黃寶美，張 梅，吳嘉欣，王 茂

(綿陽師范學(xué)院化學(xué)與化學(xué)工程學(xué)院，四川綿陽 621000)

0 引言

結(jié)晶紫是三苯甲烷染料中的一種，因其成本低、效率高而被廣泛應(yīng)用于水缸魚和魚卵中的外源真菌和寄生蟲的控制[1].現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明非法使用結(jié)晶紫會(huì)影響人體免疫系統(tǒng)和生殖系統(tǒng).目前，歐盟、美國、中國等許多國家都要求在水產(chǎn)養(yǎng)殖中限量使用結(jié)晶紫[2].因此，建立一種檢測水產(chǎn)品中結(jié)晶紫的高靈敏度的測定方法具有重要意義.

目前測定結(jié)晶紫的方法主要有：高效液相色譜[3]、氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)[4]和毛細(xì)管電泳(CE)[5]等.其中靈敏度高、線性范圍寬的高效液相色譜法是測定結(jié)晶紫最常用的方法.由于水產(chǎn)品中成分復(fù)雜，基質(zhì)干擾物多，因此必須在分析檢測前選擇合適的樣品前處理技術(shù)以分離富集樣品中的目標(biāo)化合物，如固相萃取[6]、磁萃取[7]、液-液微萃取(LLME)[8]和冷誘導(dǎo)聚集微萃取(CIAME)[9]等.

三維石墨烯(3D-GN)是碳納米材料的胞狀晶格結(jié)構(gòu)，具有較大的石墨層平面，獨(dú)特的二維結(jié)構(gòu)和孔徑分布.其比表面積可高達(dá)2 630 m2/g，具有良好的化學(xué)穩(wěn)定性、機(jī)械性能和非常高的吸附能力，是最有潛力的吸附材料之一，在水吸附和凈化處理方面具有良好的應(yīng)用前景[10]，能更有效地去除水污染物中的結(jié)晶紫.本文以3D-GN為固相萃取劑，利用高效液相色譜-固相萃取聯(lián)用技術(shù)對魚樣中結(jié)晶紫殘留量的檢測進(jìn)行了研究，該方法原理簡單，測定速度快，方便操作，為大規(guī)模檢測提供方法參考.

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

LC-20AT型高效液相色譜儀(日本島津科技有限公司)，包括LC-20AT型高壓雙泵、SIL-20A自動(dòng)進(jìn)樣閥、SPD-20AT紫外-可見檢測器、CTO-20A柱箱、LCsolution色譜數(shù)據(jù)工作站和IBM臺(tái)式電腦；JSM-6460F掃描電子顯微鏡(SEM)(日本電子株式會(huì)社)；透射電子顯微鏡(TEM)(德國布魯克公司)；傅里葉變換紅外光譜儀(美國布魯克儀器公司).

結(jié)晶紫(天津凱密化學(xué)試劑有限公司);純度大于99.85%的石墨粉(上海華誼集團(tuán)公司).所有其他化學(xué)品均為分析試劑級(jí).實(shí)驗(yàn)用水為純水.本實(shí)驗(yàn)是在室溫下進(jìn)行的.

1.2 高效液相色譜條件

C18色譜柱柱(粒徑5 μm，內(nèi)徑250 mm×4.6 mm)；流速為0.5 mL·min-1，注射量為10 μL；流動(dòng)相為乙酸銨(溶劑B)和乙腈(溶劑A，pH=4.5)；A/B比值保持在20/80(v/v)；結(jié)晶紫檢測波長為588 nm.

1.3 3D-GN的制備

1.3.1 氧化石墨烯(GO)的制備 根據(jù)改進(jìn)的Hummers制備GO[11].具體步驟如下：冰水浴條件下，將1 g片狀石墨粉和1 g NaNO3粉加入裝有70 mL H2SO4的三頸反應(yīng)瓶中.在磁力攪拌器的作用下，緩慢加入6 g KMnO4粉末(T≈5 ℃)，控制反應(yīng)溫度反應(yīng)2 h.冰水浴變?yōu)闇厮r(shí)，保持溫度35 ℃下，接下來將100 mL二次蒸餾水緩慢多次加入，并控制溫度在100 ℃以下，保持30 min，加入5 mL 30%的H2O2除去未反應(yīng)的KMnO4，45 min后，再加入60 mL二次蒸餾水，反應(yīng)10 min.溶液顏色變?yōu)榱咙S色時(shí)趁熱過濾，用10%稀鹽酸和二次蒸餾水洗滌.將超聲分散6 h后的下層沉淀液在轉(zhuǎn)速3 000 r·min-1離心30 min，下層膠液在10 000 r·min-1離心40 min.最后將下層膠液在50 ℃真空干燥箱中充分干燥2-3天，得到GO產(chǎn)品.

1.3.2 3D-GN的制備 稱取100 mg GO，分散在200 mL水溶液中.取0.5 g·L-1的棕黃溶液，用超聲波清洗機(jī)清洗1 h，得到穩(wěn)定的分散懸液.將所得懸浮液放入80 ℃的溫水浴中.然后準(zhǔn)確稱取1.0 g硼氫化鈉，溶解于蒸餾水中，滴入反應(yīng)體系.將反應(yīng)1 h的還原產(chǎn)物在60 ℃的真空干燥箱中沉淀，得到3D-GN樣品.

1.4 魚樣的處理

校園街市購買的魚樣處理搗碎.稱取該魚樣10.00 g加入裝有3 mL鹽酸羥胺溶液，5 mL對甲苯磺酸溶液和10 mL醋酸緩沖液的100 mL燒杯中，轉(zhuǎn)入勻漿器加10.00 mL乙腈攪拌1 min，再加入酸性10 g Al2O3攪拌1 min.然后將該溶液在轉(zhuǎn)速3 000 r·min-1下離心10 min.最后把離心液轉(zhuǎn)移到含有4 mL二甘醇，20 mL水和20 mL乙腈的100 mL加塞的離心管.接下來對魚樣進(jìn)行凈化處理，將30 mL二氯甲烷在3 000 r·min-1的速度下離心10 min，2次.收集離心液于50 ℃加熱蒸發(fā)至干燥，用2.5 mL乙腈溶解，再次蒸發(fā)至接近干燥，以1 mL流動(dòng)相準(zhǔn)確溶解殘液，將殘液過0.45 μm濾膜后用高效液相色譜法測定[12].

1.5 3D-GN用于結(jié)晶紫的富集流程

分別量取50 mL空白魚樣品(經(jīng)1.4處理后未加石墨烯的魚樣品)和標(biāo)準(zhǔn)魚樣品溶液(在空白魚樣品中加入結(jié)晶紫標(biāo)準(zhǔn)溶液至結(jié)晶紫濃度為1.5 μg·mL-1)，各裝入100 mL錐形瓶中并調(diào)節(jié)pH=7，并將兩個(gè)錐形瓶內(nèi)的溶液都進(jìn)行如下操作.即向錐形瓶加入60 mg 3D-GN，再加入1 mL丙酮振蕩分析5 min，然后保持30 ℃恒溫振動(dòng)吸收3 h，重復(fù)3次.將錐形瓶所得的洗脫液合并，蒸發(fā)至接近干燥，用1 mL流動(dòng)相溶解，0.45 μm微孔濾膜過濾.最后取10 μL濾液進(jìn)行高效液相色譜分析.

2 結(jié)果與討論

2.1 3D-GN的表征

2.1.1 TEM和SEM表征 圖1(a)(b)為GO的TEM和SEM圖，(c)(d)為3D-GN不同放大倍數(shù)下的SEM圖.從圖1(a)(b)可以看到，GO表面光滑透明，狀態(tài)蓬松，有褶皺、卷曲和團(tuán)聚現(xiàn)象.由(c)(d)可以看出，3D-GN樣品透明，出現(xiàn)褶皺狀起伏，卷曲度較大.

圖1 GO的TEM圖(a)；GO的3000倍SEM圖(b)；3D-GN的5000倍SEM圖(c)；3D-GN的30000倍的SEM圖(d)Fig.1 The TEM diagram of GO(a);The SEM diagram of3000 times of GO(b);The SEM diagram of 5000 times of3D-GN(c);The SEM diagram of 30000 times of 3D-GN(d)

2.1.2 紅外光譜表征 GO和3D-GN的紅外光譜如圖2所示.A為GO的紅外光譜，從圖中曲線可知，1 392 cm-1，3 450 cm-1處為O-H(羥基)的面內(nèi)變形振動(dòng)特征峰和變形膨脹振動(dòng)吸收峰，1 724 cm-1為C=O(羰基)的伸縮振動(dòng)吸收峰，1 052 cm-1和1 221 cm-1分別代表GO的C-O-C烷氧基和烷基代表的振動(dòng)吸收峰，1 620 cm-1處說明GO的C=C的拉伸振動(dòng)特征峰較羰基弱.上述結(jié)果表明本實(shí)驗(yàn)制備的GO至少含有羥基、烷基、羰基、烷氧基和C=C官能團(tuán).3D-GN的紅外光譜如B所示，1 700 cm-1處的吸收峰屬于氧官能團(tuán)C=O的伸縮振動(dòng).同時(shí)環(huán)氧C-O(約1 200 cm-1)和烷氧基C-O(約1 000 cm-1)的伸縮振動(dòng)峰明顯減少，而C=C的吸收明顯，說明實(shí)驗(yàn)制備的3D-GN產(chǎn)品性能良好.

圖2 GO和3D-GN的紅外光譜圖Fig.2 FT-IR of GO and 3D-GN

2.2 色譜分析及標(biāo)準(zhǔn)曲線 本實(shí)驗(yàn)魚樣品未檢測出CV

在最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件下，1.5 μg·mL-1結(jié)晶紫標(biāo)準(zhǔn)液的色譜圖見圖3(A)，添加1.5 μg·mL-1標(biāo)準(zhǔn)結(jié)晶紫的魚樣(B)，魚樣B經(jīng)3D-GN富集的色譜圖(C),(D)為結(jié)晶紫溶液定量分析標(biāo)準(zhǔn)曲線.

圖3 1.5 μg·mL-1結(jié)晶紫標(biāo)準(zhǔn)工作液下的液相色譜圖(A)；添加1.50 μg·mL-1結(jié)晶紫標(biāo)準(zhǔn)溶液后的魚樣的色譜圖(B);添加1.50 μg·mL-1結(jié)晶紫標(biāo)準(zhǔn)溶液的魚樣經(jīng)3D-GN富集后的色譜圖(C)；結(jié)晶紫溶液定量分析標(biāo)準(zhǔn)曲線(D)；Fig.3 The chromatogram of standard CV working solutionat 1.5 μg·mL-1；The chromatogram offish sample added with 1.50 μg·mL-1 standard CV(B);The chromatogram of fish sample added with 1.50 μg·mL-1standard CV after enrichment with 3D-GN(C); Calibration curve for quantitative analysis of CV(D);

從圖3(B)中可以看出，加標(biāo)魚樣品(在空白魚樣品中加入結(jié)晶紫標(biāo)準(zhǔn)溶液至結(jié)晶紫濃度為1.5 μg·mL-1)峰高為20 mAu.而添加1.50 μg·mL-1標(biāo)準(zhǔn)結(jié)晶紫的魚樣品經(jīng)3D-GN富集后的結(jié)晶紫峰高達(dá)1 280 mAu，如圖3(C)所示.計(jì)算可得，3D-GN富集倍數(shù)為64，說明樣品經(jīng)富集后能大大提高結(jié)晶紫檢測的靈敏度.

按試驗(yàn)方法對0.015，0.01，0.05，1.0，5.0，10，30和50 μg·mL-1的結(jié)晶紫溶液在色譜條件下進(jìn)行測定，定量分析標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖3(D).根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析，結(jié)晶紫濃度(x)在0.015～50 μg·mL-1范圍內(nèi)與其峰高呈良好線性關(guān)系(R2=0.999 0)，線性回歸方程為y=42.04x-9.167，檢出限為5×10-5μg·mL-1.

查找文獻(xiàn)對比本文方法與其他不同前處理方法在檢出限、采用的色譜柱以及回收率三方面對比，結(jié)果如表1所示.

表1 本文的方法與其他前處理方法測定CV的檢出限比較Tab.1 Comparison of the LODs of the present method with otherpretreatment methods for HPLC determination of CV

2.3 方法回收率和重現(xiàn)性

取空白魚樣品若干份，分別加入濃度為1 μg·mL-1、2 μg·mL-1和5 μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液.按試驗(yàn)方法平行測定，計(jì)算回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果見表2.

通過實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了穩(wěn)定性和重現(xiàn)性的考察，連續(xù)測定6次，回收率在92%-97%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)小于2%，說明該實(shí)驗(yàn)測試穩(wěn)定性良好.日內(nèi)分析的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1.6%，日間分析的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為2.1%，說明重現(xiàn)性良好.

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)制備了3D-GN固相萃取劑，并建立了固相萃取-高效液相色譜法測定水產(chǎn)品中的痕量結(jié)晶紫的方法.該方法能準(zhǔn)確高效快速檢測水產(chǎn)品中結(jié)晶紫的含量，操作簡便、高效且靈敏度較一般方法高，加標(biāo)回收率以及重復(fù)性實(shí)驗(yàn)符合分析要求，可為水產(chǎn)品中結(jié)晶紫痕量測定提供科學(xué)的方法.