張 燕 彭明霞 潘 萌

副腫瘤性天皰瘡(paraneoplastic pemphigus，PNP)是1990年被命名的一種罕見的累及皮膚黏膜的自身免疫性大皰性疾病，常伴發(fā)腫瘤，多為淋巴增生性腫瘤，可累及多個(gè)內(nèi)臟器官。患者體內(nèi)存在多種自身抗體成分，可與多個(gè)器官或組織的上皮成分結(jié)合，如膀胱、呼吸道、小腸及大腸、甲狀腺、心肌及骨骼肌等[1]。PNP病情危重，死亡率高，因此，早期診斷、早期治療對提高患者的生存率尤為重要。目前，除了臨床表現(xiàn)和組織病理學(xué)檢查外，間接免疫熒光(indirect immunofluorescence，IIF)也是主要的臨床檢測手段，但一般用于自身免疫性大皰性皮膚病的IIF底物為猴食道上皮，由于其主要成分為復(fù)層鱗狀上皮，而非移行上皮，故檢出率較低。為進(jìn)一步提高檢出率，探索PNP的早期診斷手段，本研究采用以鼠膀胱和猴食道為底物的IIF和以人表皮提取物為抗原的免疫印跡(immunoblot，IB)檢測，對其在臨床診斷中的應(yīng)用進(jìn)行研究。

1 對象與方法

1.1 研究對象 收集2007年7月—2017年10月上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院皮膚科病房收治的11例PNP患者資料，其中男4例、女7例；年齡范圍13～53歲，平均年齡為32歲；病程2～36個(gè)月，平均病程為9個(gè)月。所有患者均符合PNP的臨床和病理學(xué)診斷。所有患者均檢出腫瘤，其中7例伴有卡斯?fàn)柭?Castleman)瘤(2例卡斯?fàn)柭霭闉V泡樹突細(xì)胞增生)，2例伴有胸腺瘤，1例伴有纖維組織淋巴瘤，1例伴有起源于卡斯?fàn)柭〉牧馨徒Y(jié)濾泡樹突肉瘤。對照組選取同期本院健康體檢者4例，年齡、性別與PNP組相當(dāng)。

1.2 主要試劑和儀器

1.2.1 主要試劑 異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的羊抗人IgG抗體(美國ThermoFisher Scientific公司)；BCA蛋白定量試劑盒(碧云天生物技術(shù)有限公司)；高分子量預(yù)染蛋白Marker(10帶，加拿大Fermentas公司)；辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗人IgG抗體(碧云天生物技術(shù)有限公司)；硝酸纖維素(nitrocellulose，NC)膜購自美國ThermoFisher Scientific公司。

1.2.2 主要儀器 熒光顯微鏡(德國Leica公司，型號為DM2500)；聚丙烯酰胺凝膠電泳系統(tǒng)(美國Bio-Rad，型號為165-8001、164-5050、170-3930)。

1.3 方法

1.3.1 血清樣本 收集11例PNP患者共15份血清(其中4例為術(shù)前和術(shù)后各2份血清)，其中6份為手術(shù)前患者的血清樣本，9份為手術(shù)切除腫瘤后1～6個(gè)月的患者血清樣本。對照組為4例正常人血清樣本。

1.3.2 IIF 分別以猴食道和鼠膀胱為底物，檢測患者血清中的PNP抗體，陽性者見表皮細(xì)胞間免疫球蛋白G(IgG)呈網(wǎng)狀沉積，顯示綠色熒光。

1.3.3 IB 取健康成人新鮮環(huán)切包皮，去除皮下組織，浸入表皮分離液中，4 ℃靜置48 h后剝離表皮，轉(zhuǎn)入500 μL RIPA蛋白裂解液，裂解30 min后，離心，收集上清液，用BCA法測定蛋白質(zhì)含量，作為人表皮細(xì)胞蛋白提取液。參照文獻(xiàn)[2]的方法，將上述得到的蛋白質(zhì)通過SDS-PAGE將人表皮細(xì)胞蛋白抗原按分子質(zhì)量大小分離，濕式轉(zhuǎn)膜將蛋白轉(zhuǎn)印至NC膜上，以β-actin作內(nèi)參照。以患者及對照組血清為一抗，以HRP標(biāo)記的羊抗人IgG抗體為二抗，用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法(ECL)檢測轉(zhuǎn)印膜上目的條帶的表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SAS 9.2 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件。計(jì)數(shù)資料以頻數(shù)(n)表示，數(shù)據(jù)比較采用Fisher確切概率法檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 IIF檢測結(jié)果 11例PNP患者血清中，在鼠膀胱黏膜上皮細(xì)胞間有IgG型自身抗體表達(dá)且呈網(wǎng)狀沉積者6例，陽性血清中PNP抗體的滴度為1∶50～1∶100。見圖1。對照組血清未見在鼠膀胱黏膜上皮細(xì)胞間呈陽性表達(dá)。以猴食道為底物行IIF檢測，結(jié)果均呈陰性。

A IgG型自身抗體呈網(wǎng)狀沉積 B 4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)核染色圖1 以鼠膀胱上皮為底物的IIF檢測熒光顯微鏡下陽性表現(xiàn)示意圖(×100)

2.2 IB檢測結(jié)果 11例PNP患者中，有7例患者的血清中檢測到特異性IgG型自身抗體，位于190 000 Da處，其中5例呈現(xiàn)出雙條帶，同時(shí)在210 000 Da處呈現(xiàn)陽性條帶。4例患者檢測了術(shù)前、術(shù)后2份血清，術(shù)前血清均在190 000 Da處呈現(xiàn)陽性條帶，其中2例患者的術(shù)后血清轉(zhuǎn)為陰性。對照組血清未呈現(xiàn)任何特異性條帶。見圖2。其他4例患者血清為陰性，其中3例患者血清采樣時(shí)已使用藥物治療3個(gè)月以上，且腫瘤已經(jīng)手術(shù)切除。

2.3 IIF和IB在PNP抗體檢測中的比較 11例PNP患者中，IIF檢出陽性6例，IB檢出陽性7例，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.31)。其中兩種檢測方法結(jié)果均呈陽性者5例；IB陽性，IF陰性者2例；IIF法陽性，IB陰性者1例。其他3例血清兩種方法檢測均為陰性。

3 討 論

PNP是一種嚴(yán)重危及生命的自身免疫性大皰性皮膚黏膜疾病，其免疫學(xué)特點(diǎn)為患者血清中存在Plakin家族的多克隆IgG抗體。針對的Plakin蛋白的抗原包括包斑蛋白EP(envoplakin，210 000)、周斑蛋白PP(periplakin，190 000)、橋斑蛋白(desmoplakin，DP)Ⅰ和Ⅱ(相對分子質(zhì)量分別為250 000、210 000)，其中最具特征性和一致性的為EP和PP，可作為PNP確診依據(jù)。近年來發(fā)現(xiàn)，PNP患者血清中存在抗-α2巨球蛋白樣1蛋白(alpha-2-macroglobulin-like-1，A2ML1)抗體。A2ML1是一種蛋白酶抑制劑，在表皮、甲狀腺及睪丸中均有表達(dá)。Numata等[3]發(fā)現(xiàn)，抗A2ML1抗體與PNP的早期發(fā)生有關(guān)，這為PNP早期篩查提供了思路。

本研究以正常人表皮提取物進(jìn)行IB分析，7例PNP患者血清檢測到與表皮分離抗原結(jié)合的IgG抗體，均與相對分子質(zhì)量為190 000的表皮抗原發(fā)生反應(yīng)，其中5例患者血清同時(shí)與相對分子質(zhì)量為210 000的表皮抗原發(fā)生反應(yīng)。與既往研究[3]結(jié)果不同，本研究未檢測到相對分子質(zhì)量為250 000的DPⅠ和170 000的A2ML1條帶。究其原因，可能是IB檢測過程中SDS-PAGE電泳使大分子降解，在結(jié)構(gòu)上破壞了敏感的抗原表位；也可能與表皮抗原提取過程及檢測抗體技術(shù)操作流程不同有關(guān)。最新研究[4]結(jié)果表明，當(dāng)前推薦的PNP血清學(xué)診斷技術(shù)檢測抗A2ML1抗體的靈敏度和特異度欠佳。利用基于綠色熒光蛋白的新型活性真核A2ML1 ELISA試劑盒進(jìn)行檢測，其靈敏度和特異度均較高[4]。另外，本試驗(yàn)分離正常表皮并提取抗原，進(jìn)行IB反應(yīng)，結(jié)果中陽性率較低，可能與患者經(jīng)過治療后自身抗體的滴度下降有關(guān)。

抽取PNP患者血清以鼠膀胱或人皮膚為底物進(jìn)行IIF檢測可見上皮細(xì)胞間熒光表達(dá)，提示患者血清中存在著可識別復(fù)層鱗狀上皮和移行上皮的循環(huán)抗體，此法診斷PNP具有較高的特異度和靈敏度[5]。本研究以鼠膀胱為底物，對11例患者血清進(jìn)行檢測，陽性率為 54.55%。而以猴食道上皮為底物時(shí)均未呈現(xiàn)陽性結(jié)果。這可能與PNP患者血清中的循環(huán)抗體與膀胱上皮結(jié)合的能力最強(qiáng)有關(guān)，因?yàn)榘螂资且菩猩掀?，?nèi)含大量橋?；蚣?xì)胞內(nèi)物質(zhì)的成分[1]。本研究證明了鼠膀胱移行上皮是檢測PNP自身抗體的敏感底物，可作為PNP的過篩試驗(yàn)。

總之，IB檢測PNP患者血清可識別角質(zhì)形成細(xì)胞提取物中的EP(210 000)和PP(190 000)，從而確診PNP，但方法復(fù)雜。而以IIF檢測PNP患者血清，方法簡便易行，且靈敏度和特異度均較高，但因不同底物導(dǎo)致不同的結(jié)果，建議以鼠膀胱移行上皮為底物。所以，對那些有典型PNP臨床及病理學(xué)表現(xiàn)而尚未確診的自身免疫性大皰性皮膚病患者應(yīng)以鼠膀胱為底物行IIF檢測作為過篩試驗(yàn)，以及時(shí)發(fā)現(xiàn)潛在腫瘤。在條件允許的情況下行IB試驗(yàn)以確診。