Shwetha Narayanamoorthy，Harold Corke，李克虎

（1.上海交通大學(xué) 食品科學(xué)與工程系，上海 200240；2.貴州大學(xué) 生物技術(shù)系，貴州 貴陽 550025）

普通豆類（Phaseolus vulgaris）是全球生產(chǎn)最廣泛、最突出的豆類作物之一，經(jīng)濟實惠的同時也是有益健康的營養(yǎng)來源，因此被稱為“窮人的肉”[1]。根據(jù)其形態(tài)、基因型和位置，它們通常被稱為不同的名稱，如海軍藍豆、平豆、蕓豆、法國豆、豆角等。蕓豆是全球消費的最重要的普通豆類，因為它們含有高蛋白質(zhì)含量（20%～25%）、復(fù)合碳水化合物（50%～60%）、礦物質(zhì)，并且是維生素和多不飽和脂肪酸的重要來源[2]。印度是世界上最大的豆類生產(chǎn)國，種植豆類的土地面積約為1 543萬hm2，總產(chǎn)量為639萬t。蕓豆在印度被普遍稱為“Rajma”，主要是因為它們種植在喜馬拉雅山脈西北部，后來也開始在其他地區(qū)種植。蕓豆主要是利用其豆莢和種子的膳食成分，用于印度菜肴及其他亞洲國家的傳統(tǒng)食品和墨西哥菜系，主要形式為主食、沙拉、罐頭食品、烘焙食品[3]。

流行病學(xué)研究顯示，食用蕓豆與降低幾種心血管疾病、II型糖尿病和某些癌癥的風險之間存在正相關(guān)性[4]。蕓豆的這些健康益處都歸因于植物化學(xué)物質(zhì)，其含有大量多酚化合物，其中許多被發(fā)現(xiàn)是有效的抗氧化劑，還具有抗炎、抗動脈粥樣硬化和抗過敏活性。多酚的抗氧化性能是其通過螯合銅/鐵等金屬離子或作為供氫自由基清除劑抑制活性氧物種及其酶形成的能力的結(jié)果[5]。

盡管環(huán)境條件、提取方法、基因型等多種因素可以影響酚類物質(zhì)的含量，但與子葉相比，普通豆類種皮中的酚類物質(zhì)含量更高[6]。從植物和植物產(chǎn)品中獲得的天然抗氧化劑具有很大的潛力，可以用作防腐劑，取代合成抗氧化劑。因此，探索和利用蕓豆種皮中的抗氧化物，有助于開發(fā)蕓豆的食品應(yīng)用價值。

作為一項初步研究，旨在分析主要的5種廣泛食用的印度蕓豆（Rajma）品種的總酚含量和抗氧化活性?？紤]到食用的安全性，用乙醇提取并進行了優(yōu)化，而不是采用甲醇提取，因此這些提取物可以用于食品工業(yè)的進一步開發(fā)。研究的目的是發(fā)現(xiàn)印度本土的高抗氧化菜豆品種。研究結(jié)果可以為蕓豆種皮的開發(fā)利用提供有價值的參考。

1 材料和方法

1.1 植物材料

印度烹飪中常用的5種不同品種的蕓豆，在印度稱為Rajma（表1），購于馬哈拉施特拉邦納維孟買瓦希的APMC食品批發(fā)市場，其中包括黃棕色斑點蕓豆（RB1）、棕紅色長蕓豆（RB2）、淺棕色斑點蕓豆（RB3）、小黑蕓豆（RB4）和小紅蕓豆（RB5）。

植物材料基本信息見表1。

表1 植物材料基本信息

1.2 化學(xué)品和試劑

使用的所有化學(xué)品和試劑均為分析級。2,2-二苯基-1-吡啶酰肼鹽（DPPH）、福林-Cioc試劑（苯酚FCR）、6-羥基-2,5,7,8-四甲基鉻-2-羧酸（Trolox）、2,2'-疊氮（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二銨鹽（ABTS）、2,4,6-三（2-吡啶基）-s-三嗪（TPTZ）、沒食子酸、兒茶素、無水氯化鐵、七水硫酸亞鐵、過硫酸鉀、醋酸鈉、碳酸鈉、亞硝酸鈉、氫氧化鈉、鹽酸、乙醇，HiMedia Laboratories Pvt.Ltd（孟買）提供；甲醇，SRL Chemicals Pvt Ltd.（孟買）提供。

1.3 豆皮提取物的制備和干燥

每種豆類品種150～170 g（取決于所需外殼粉的大小和數(shù)量）在水中浸泡8 h或更長時間，直到完全浸泡。然后剝下種皮并在40～50℃下烘箱干燥過夜，直到干燥。使用電機/混合器（Bajaj Rex 500）全速將干燥的種皮研磨成細粉，并在干燥器中進一步干燥數(shù)小時。將干豆皮粉末與80%乙醇以1∶10（W/V）的比例混合在50 mL錐形管中，錐形管小心地包裹在鋁箔中以保護提取物免受光照，并以180 r/min的轉(zhuǎn)速振蕩混合24 h。然后將混合物以轉(zhuǎn)速3 000 r/min離心15 min。收集上清液，使用Whatman過濾器4過濾，并在-20℃下儲存，以便在4～5 d內(nèi)用于分析（圖1）。提取分3組進行。酚含量測定和抗氧化劑活性定量的計算以干重為基礎(chǔ)。

5個品種種皮80%乙醇提取液見圖1。

我國中小河流眾多，由于人類活動的延伸，目前我國中小河流存在著退化以及山洪災(zāi)害日益加劇的態(tài)勢，進行中小河流治理勢在必行，但是，要從河流本身的自然規(guī)律出發(fā)，堅持生態(tài)水利建設(shè)，由傳統(tǒng)水利向現(xiàn)代水利過渡，本著保持河流水體與河岸的連續(xù)性，保持河岸植物群落多樣性，增進河流生態(tài)系統(tǒng)功能完善化，保持河岸帶功能延伸化，延續(xù)河流的健康生命。

圖1 5個品種種皮80%乙醇提取液

1.4 總酚

1.4.1 總酚含量（TPC）

將100μL適當稀釋的樣品（在80%乙醇中稀釋40倍）添加到500μL 1∶10 W/V Folin-Ciocalteau（FC）試劑中，并在黑暗中培養(yǎng)4 min，對照品為80%乙醇。向這些溶液中添加400μL 75 g/L Na2CO3溶液，并在黑暗中培養(yǎng)2 h，隨后于波長760 nm處測定溶液的吸光度。使用沒食子酸制作標準曲線，質(zhì)量濃度范圍為0.02～0.12 mg/mL（R2=0.998）。結(jié)果以沒食子酸當量（GAE）/g表示。每個樣本重復(fù)測定3次。

1.4.2 總黃酮含量（TFC）

將700μL蒸餾水添加到100μL適當稀釋的樣品中。向這些混合物中添加0.5 mol/L NaNO2溶液30μL并在黑暗中培養(yǎng)6 min。添加0.3 mol/L AlCl3溶液30μL并培養(yǎng)6 min。最后，向試管中添加1 mol/L NaOH溶液200μL并培養(yǎng)15 min，然后于波長510 nm處測定吸光度。使用兒茶素制作標準曲線，質(zhì)量濃度范圍為0.05～0.25 mg/mL（R2=0.999）。結(jié)果以兒茶素當量表示，即CE/g。每個樣本重復(fù)測定3次。

1.5 抗氧化活性

1.5.1 ABTS分析

將7.4 mmol/L ABTS與2.6 mmol/L過硫酸鉀在蒸餾水中混合作為溶劑，并在黑暗中培養(yǎng)過夜（12～16 h）。將1 mL新制備的ABTS試劑與約50 mL 80%甲醇（1∶50 V/V）混合，使溶液的吸光度在734 nm處調(diào)整為0.70±0.02。將10μL適當稀釋的樣品添加到1 mL新鮮ABTS工作溶液中，并在室溫下在黑暗中培養(yǎng)30 min。于波長734 nm處記錄吸光度。使用濃度為0.3～1.5 mmol/L（R2=0.976）的Trolox標準品計算抑制百分比的標準曲線。對樣品進行3次測定。

ABTS+自由基的清除率或抑制率通過以下公式計算：

式中：Abs對照——ABTS+·甲醇的吸光度，即試劑

Abs樣品——種皮提取物的吸光度。抑制濃度（IC50）表示抑制反應(yīng)混合物中生成的50%ABTS+自由基所需的提取物濃度。

1.5.2 DPPH分析

在80%甲醇中制備0.2 mmol/L DPPH自由基試劑，并在制備后立即使用。將100μL適當稀釋的樣品添加到900μL DPPH試劑中，并在黑暗中培養(yǎng)30 min，在波長517 nm處讀取樣品的吸光度。對提取物進行了3次試驗。提取物對DPPH自由基的抑制百分比使用ABTS分析中所述的公式進行計算。使用濃度為0.1～0.5 mmol/L（R2=0.990）的Trolox標準品計算抑制百分比的標準曲線。對樣品進行3次測定。

1.5.3 FRAP分析

以10∶1∶1的比例混合300 mmol/L醋酸鈉緩沖液（pH值3.6）、10 mmol/L TPTZ（2,4,6-三吡啶-s-三嗪）（以40 mmol/L HCl為溶劑）和20 mmol/L FeCl3溶液，以此制備FRAP試劑。將100μL適當稀釋的樣品添加到3 mL新制備的FRAP試劑中，并在室溫下培養(yǎng)4 min。在波長593 nm處對試劑空白測定吸光度。該方法使用的標準溶液為FeSO4.7H2O溶液，濃度范圍為0.2～1.0 mmol/L（R2=0.998）。結(jié)果以m mol Fe（II）/g表示。所有提取物進行3次測定。

1.6 統(tǒng)計分析

所有試驗重復(fù)3次，結(jié)果以平均值±標準偏差（SD）表示。所有基本分析和圖表均使用MS Excel（v16.0）。使用IBMSPSS對Duncan多范圍檢驗后的值進行單向方差分析（ANOVA），以比較不同組之間的平均值。使用SPSS對測試參數(shù)進行Pearson相關(guān)分析。

2 結(jié)果和分析

總酚含量（TPC）表示為每克干質(zhì)量種皮粉的沒食子酸當量。試驗獲得的值范圍為7～142 mg GAE/g，最高值為RB5，即紅色小粒品種，最低值為黑色小粒品種。標記為RB1和RB3的黃棕色和淺棕色斑點豆為90～100 mg GAE/g時，也顯示出相當高的TPC含量。以兒茶素當量表示的總黃酮含量（TFC）也有類似的趨勢。RB 5的最高值為30 mg CE/g樣品，其次是斑點RB1和RB3，分別為17和20 mg CE/g。RB2和RB4的均在10 mg CE/g左右（表2）。這些結(jié)果與前人的報道一致[7-8]。

FRAP分析最初由Benzie和Strain（1996）開發(fā)，用于測量血漿中的還原能力，但隨后開始用于測定植物中的抗氧化劑。試驗中，還原力最高的是RB5 1 171.78 mmol Fe（II）/g，其次是斑點品種RB3（679 mmol Fe（II）/g）、RB1 638 mmol Fe（II）/g和RB2 511.6 mmol Fe（II）/g，最小的是RB4 161.5 mmol Fe（II）/g（表2）。趨勢幾乎與TPC/TFC中觀察到的趨勢相似。

ABTS自由基溶于水和有機溶劑，不受離子強度的影響。因此，可以在多種介質(zhì)中用于測定體液或樣品提取物的親脂性和親水性抗氧化能力（Prior et al.，2005）。2,2-二苯基-1-吡啶酰肼（DPPH）自由基是一種穩(wěn)定的有機氮自由基，呈深紫色。該分析主要基于電子轉(zhuǎn)移反應(yīng)和進一步的氫原子提取。這兩種分析的基本概念是測量抗氧化劑對DPPH自由基的還原能力，通過測定吸光度的變化進行分析。ABTS和DPPH均以Trolox當量的mmol/g干粉表示。RB 5表現(xiàn)出最高的ABTS（1 897 mmol TE/g）和DPPH（1 191 mmol TE/g）值。斑點品種RB1和RB3分別在ABTS（1 076和1 251 mmol TE/g）和DPPH（1 105和1 022 mmol TE/g）測試中顯示出非常高的抗氧化能力，但它們之間沒有顯著差異，這表明它們在抗自由基活性方面具有相似性（表2）。其次，RB2（ABTS，780 mmol TE/g；DPPH，806 mmol TE/g）和RB 4顯示最低值（ABTS，462 mmol TE/g；DPPH，553 mmol TE/g），這與TPC/TFC中觀察到的趨勢一致。而相關(guān)性分析的結(jié)果也表明，抗氧化性指標兩兩間均存在顯著的正相關(guān)（p＜0.01）（表3）。

5個印度蕓豆品種的總酚含量及抗氧化力比較見表2，抗氧化性參數(shù)相關(guān)性分析結(jié)果見表3。

表2 5個印度蕓豆品種的總酚含量及抗氧化力比較

表3 抗氧化性參數(shù)相關(guān)性分析結(jié)果

為了了解提取物對自由基的抑制程度，繪制了自由基抑制百分比圖（圖2、圖3）。結(jié)果表明，RB5的自由基清除率為71%（ABTS）和88.8%（DPPH），在測試樣品種最高。RB5的IC50（50%自由基抑制）值經(jīng)計算得出約為17.6μLg/mL，而BHA（丁基羥基茴香醚）和BHT（丁基羥基甲苯）的IC50值分別為112μg/mL和202μg/mL。因此，RB5的IC50大約是食品工業(yè)中常用合成抗氧化劑的5倍。為了驗證這一結(jié)果，還需要在不同的試驗參數(shù)下與其他商用抗氧劑進行進一步的研究和對比分析。

ABTS抗氧化力及自由基清除率見圖2，DPPH抗氧化力及自由基清除率見圖3。

圖2 ABTS抗氧化力及自由基清除率

圖3 DPPH抗氧化力及自由基清除率

3 結(jié)論

研究分析的Rajma品種TPC、FRAP和ABTS的下降順序為RB5＞RB3＞RB1＞RB2＞RB4（1和3之間無顯著差異），TFC和DPPH的下降順序為RB5＞RB1＞RB3＞RB2＞RB4。考慮到顯著差異（表2），可以得出結(jié)論，RB 5，即小紅蕓豆的抗氧化性高，而RB 4（黑色小蕓豆）表現(xiàn)出最低的抗氧化活性。如Pearson相關(guān)矩陣所示，TPC、TFC和所有抗氧化劑測定值之間存在顯著的正相關(guān)（p＜0.01）。后續(xù)研究，可以以RB 5為試材，進一步評估其種皮提取物在食品著色劑、抗氧化劑配方和用于食品包裝系的聚合物基薄膜中的應(yīng)用。