吳家碧，蔡曉霞，陳葉蘭，李 露

（湯臣倍健股份有限公司，廣東珠海 519040）

0 引言

益生菌是一種攝取適當量后，能對食用者健康發(fā)揮有益作用的活菌[1-2]，通過其中活菌的作用可以改善胃、腸道內(nèi)微生態(tài)的平衡[3-4]，抑制病原菌的生長，從而促進身體健康，一般認為其活數(shù)要在106CFU/g（mL）以上才能對人體產(chǎn)生益處[5-7]。然而，目前市場上混合益生菌粉的品種類很多，人們忽視了準確檢測活性益生菌產(chǎn)品中乳酸菌活菌數(shù)的方法，導致市場上許多產(chǎn)品的乳酸菌活菌數(shù)偏差大或難以檢出[8-9]。

目前，對益生菌產(chǎn)品的檢驗方法主要是我國食品藥品監(jiān)督管理局于2016年12月發(fā)布GB 4789.35—2016《食品安全國家標準食品微生物學檢驗 乳酸菌檢驗》乳酸菌的檢驗方法[10]，很多混合益生菌活菌數(shù)產(chǎn)品都超過100×108CFU/g，益生菌原料超過1 000×108CFU/g，原料活菌數(shù)大，成品添加各種輔料，按方法里規(guī)定的稀釋方法、時間和稱樣量，稱量25 g加225 mL生理鹽水混合，體積大，混合效果差；直接混合，樣品可能有結(jié)塊、無法全部分散、混合時間太短、樣品混合不均勻的風險，無法準確檢測乳酸菌活菌數(shù)，因此固體原料稱量10 g樣品加90 mL生理鹽水，用250 mL離心管加玻璃珠混合，體積合適，混合效果好；加玻璃珠混合，能加快樣品的分散，混合效果好；混合4～9 min，能保證樣品混合均勻，且對檢測結(jié)果無影響[11-12]。

建立一個可靠、準確檢測乳酸菌活菌數(shù)的檢測方法，優(yōu)化試驗過程，可以減少因試驗誤差帶來的食品安全問題。

1 器材與方法

1.1 儀器材料

旋渦振蕩器、移液器（1，10 mL）、勻漿儀、勻漿杯、潔凈工作臺、生化培養(yǎng)箱（36±1℃）、高壓滅菌器、電子天平、離心管、量筒、玻璃珠（直徑5 mm）、一次性培養(yǎng)皿（φ90 mm）、厭氧盒、厭氧產(chǎn)生劑、厭氧指示劑、秒表等。

1.2 試劑及樣品

（1）試劑及培養(yǎng)基。MRS培養(yǎng)基、莫匹羅星鋰，均為北京陸橋公司提供；無菌生理鹽水。

（2）混合益生菌原料。乳酸菌粉A、乳酸菌粉B、乳酸菌粉C、乳酸菌粉P。

（3）益生菌成品。益生菌固體飲料1（a型，b型，c型，d型）、益生菌粉2、益生菌固體飲料3（e型，f型）、益生菌粉4、益生菌固體飲料5、益生菌固體飲料6。

1.3 試驗優(yōu)化方案及試驗方法

1.3.1 樣品前處理優(yōu)化

稱樣、均質(zhì)和供試液制備時間優(yōu)化前后對比見表1。

表1 稱樣、均質(zhì)和供試液制備時間優(yōu)化前后對比

1.3.2稀釋液配制方法

配制稀釋溶液時，稱取8.5 g氯化鈉到1 000 mL的燒杯中，用純化水完全溶解后，分裝255 mL于500 mL三角瓶中，于121℃條件下滅菌30 min。優(yōu)化前9 mL試管水采用先分裝好、再滅菌的方式進行，優(yōu)化后采用先滅菌、后分裝，避免滅菌過程中蒸發(fā)損耗，保證分裝量更準確。

1.3.3 供試液制備方法

（1）原料。稱取10 g置于300 mL勻漿杯或250 mL離心管中，準確量取90 mL無菌生理鹽水加入勻漿杯或離心管中，離心管加40顆直徑5 mm玻璃珠；勻漿儀以轉(zhuǎn)速13 000 r/min均質(zhì)5～8 min或離心管在漩渦振蕩器以轉(zhuǎn)速3 000 r/min均質(zhì)5～9 min，充分混勻制成1∶10的樣品勻質(zhì)液。

（2）成品。稱取25 g置于勻漿杯或500 mL離心管中，準確量取225 mL無菌生理鹽水加入勻漿杯或離心管中，離心管加40顆直徑5 mm玻璃珠；用勻漿儀以轉(zhuǎn)速13 000 r/min均質(zhì)3～8 min或離心管在漩渦振蕩器以轉(zhuǎn)速3 000 r/min均質(zhì)4～8 min，充分混勻制成1∶10的樣品勻質(zhì)液。

1.3.4 梯度稀釋方法

用移液器取1∶10樣品勻液1 mL，加入9 mL無菌生理鹽水稀釋液中，制成1∶100樣液，之后按10倍遞增關(guān)系稀釋，每次稀釋時以轉(zhuǎn)速3 000 r/min旋渦振蕩器振搖20 s，根據(jù)對待檢樣品活菌數(shù)含量的估計，選擇3個連續(xù)的適宜稀釋度，每個稀釋度吸取1 mL樣品勻質(zhì)液于滅菌平皿內(nèi)，每個稀釋度做2個平皿。

1.3.5 傾注培養(yǎng)基及培養(yǎng)方法

（1）乳酸菌總數(shù)。將冷卻至48℃的MRS瓊脂培養(yǎng)基傾注入平皿約15 mL，順時針和逆時針方向各旋轉(zhuǎn)5次使其混合均勻，待平皿凝固后，迅速裝入?yún)捬鹾兄?，?6±1℃下厭氧培養(yǎng)72±2 h。從樣品稀釋到平板傾注要求在15～17 min內(nèi)完成。

（2）雙歧桿菌。將冷卻至48℃半胱氨酸鹽酸鹽改良的MRS培養(yǎng)基，按比例加入莫匹羅星鋰鹽[13]，充分混勻，傾注入平皿約15 mL，順時針和逆時針方向各旋轉(zhuǎn)5次使其混合均勻，待平皿凝固后，迅速裝入?yún)捬鹾兄?，?6±1℃條件下厭氧培養(yǎng)72±2 h。從樣品稀釋到平板傾注要求在15～17 min內(nèi)完成[14]。

（3）嗜熱鏈球菌。將冷卻至48℃的MC培養(yǎng)基傾注入平皿約15 mL，順時針和逆時針方向各旋轉(zhuǎn)5次使其混合均勻，待平皿凝固后，于36±1℃條件下有氧培養(yǎng)72±2 h。從樣品稀釋到平板傾注要求在15～17 min內(nèi)完成。

1.3.6 結(jié)果計數(shù)方法

MRS瓊脂培養(yǎng)基上記錄所有菌落數(shù)，MC培養(yǎng)基上記錄菌落中等偏小，邊緣整齊光滑的紅色菌落，直徑2±1 mm，菌落背面為粉紅色[15]。

2 試驗優(yōu)化前后及結(jié)果對比分析

2.1 均質(zhì)方式的優(yōu)化前后結(jié)果對比

傳統(tǒng)益生菌檢測，由于益生菌菌含量高，使用的均質(zhì)方式無法使樣品中益生菌完全混合均勻，導致檢測結(jié)果不準確。

現(xiàn)優(yōu)化益生菌前處理方式，將均質(zhì)袋換成500 mL離心管，同時加入約40顆5 mm的玻璃珠，以轉(zhuǎn)速3 000 r/min旋渦振蕩器振搖加快混合，同時對比使用均質(zhì)袋混合方式，選取混合益生菌A原料對比發(fā)現(xiàn)，優(yōu)化前樣品混合不均勻，稀釋梯度不成比例，優(yōu)化后結(jié)果準確穩(wěn)定。

混合益生菌不同均質(zhì)方式乳酸菌總數(shù)結(jié)果統(tǒng)計見表2。

表2 混合益生菌不同均質(zhì)方式乳酸菌總數(shù)結(jié)果統(tǒng)計

2.2 供試液制備時間優(yōu)化前后結(jié)果對比

由于乳酸菌在相對受限制的環(huán)境中存活時間有限。因此，在前處理稀釋液中時間不同，太短會出現(xiàn)樣品混合不均勻，太長會出現(xiàn)乳酸菌死亡現(xiàn)象，將導致乳酸菌檢出值和真實值差別很大。

選擇益生菌固體飲料5，按成品益生菌檢測方式進行檢測，用離心管+玻璃珠前處理，前處理時間分別為2.0，4.5，8.0 min。對檢測結(jié)果進行對比，發(fā)現(xiàn)按不同前處理時間稀釋，檢測結(jié)果相差大，稀釋2 min時，樣品均質(zhì)不均勻，導致檢驗結(jié)果不成稀釋比例；稀釋時間為8 min，雙歧桿菌活菌數(shù)檢測結(jié)果下降2個對數(shù)值；稀釋時間為4.5 min時，能準確檢測雙歧桿菌活菌數(shù)結(jié)果。

益生菌固體飲料5-雙歧桿菌檢測參數(shù)及結(jié)果見表3。

表3 益生菌固體飲料5-雙歧桿菌檢測參數(shù)及結(jié)果

（3）根據(jù)大量試驗驗證，總結(jié)出各種混合益生菌粉的均值方式參數(shù)和時間。

各種混合益生菌粉均質(zhì)方法及時間統(tǒng)計見表4。

表4 各種混合益生菌粉均質(zhì)方法及時間統(tǒng)計

2.3 益生菌原料稱樣量的優(yōu)化前后結(jié)果對比

由于益生菌原料活菌數(shù)大，活菌數(shù)一般都在1 000×108CFU/g以上，稱量25 g加225 mL生理鹽水用均質(zhì)袋稀釋，均值不均勻和檢驗結(jié)果偏差大，用500 mL離心管混合，體積太大，無法形成漩渦，混合效果差，存在混合不均勻。

取3批混合乳酸菌粉C原料，現(xiàn)按國標要求稱樣量25 g，與稱樣量改成10 g進行檢驗比對，結(jié)果發(fā)現(xiàn)當稱樣量為25 g時，樣品混合不均勻，出現(xiàn)梯度稀釋結(jié)果不成比例，稱樣量為10 g時，檢出率100%，另取一批益生菌粉P原料進行10次重復性試驗。檢驗相對標準偏差小于15%。

混合益生菌原料不同稱樣量乳酸菌總數(shù)結(jié)果統(tǒng)計見表5，益生菌粉P原料原料檢測改善前參數(shù)及結(jié)果見表6。

表5 混合益生菌原料不同稱樣量乳酸菌總數(shù)結(jié)果統(tǒng)計

表6 益生菌粉P原料原料檢測改善前參數(shù)及結(jié)果

2.4 梯度稀釋使用試管水體積的優(yōu)化前后結(jié)果對比

（1）梯度稀釋用的生理鹽水用玻璃試管裝，先分裝成9 mL/支后滅菌，滅菌過程水分蒸發(fā)體積減

少，試驗結(jié)果準確度不夠，試驗結(jié)果重復性差。

（2）改善后使用的是塑料試管，生理鹽水先滅菌后分裝，體積準確，試驗結(jié)果重復性好。塑料試管為帶蓋試管，密封性良好，可于121℃高溫高壓滅菌，臨用前用移液槍準確量取已滅菌的生理鹽水備用，避免滅菌過程中水分汽蒸發(fā)而導致稀釋液體積減少導致試驗誤差，經(jīng)過3批原料2次驗證，改善后的重復性良好，2次試驗的對數(shù)差值都小于0.25。

乳酸菌粉A原料試管水優(yōu)化前后重復性檢測結(jié)果對比統(tǒng)計見表7。

表7 乳酸菌粉A原料試管水優(yōu)化前后重復性檢測結(jié)果對比統(tǒng)計

3 結(jié)論

通過優(yōu)化檢測方法，有效提高混合益生菌粉中乳酸菌活菌數(shù)的檢驗準確率，根據(jù)不同樣品活菌數(shù)的量，通過改善稀釋容器及均質(zhì)參數(shù)，離心管在漩渦振蕩以上能形成很好的漩渦，加上玻璃珠，能將樣品充分分散均勻，合理延長均質(zhì)時間，能保證樣品混合均勻，且對檢測結(jié)果無影響；勻漿儀增加均質(zhì)轉(zhuǎn)數(shù)，13 000 r/min合理延長均質(zhì)時間，能保證樣品混合均勻，且對檢測結(jié)果無影響；優(yōu)化稀釋液的分裝，滅菌后分裝，稀釋液體積更準確，保障混合益生菌原料及成品的檢測結(jié)果值準確、穩(wěn)定，重復性好。該方法前處理過程較長，梯度稀釋時，動作要連貫及快速，每次只能處理一個樣品，提高檢測質(zhì)量，減少試驗誤差。