究。采用該方法，本研究還制備了2020—2021 及2021—2022年度北半球流行的4株甲型流感病毒冷適應疫苗株，初步建立了流感病毒冷適應疫苗株制備及評價平臺。