王靜鄭好胡清強(qiáng)張玉婷孔旭輝汪羽儲(chǔ)九圣龐秀紅*

1南京醫(yī)科大學(xué)附屬泰州市人民醫(yī)院耳鼻咽喉-頭頸外科（江蘇 225300）

2大連醫(yī)科大學(xué)（遼寧 116027）

3南通大學(xué)醫(yī)學(xué)院（江蘇 226019）

耳-腭-指綜合征譜系疾病（Oto-palato-digital syndrome spectrum disorders,OPDSD）是一類罕見X連鎖顯性遺傳性綜合征型耳聾[1]，其特征性表型主要涉及耳聾、顱面畸形及指趾畸形等多個(gè)方面，具體包括：耳聾、腭裂、前額突出、眼瞼下垂、指趾畸形、胸廓畸形等[2]。目前分為以下五個(gè)綜合征：耳-腭-指（趾）綜合征1型（OPD1,OMIM#311300）、耳-腭-指（趾）綜合征2型（OPD2,OMIM#304120）、Melnick-Needles綜合征（MNS,OMIM#309350）、FMD1(OMIM#305620)和DCD(OMIM#300244)。其中，OPD1和OPD2合稱為耳-腭-指綜合征（Otopalato-digital syndrome,OPDS）[2,3]。男性患者表型嚴(yán)重程度與亞型有關(guān)：OPD2和MNS男性患者表型較重，在胚胎時(shí)期死亡或出生不久死亡；而OPD1和FMD1的男性患者可以存活且臨床表型較輕微。對(duì)于女性，由于具有不同程度X染色體失活，患者表型特征差異性很大。因此，如果一個(gè)家系內(nèi)沒有男性患者，很難區(qū)分OPD1和OPD2[4-6]。另外，OPDS基因型和表型異質(zhì)性都很高，同一基因位點(diǎn)突變會(huì)有不同的表型，而同一表型也有可能是由不同突變位點(diǎn)所導(dǎo)致。

FLNA(#OMIM,300017)，位于 X染色體，包含48個(gè)外顯子，編碼細(xì)絲蛋白A（Filamin A），分子量為280KD，長度為160nm，含有2647個(gè)氨基酸[7]。Filamin A是一種肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白，由兩個(gè)亞基自行連接形成二聚體，整個(gè)蛋白分子呈現(xiàn)“V”字形，每個(gè)亞基都含有N端的肌動(dòng)蛋白結(jié)合域（ABD）和24個(gè)重復(fù)β-折疊片層結(jié)構(gòu)。這24個(gè)重復(fù)片層結(jié)構(gòu)被兩個(gè)鈣蛋白酶敏感性區(qū)域分成三部分：桿1區(qū)域、桿2區(qū)域和自行連接區(qū)[8]，而N端的肌動(dòng)蛋白結(jié)合域（ABD）則由CH1和CH2組成[9]。亞基上的肌動(dòng)蛋白結(jié)合位點(diǎn)和伴侶蛋白結(jié)合位點(diǎn)參與調(diào)控細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、維持細(xì)胞骨架等多種細(xì)胞活動(dòng)[10]。Filamin A結(jié)構(gòu)復(fù)雜性決定OPDS表型多樣性[5]。目前所報(bào)道致病突變約340個(gè)，其中38個(gè)與OPD1相關(guān)（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar）。

本課題組前期收集到一例中國漢族人群疑似OPDS家系成員樣本，該家系三代內(nèi)共有7名患者具有OPDS典型表型。本研究擬利用目前常用測序技術(shù)對(duì)該家系遺傳致病性因素進(jìn)行探尋，從而為遺傳咨詢和婚育指導(dǎo)提供理論依據(jù)，實(shí)現(xiàn)OPDS綜合征型耳聾的一級(jí)預(yù)防。

1 材料與方法

1.1 倫理聲明

本研究涉及到的先證者及家系成員均收集于泰州市人民醫(yī)院耳鼻咽喉-頭頸外科，所有患者或法定監(jiān)護(hù)人均同意參與本研究并簽署書面知情同意書。本研究得到了泰州市人民醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，并符合“赫爾辛基宣言”。

1.2 病史詢問及體格檢查

本課題組前期所收集中國漢族疑似OPDS綜合征家系的三代成員中均有患者。先證者為16歲女性，因“雙耳聽力下降、特殊面容、指趾畸形”就診于泰州市人民醫(yī)院耳鼻咽喉-頭頸外科門診。經(jīng)詳細(xì)病史詢問，發(fā)現(xiàn)該先證者外祖母（已離世）、母親及母親其他四個(gè)姐妹均存在類似臨床表型。對(duì)自愿參與研究的患病先證者III-1、母親II-2、姨媽II-3以及正常表型父親II-1和弟弟III-2進(jìn)行全面體格檢查，特別注意顱面部、耳科、眼科、骨骼系統(tǒng)等方面表型特征。利用顳骨高分辨電子計(jì)算機(jī)斷層掃描（HRCT）以檢查內(nèi)耳及中耳可能異常。利用全身數(shù)字化X射線攝影進(jìn)行骨骼檢查；利用純音測聽、聲導(dǎo)抗等進(jìn)行聽力學(xué)檢查（圖1）。

圖1 家系圖。正方形：男性；圓形：女性；白色圖形：正常聽力家系成員；黑色圖形：患者；黑色箭頭：先證者。Fig.1 Pedigree of a family.Square:male;Circle:female;White figure:normal hearing family members;Black figure:patients;Black arrow:proband.

1.3 采集外周靜脈血及抽提DNA

EDTA抗凝管采集自愿參與研究的家系成員III-1、III-2、II-1、II-2和II-3外周靜脈血各4ml。血液基因組DNA提取試劑盒（DP318-03，北京天根生化科技有限公司）抽提DNA。NanoDrop2000測定DNA濃度，-20℃保存?zhèn)溆肹11]。

1.4 三大常見耳聾基因全序列篩查

利用先證者樣本對(duì)中國漢族人群三大常見耳聾基因GJB2、SLC26A4及MT-RNR1所有編碼外顯子及其側(cè)翼序列進(jìn)行篩查，利用Sanger測序技術(shù)對(duì)凝膠電泳鑒別成功的PCR原液進(jìn)行一代測序，利用Sequencher5.4軟件進(jìn)行結(jié)果判讀[12,13]。

1.5 所有已知耳聾基因外顯子靶向捕獲二代測序

對(duì)常見耳聾基因篩查未發(fā)現(xiàn)致病突變的先證者樣本，利用外顯子靶向捕獲二代測序技術(shù)對(duì)406個(gè)已知耳聾基因進(jìn)行篩查。

選取3μg外周血DNA樣本，打斷為150 bp小樣本，經(jīng)補(bǔ)平、純化、添加A堿基、連接adaptor、PCR擴(kuò)增等步驟得到最終DNA文庫。將DNA文庫與相關(guān)液相捕獲試劑盒混合，經(jīng)吸附、洗脫等步驟得到目的基因片段。對(duì)406個(gè)已知耳聾基因外顯子及其側(cè)翼序列進(jìn)行高通量測序[14]。

去除原始短序列中的接頭和低質(zhì)量數(shù)據(jù)后利用工具軟件對(duì)可疑突變進(jìn)行相關(guān)注釋，最終得到候選致病突變[14]。

1.6 家系內(nèi)驗(yàn)證及致病性分析

利用Sanger測序?qū)梢慑e(cuò)義突變進(jìn)行家系成員內(nèi)驗(yàn)證，對(duì)基因型-表型共分離位點(diǎn)進(jìn)行多物種保守性分析，并利用 SIFT、Polyphen2、Mutation Taster、PROVEAN等蛋白質(zhì)功能預(yù)測軟件進(jìn)行致病性預(yù)測。

2 結(jié)果

2.1 臨床表型

本研究家系所有患者均具有耳聾、特殊面容及指趾畸形等OPDS典型表型。先證者III-1自出生便具有OPDS特殊面容，包括前額突出、眼距寬大、眼瞼下垂等（圖2）；2歲時(shí)發(fā)現(xiàn)雙側(cè)傳導(dǎo)性聽力下降（圖3），否認(rèn)耳毒性藥物使用史及急慢性中耳炎等導(dǎo)致聽力下降疾病史；另外，先證者具有雞胸、“帶狀”肋骨、杵狀指、跖趾畸形等骨骼畸形（圖2）。有趣的是，先證者還具有牙齒早脫這一罕見表型。先證者母親II-2和姨媽II-3均有先證者特殊面部表型及不同程度混合性聽力下降。先證者父親（II-1）和弟弟（III-2）未發(fā)現(xiàn)異常表型。

圖2 先證者表型。a）胸部DR：白色箭頭：“帶狀”肋骨畸形；b）特殊面容：白色實(shí)線箭頭：前額突出；白色虛線箭頭：眼瞼下垂；黑色箭頭：小頜畸形。c）和f）手指表型及影像學(xué)表現(xiàn)：白色箭頭：杵狀指；黑色箭頭：手指彎曲畸形。d）和g）跖趾表型及影像學(xué)表現(xiàn)：跖趾彎曲畸形。e）顳骨HRCT：白色箭頭：聽小骨畸形。Fig.2 Phenotype of proband.a)DR in Chest:The white arrow indicates“ribbon”ribs;b)Special facial features:The white solid arrow represents prominent forehead;White dotted arrow represents drooping eyelid;Black arrow represents micrognathia;c)and f)Phenotypes and Radiologic images of fingers:The white arrows indicate Clubbing fingers and black arrows indicate finger bending;d)and g)Phenotypes and Radiologic images of feet and toes:Toe bending deformity;e)HRCT of temporal bone:The white arrow represents auditory ossicular deformity.

圖3 純音測聽結(jié)果。BC：骨導(dǎo)；AC：氣導(dǎo)。Fig.3 Pure tone audiometry.BC:bone conduction;AC:air conduction.

2.2 三大常見耳聾基因全序列篩查

對(duì)先證者DNA樣本進(jìn)行三大常見耳聾基因GJB2、SLC26A4及MT-RNR1全序列篩查，未發(fā)現(xiàn)任何致病突變。

2.3 已知耳聾基因二代檢測

先證者DNA樣本406個(gè)已知耳聾基因外顯子捕獲二代測序發(fā)現(xiàn)FLNA基因5號(hào)外顯子雜合突變c.799G＞A(p.A267T)。Sanger測序家系內(nèi)驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)該突變?cè)谒凶栽竻⑴c本研究的家系成員中呈現(xiàn)基因型-表型共分離，及患病先證者（III-1）、母親（II-2）及姨媽（II-3）攜帶FLNA基因p.A267T突變，而表型正常的父親（II-1）和弟弟（III-2）則未發(fā)現(xiàn)攜帶（圖4）。

圖4 突變峰圖。Fig.4 Chromatograms of the core family.

2.4 致病性分析

FLNA基因c.799G＞A(p.A267T)突變?yōu)榫幋a區(qū)第799個(gè)核苷酸鳥嘌呤變異為腺嘌呤，導(dǎo)致第267位點(diǎn)的丙氨酸變異為蘇氨酸。

1000Genomes、gnomAD和Exome Variant Server數(shù)據(jù)庫無該位點(diǎn)信息。SIFT、PROVEAN、Mutation Taster及PolyPhen-2等軟件預(yù)測結(jié)果顯示致病可能性大（表1）。保守性分析顯示位點(diǎn)p.A267在人、小鼠、大鼠、牛、獼猴及非洲蟾蜍物種中呈現(xiàn)高度保守（圖5）。

圖5 FLNA基因多物種保守性分析顯示位點(diǎn)p.A267在多物種中高度保守。Fig.5 Multi-species conservative analysis of FLNA showing the highly conserved A267 residue(pointed by the arrow).

表1 該家系FLNA基因的致病性變異分析結(jié)果Table 1 Computational analysis of the p.A267T mutation in FLNA

3 討論

OPDS是一類以不同程度骨-軟骨發(fā)育不良為特征同時(shí)伴有骨外表現(xiàn)的一類疾病，其典型表型包括耳聾、面部畸形和指趾畸形等100余種[1]。本研究先證者具有雙側(cè)傳導(dǎo)性耳聾、前額突出、眼距寬大、眼瞼下垂和指趾畸形等表型，與既往文獻(xiàn)報(bào)道OPDS患者特征性表型高度吻合[2]。另外，患者還具有“牙齒早脫”表型，既往文獻(xiàn)報(bào)道OPDS患者具有“牙列不齊、缺齒”等牙齒發(fā)育不良的表型[15,16]，但并未有過“牙齒早脫”的報(bào)道，推測其也屬于OPDS牙齒發(fā)育不良表型之一。而先證者母親及姨媽并無“牙齒早脫”，提示本研究家系內(nèi)表型具有異質(zhì)性，再次證實(shí)既往研究成果[1]。OPD2亞型男性患者具有幼年致死性，患者往往胚胎時(shí)期死亡或出生后不久死亡。而OPD1亞型男性患者表型較輕微且可以成活。在女性患者中，由于FLNA基因具有不同程度X染色體失活，表型更加復(fù)雜多變。兩種亞型主要鑒別依據(jù)為患病家系中是否具有男性患者，如有男性患病成員能成活且表型較輕微則該家系為OPD1可能性較大；如有男性患病成員但胚胎時(shí)期或者幼年死亡且表型較嚴(yán)重，則該家系為OPD2可能性較大，如無男性患病成員則很難確定疾病亞型[17]。本研究家系內(nèi)無男性患者，但鑒于該家系內(nèi)所有患病女性成員表型輕微，且正常生活存活至今，因此推測該家系為OPD1的可能性較大。

迄今為止，F(xiàn)LNA基因p.A267T變異僅在歐洲人群的OPDS家系中報(bào)道一次，推測該位點(diǎn)可能與OPDS相關(guān)，未進(jìn)行致病性分析及致病性基礎(chǔ)研究[18]。發(fā)現(xiàn)該變異在多物種中位于絕對(duì)保守區(qū)域（圖 5），SIFT、PROVEAN、Mutation Taster及 Poly-Phen2等工具軟件預(yù)測其致病可能性大（表1）。本研究首次在中國漢族人群中發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)變異并提出其很可能為OPDS的致病突變，理由如下：1）在表型高度疑似OPDS家系中發(fā)現(xiàn)與OPDS相關(guān)的致病基因FLNA錯(cuò)義變異；2）該錯(cuò)義變異在家系內(nèi)呈現(xiàn)基因型-表型共分離；3）既往報(bào)道中該變異亦與OPDS相關(guān)；4）工具軟件致病性預(yù)測提示致病可能性大。本研究進(jìn)一步為FLNA基因p.A267T變異導(dǎo)致OPDS提供了依據(jù)，該變異很可能為本研究家系遺傳性病因。

前期研究發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致OPDSD的突變類型一般為點(diǎn)突變和小片段缺失。這些突變并不影響Filamin A的豐度，而是導(dǎo)致蛋白介導(dǎo)某些功能的改變。另外，F(xiàn)LNA基因突變位點(diǎn)具有明顯區(qū)域差異，如OPD1突變位點(diǎn)集中在外顯子3、4或5；OPD2突變位點(diǎn)集中于外顯子4、5或29等[17]。變異p.A267T位于5號(hào)外顯子，編碼CH2區(qū)域附近。發(fā)生在CH2區(qū)域的突變會(huì)導(dǎo)致Filamin A磷酸化增加及干擾肌動(dòng)蛋白與Filamin A相互作用，從而導(dǎo)致肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架不穩(wěn)定和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中斷[17]。既往，CH2區(qū)域的c.760G＞A變異破壞ABD結(jié)構(gòu)域中的負(fù)性調(diào)控元件，從而增強(qiáng)Filamin A對(duì)肌動(dòng)蛋白的結(jié)合作用，即功能增益效應(yīng)[17,19]。本研究所發(fā)現(xiàn)的FLNA基因p.A267T正位于CH2區(qū)域附近，并且很接近既往報(bào)道的c.760G＞A突變位點(diǎn)，因此推測其致病機(jī)制很可能也與功能增益效應(yīng)相關(guān)。為明確該突變位點(diǎn)深在致病機(jī)制，本課題組擬構(gòu)建FLNAc.799G＞A突變敲入小鼠模型進(jìn)行在體功能研究。接下來，本研究將對(duì)該突變致病機(jī)制進(jìn)行基礎(chǔ)性研究，從而進(jìn)一步明確具體致病機(jī)制。

OPDS遺傳方式為X連鎖顯性遺傳，其后代患病率為50%，以此為依據(jù)對(duì)本研究家系進(jìn)行遺傳咨詢和婚育指導(dǎo)。本研究所發(fā)現(xiàn)FLNAc.799G＞A雜合突變很可能為先證者及其家系患病成員遺傳性病因。根據(jù)X連鎖顯性遺傳規(guī)律，家系患病成員后代50%機(jī)率患病，后代患病風(fēng)險(xiǎn)高。建議利用胚胎植入前診斷、無創(chuàng)或有創(chuàng)產(chǎn)前診斷等技術(shù)避免后代耳聾，從而實(shí)現(xiàn)OPDS綜合征耳聾的一級(jí)預(yù)防[20,21]。

4 結(jié)論

FLNA基因c.799G＞A(p.A267T)變異很可能為本研究高度疑似OPDS家系的遺傳性致病性因素。氨基酸改變所致功能增益效應(yīng)很可能為該變異潛在致病機(jī)制，其深在致病機(jī)制將進(jìn)一步利用FLNAc.799G＞A突變敲入小鼠模型進(jìn)行探索。根據(jù)家系患病成員表型嚴(yán)重程度和變異位點(diǎn)所在區(qū)域，該家系很有可能為OPD1。根據(jù)X連鎖顯性遺傳性特點(diǎn)對(duì)該家系進(jìn)行遺傳咨詢和婚育指導(dǎo)，從而實(shí)現(xiàn)OPDS綜合征性耳聾的一級(jí)預(yù)防。