王力 綜述 歐陽宏 審校

(中山大學(xué)中山眼科中心，眼科學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省眼科視覺科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510060)

2019年世界衛(wèi)生組織發(fā)布的《世界視覺報(bào)告》指出，全球至少22億的視力損傷患者中與角膜有關(guān)的未矯正屈光不正約有1.27億，角膜渾濁約有420萬[1]。角膜是位于眼球最前端的透明圓頂形結(jié)構(gòu)，作為前屏障，角膜保護(hù)其他所有眼球結(jié)構(gòu)，使其免受外部損傷。角膜也是透光和分光的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，光線的透射和折射在很大程度上依賴于角膜的透明度和曲率[2]，因此角膜也是視覺形成的關(guān)鍵組織。

干細(xì)胞治療屬于再生醫(yī)學(xué)范疇，其應(yīng)用于臨床實(shí)踐的首要目標(biāo)是利用干細(xì)胞重建功能性組織。隨著精準(zhǔn)醫(yī)療概念的提出和發(fā)展，干細(xì)胞治療也進(jìn)入了新的精細(xì)階段，針對(duì)角膜各組分的干細(xì)胞重建取得了進(jìn)展。

1 角膜上皮層的干細(xì)胞重建

角膜上皮重建是干細(xì)胞治療的主戰(zhàn)場(chǎng)，角膜上皮維持著角膜的無血管和相對(duì)脫水狀態(tài)，使角膜透明和完整而保持清晰的視力。角膜上皮的生理來源是角膜緣干細(xì)胞(limbal stem cells，LSCs)，LSC屬成體干細(xì)胞，通過連續(xù)不對(duì)稱地分裂、分化，并向角膜中心遷移，以補(bǔ)充脫落的角膜上皮細(xì)胞[3]。

2 角膜緣干細(xì)胞標(biāo)志物

體內(nèi)LSCs始終處于持續(xù)分化階段，因此很難有明確的干細(xì)胞標(biāo)志物。Pellegrini等[4]在2001年確定了核蛋白p63可以作為角膜緣干細(xì)胞標(biāo)志物。近年的研究陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了一些潛在的候選標(biāo)志物，包括ABCB5[5]、ABCG2[6]等。受益于單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，對(duì)角膜緣組織的單細(xì)胞測(cè)序研究也挖掘了一系列的角膜緣干細(xì)胞的可能標(biāo)志物，如TSPAN7和SOX17等，并借助免疫組織熒光方法在空間分布上得到了驗(yàn)證[7]。雖然這些標(biāo)志物有助于區(qū)分不同的干細(xì)胞，但對(duì)區(qū)分不同分化狀態(tài)角膜緣前體細(xì)胞和過渡擴(kuò)充細(xì)胞(transit-amplifying cell，TACs)的幫助仍屬有限。

3 干細(xì)胞移植治療角膜緣干細(xì)胞缺乏癥的不同方式

角膜緣干細(xì)胞缺乏癥(limbal stem cell deficiency，LSCD)指角膜緣干細(xì)胞的缺失或功能障礙，表現(xiàn)為角膜新生血管和結(jié)膜化，可通過對(duì)眼表細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)移、印跡和免疫染色，即印跡細(xì)胞學(xué)(impression cytology)驗(yàn)證[8]。LSCD的臨床癥狀包括慢性眼表不適、視力下降、畏光等，病因可分為2類：外在原因，如化學(xué)燒傷、放射線和感染等；內(nèi)在原因，如Stevens-Johnson綜合征(Stevens-Johnson syndrome，SJS)、無虹膜、單純皰疹性角膜炎和慢性角膜緣炎等。對(duì)于角膜中心部分相對(duì)透明的部分LSCD，應(yīng)選擇保守措施進(jìn)行治療[9]，而對(duì)于較嚴(yán)重或完全的LSCD病例，通過移植手術(shù)補(bǔ)充角膜緣干細(xì)胞則被考慮為主要的治療方法。傳統(tǒng)的LSCD移植治療方法主要包括結(jié)膜角膜緣自體移植(conjunctival limbal autograft，CLAU)、角膜緣異體移植(limbal allograft，LAL)以及人工角膜移植。

3.1 結(jié)膜角膜緣自體移植

CLAU技術(shù)直接應(yīng)用另一只健眼的結(jié)膜角膜緣組織進(jìn)行自體移植，以治療單側(cè)全眼LSCD患者。作為L(zhǎng)SCD的治療技術(shù)之一，CLAU早在1989年就由Kenyon等[10]首次應(yīng)用。CLAU可提供適量的LSCs用于角膜表面修復(fù)，且無免疫排斥風(fēng)險(xiǎn)，長(zhǎng)期成功率可達(dá)到82%[11]。盡管成功率相對(duì)較高，但在進(jìn)行CLAU手術(shù)前應(yīng)考慮到對(duì)健康眼球的風(fēng)險(xiǎn)。對(duì)于沒有或少有自體移植的雙側(cè)LSCD患者，可采用LAL作為角膜表面重建的替代方法[12]。LAL的角膜組織來源可以來自親屬或尸體角膜緣組織，供體來源非常有限，還需使用全身性免疫抑制劑防止免疫排斥，會(huì)引起貧血、肌酐升高、高血糖等不良反應(yīng)[13]，移植成功率也較自體移植低[14-15]。雙側(cè)LSCD患者在免疫抑制劑不適用的情況下，可以選擇I型波士頓角膜移植治療，但易引發(fā)嚴(yán)重并發(fā)癥[16]。盡管如此，隨著材料科學(xué)的發(fā)展以及3D打印技術(shù)的成熟，人工角膜的應(yīng)用將成為未來的發(fā)展方向[17]。

3.2 角膜上皮移植術(shù)

再生醫(yī)學(xué)(利用干細(xì)胞產(chǎn)生生物代用品并改善組織功能)已成為近30年來最有希望的LSCD治療策略[18]。1997年，Pellegrini等[19]首次將培養(yǎng)的角膜上皮移植(cultivated limbal epithelial transplantation，CLET)應(yīng)用于眼科疾病，在研究中將自體人角膜上皮與小鼠成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層共培養(yǎng)后移植到2例單側(cè)LSCD患者，這兩例角膜緣上皮完全喪失患者的角膜表面得到修復(fù)，視力均獲得明顯提升，術(shù)后2年的隨訪結(jié)果顯示兩位患者的臨床指征均正常。2010年，Kolli等[20]建立了一種以人羊膜(human amniotic membrane，hAM)為基質(zhì)促進(jìn)細(xì)胞擴(kuò)增的方法。該方法采用無飼養(yǎng)層培養(yǎng)條件，不含動(dòng)物產(chǎn)品，成功治療了8例患者。同時(shí)Mariappan等[21]也發(fā)表了人角膜緣上皮細(xì)胞體外擴(kuò)增的標(biāo)準(zhǔn)方案，也是以hAM為培養(yǎng)基質(zhì)的無飼養(yǎng)層技術(shù)。CLET是所有報(bào)道的干細(xì)胞療法中最成熟的技術(shù)，歐洲醫(yī)藥署(European Medicine Agency，EMA)已于2015年批準(zhǔn)CLET作為角膜燒傷的合法治療方法(Holoclar；Holostem Terapie Avanzate，意大利摩德納)。根據(jù)最近的統(tǒng)計(jì)結(jié)果，自體CLET的眼表重建率中位數(shù)可達(dá)到74.1%，視力恢復(fù)率為54.5%，免疫排斥反應(yīng)發(fā)生率為0%，感染性角膜炎發(fā)生率為4.6%，眼壓/青光眼發(fā)生率為6.3%[22]。

CLET技術(shù)的一般過程是，首先從供體眼中收獲健康的LSCs，然后將收獲的LSCs進(jìn)行體外培養(yǎng)和擴(kuò)增。當(dāng)體外細(xì)胞達(dá)到移植量時(shí)，將同時(shí)以羊膜或其他基質(zhì)為載體支持CLET移植，該技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于各類LSCD的治療。與其他移植技術(shù)相比，CLET最重要的優(yōu)點(diǎn)是它達(dá)到良好治療效果所需的LSCs數(shù)量明顯減少，還可以提高上皮化率，降低炎癥風(fēng)險(xiǎn)。為了突破CLET來源的限制，自體和異體LSCs都在臨床試驗(yàn)中得到了驗(yàn)證。因?yàn)樽泽w組織不需要系統(tǒng)性免疫抑制，所以自體角膜緣干細(xì)胞被認(rèn)為是CLET的最佳來源。盡管CLET的效果良好、優(yōu)點(diǎn)明確，但步驟中確實(shí)存在安全問題和技術(shù)挑戰(zhàn)，現(xiàn)行方案中涉及部分的動(dòng)物和/或人源產(chǎn)品或組織，這對(duì)患者有一定風(fēng)險(xiǎn)。不安全的血清產(chǎn)品、毒性或傳染性物質(zhì)以及細(xì)胞培養(yǎng)過程中的污染都可能導(dǎo)致CLET的失敗。此外，良好的生產(chǎn)實(shí)踐(good manufacturing practice，GMP)也是CLET的要求，提高了該技術(shù)的門檻。

3.3 口腔黏膜上皮移植術(shù)

雖然CLET在LSCD治療中表現(xiàn)良好，但為了克服依舊存在的LSCs來源短缺，近來有多項(xiàng)研究致力于尋找干細(xì)胞治療的替代來源。利用口腔黏膜上皮細(xì)胞(口腔黏膜)培養(yǎng)的口腔黏膜上皮移植(cultivated oral mucosal epithelial transplantation，COMET)技術(shù)首先被開發(fā)為CLET的一個(gè)有希望的替代方案[23-24]。2004年，Nishida等[24]首次將培養(yǎng)的自體口腔黏膜細(xì)胞移植應(yīng)用于4例雙側(cè)LSCD患者，4例患者的視力均有明顯改善。但COMET的遠(yuǎn)期效果顯示出弊端，所有患者移植后均出現(xiàn)角膜新生血管化，嚴(yán)重影響視力，研究中使用的失活小鼠成纖維細(xì)胞作為培養(yǎng)基質(zhì)，也限制了COMET的使用[24]。

3.4 角膜上皮重建的其他細(xì)胞來源

除COMET外，越來越多的干細(xì)胞研究已經(jīng)被用作探索CLET的新來源。在人類表皮細(xì)胞中，PAX6的過表達(dá)可將表皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為角膜上皮樣細(xì)胞，并可用于修復(fù)兔角膜損傷模型中的角膜緣和角膜上皮[25]。此外，來自脂肪[26]或骨髓組織[27]的間充質(zhì)干細(xì)胞，毛囊干細(xì)胞[28]、臍帶干細(xì)胞[29]和牙髓干細(xì)胞[30]也被證明具備移植治療LSCD的潛能。這些研究表明利用其他來源干細(xì)胞獲得角膜組織細(xì)胞的可能性，拓展了角膜緣干細(xì)胞的替代來源，但療效仍待驗(yàn)證，具體臨床應(yīng)用方式也亟待開發(fā)。

誘導(dǎo)型多能干細(xì)胞(induced pluri potent stem cells，iPSCs)技術(shù)具有無免疫排斥風(fēng)險(xiǎn)、倫理安全等優(yōu)點(diǎn)，2016年Hayashi等[31]成功利用iPSCs作為L(zhǎng)SCs移植的來源。在動(dòng)物模型中，iPSCs可以成功分化為角膜上皮細(xì)胞，隨后的移植可以有效地恢復(fù)視覺功能。2019年，日本大阪大學(xué)Kohji Nishida團(tuán)隊(duì)已經(jīng)利用iPSCs分化的角膜上皮片層進(jìn)行了1例LSCD的臨床移植治療試驗(yàn)，治療前期視力有所改善，后續(xù)的治療效果仍在觀察中。iPSCs治療的弊端也是不可忽視的，體內(nèi)移植后存在一定的致癌風(fēng)險(xiǎn)，如開發(fā)為治療的臨床級(jí)產(chǎn)品需要經(jīng)過嚴(yán)格的安全性驗(yàn)證。在下表總結(jié)了干細(xì)胞重建角膜上皮的主要方法及主要優(yōu)缺點(diǎn)(表1)。

表1 干細(xì)胞移植重建角膜上皮方法優(yōu)缺點(diǎn)Table 1 Advantages and disadvantages of stem cell transplantation for corneal epithelial reconstruction

4 角膜基質(zhì)層的干細(xì)胞重建

角膜基質(zhì)約占角膜厚度的90%，主要由I型和V型膠原纖維片層狀排列組成[32-33]，為角膜提供了結(jié)構(gòu)支撐和抗拉強(qiáng)度、穩(wěn)定性和透明等重要特性。角膜基質(zhì)細(xì)胞位于角膜緣片層之間產(chǎn)生膠原蛋白和蛋白多糖，從而有助于角膜基質(zhì)的穩(wěn)定、細(xì)胞外基質(zhì)的調(diào)節(jié)以及愈合過程[34-35]。在角膜損傷修復(fù)過程中，角膜基質(zhì)細(xì)胞容易變性轉(zhuǎn)化為成纖維細(xì)胞和肌成纖維細(xì)胞，且此過程不可逆轉(zhuǎn)，通常會(huì)造成角膜的混濁。

角膜基質(zhì)干細(xì)胞存在于角膜緣基質(zhì)中，能通過基底膜與角膜緣干細(xì)胞有直接的細(xì)胞連接，為角膜緣干細(xì)胞提供支持維持其干細(xì)胞特性[36]。角膜緣基質(zhì)干細(xì)胞表達(dá)間充質(zhì)和干細(xì)胞相關(guān)的表面標(biāo)志物(CD73、CD90、CD105、CD140b)，能夠在體外分化為脂肪、骨和軟骨[37]。Basu等[38]成功從角膜緣上層組織中分離出角膜基質(zhì)干細(xì)胞，可形成表達(dá)干細(xì)胞基因(ABCG2、Nestin、NGFR、Oct4、PAX6和Sox2)的克隆球，并且能進(jìn)一步分化為表達(dá)ALDH3A1、AQP1、KERA和PTGDS等標(biāo)志基因的角膜基質(zhì)細(xì)胞。當(dāng)移植到小鼠角膜傷口中時(shí)，角膜基質(zhì)干細(xì)胞可防止光散射瘢痕組織的形成。此外，角膜中注射分離的角膜基質(zhì)干細(xì)胞，可以恢復(fù)角膜基質(zhì)的透明度和結(jié)構(gòu)[39]，其外泌體也對(duì)受傷角膜起促進(jìn)愈合的作用[40]。

除了角膜基質(zhì)的原生干細(xì)胞外，來源于骨髓、臍帶、脂肪組織、人羊膜的其他間質(zhì)干細(xì)胞以及iPSCs治療也能防止受傷角膜基質(zhì)的不透明和新生血管[41]。干細(xì)胞能通過類似的機(jī)制調(diào)節(jié)角膜基質(zhì)愈合：向角膜基質(zhì)細(xì)胞分化、抑制中性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)和功能、免疫調(diào)節(jié)、防止異常細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)沉積、優(yōu)選產(chǎn)生正常ECM成分、釋放旁分泌因子影響周圍損傷細(xì)胞和正常細(xì)胞來防止角膜瘢痕[36,40-43]。盡管角膜基質(zhì)干細(xì)胞的研究在近期獲得了一些進(jìn)展，但距離真正的角膜基質(zhì)層重建還有一定距離，需要克服細(xì)胞純度、細(xì)胞特征鑒定、細(xì)胞移植術(shù)式建立等一系列困難。

5 角膜內(nèi)皮層的干細(xì)胞重建

角膜內(nèi)皮細(xì)胞是神經(jīng)嵴衍生的細(xì)胞，位于特殊的細(xì)胞外基質(zhì)上，維持著角膜基質(zhì)水合所必需的狹窄生理范圍，同時(shí)通過離子轉(zhuǎn)運(yùn)功能抵消了從基質(zhì)到房水的擴(kuò)散梯度并進(jìn)行物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)，對(duì)角膜功能的實(shí)現(xiàn)至關(guān)重要[44]。人角膜內(nèi)皮細(xì)胞無法再生，受損后細(xì)胞通常會(huì)發(fā)生變形、變大，但整體數(shù)量相應(yīng)減少，導(dǎo)致角膜內(nèi)皮功能失代償。當(dāng)細(xì)胞密度低于維持其生理功能的臨界密度，將發(fā)生嚴(yán)重的病理改變[45]。

體外獲得角膜內(nèi)皮干細(xì)胞的技術(shù)還不成熟，只有少數(shù)研究開發(fā)了獲得具備角膜內(nèi)皮前體細(xì)胞特征細(xì)胞的體外方法[46-47]，應(yīng)用細(xì)胞移植技術(shù)治療角膜內(nèi)皮疾病的報(bào)導(dǎo)較少。2018年，Kinoshita等[48]將體外擴(kuò)增培養(yǎng)的異體內(nèi)皮細(xì)胞注射到11例大皰性角膜病患者前房。24周的隨訪后接受治療的眼睛的角膜內(nèi)皮細(xì)胞密度均超過500個(gè)細(xì)胞/mm2，其中10個(gè)超過1 000個(gè)細(xì)胞/mm2，且沒有發(fā)生任何不良事件。該臨床試驗(yàn)表明了細(xì)胞移植技術(shù)治療角膜內(nèi)皮疾病是可行的。牙髓干細(xì)胞也被證明可轉(zhuǎn)化為表達(dá)ZO1、ATP1A1以及COL4A2等角膜內(nèi)皮特異性標(biāo)志物的細(xì)胞[49]，有望作為角膜內(nèi)皮細(xì)胞的替代細(xì)胞。

6 結(jié)語

近30年角膜領(lǐng)域新技術(shù)使數(shù)百萬患者免于失明，但利用角膜緣干細(xì)胞重建功能性角膜仍需深入研究，如鑒定更多的特異性干細(xì)胞標(biāo)志物，包括細(xì)胞表面標(biāo)志物以檢測(cè)和富集干細(xì)胞群體；研發(fā)維持角膜緣干細(xì)胞擴(kuò)增的穩(wěn)定體系，避免細(xì)胞在體外培養(yǎng)過程中增殖能力減弱；此外，應(yīng)著力解決諸如大規(guī)模無異種蛋白(Xeno-free)培養(yǎng)、干細(xì)胞治療GMP通用化以及低不良反應(yīng)高效免疫抑制等瓶頸問題。

角膜基質(zhì)和角膜內(nèi)皮的干細(xì)胞治療相比角膜上皮仍處于不成熟階段。角膜基質(zhì)干細(xì)胞缺乏國(guó)際范圍內(nèi)認(rèn)可的特異性標(biāo)志物，臨床試驗(yàn)尚未開展。角膜內(nèi)皮細(xì)胞則需要尋找種子細(xì)胞以實(shí)現(xiàn)“開源”，同時(shí)也需要發(fā)展成熟的干細(xì)胞治療方案來實(shí)現(xiàn)科研和臨床的同步。

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