王麗梅 李國(guó)平 陳余朋 鄭珂

口腔鱗狀細(xì)胞癌(oral squamous cell carcinomas， OSCC)是一種致命的疾病，由于腫瘤侵襲性、頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和最終的血行轉(zhuǎn)移導(dǎo)致不良的預(yù)后[1-2]。盡管在診斷和治療策略方面取得了很大進(jìn)展，但由于腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移， 50% OSCC患者仍在5 年內(nèi)死亡，因而OSCC診斷與治療的關(guān)鍵還在于探索出更加有效的預(yù)后相關(guān)因子[3-4]。

過氧化物還原素(peroxiredoxins，PRDXs)由6 個(gè)小的抗氧化同工酶(PRDX1-6)組成，屬于氧化還原家族蛋白，其廣泛分布在人體各組織中[5]。在這6 類PRDXs中，只有PRDX4位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，參與調(diào)節(jié)過氧化物酶活性和氧化還原的過程[5-6]。由細(xì)胞內(nèi)氧化還原平衡的破壞所引起的氧化應(yīng)激，與腫瘤干細(xì)胞的生存和增殖密切相關(guān)，已有研究表明其表達(dá)失調(diào)促進(jìn)多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展5,7]。現(xiàn)有關(guān)于PRDX4在OSCC中的相關(guān)研究尚少，與各臨床病理參數(shù)之間的相關(guān)關(guān)系也并不明確。為了進(jìn)一步驗(yàn)證PRDX4在口腔鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展中的作用，本研究通過免疫組化檢測(cè)108 例OSCC病例標(biāo)本中PRDX4的表達(dá)及與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白E-cad及Vimentin表達(dá)，分析PRDX4表達(dá)與各臨床病理因素及預(yù)后的關(guān)系及其與E-cad及Vimentin表達(dá)的相關(guān)性，探討其可能機(jī)制，為OSCC治療和預(yù)后評(píng)估提供潛在標(biāo)記物。

1 資料與方法

1.1 病例選擇

納入2012 年1 月～2016 年12 月在福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院口腔頜面頭頸外科手術(shù)的108 例 OSCC 患者。

納入標(biāo)準(zhǔn)： (1)原發(fā)于口腔的鱗狀細(xì)胞癌且術(shù)前未接受放射治療或化學(xué)治療; (2)切除組織包括腫瘤組織及其周圍正常組織; (3)手術(shù)包括行原發(fā)灶切除及頸淋巴結(jié)清掃; (4)具有完整的臨床及病理資料。

排除標(biāo)準(zhǔn)： (1)術(shù)前接受過放射治療或化學(xué)治療的口腔鱗狀細(xì)胞癌病例; (2)手術(shù)僅行原發(fā)灶切除而未進(jìn)行頸淋巴結(jié)清掃; (3)繼發(fā)累及口腔的鱗狀細(xì)胞癌; (4)病例臨床及病理資料不全。 腫瘤的組織病理分級(jí)采用世界衛(wèi)生組織(WHO，2016)推薦的標(biāo)準(zhǔn)，臨床分期根據(jù) AJCC第八版pTNM分期標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分期。隨訪用電話及門診電子病歷系統(tǒng)隨訪，確診之日為隨訪開始時(shí)間，終止事件因腫瘤而死亡，排除非腫瘤的相關(guān)死亡。

1.2 組織芯片的制作

每例病例均由病理醫(yī)師選擇兩處代表性腫瘤組織區(qū)域及一處對(duì)照正常組織區(qū)域，使用打孔器在供體蠟塊的相應(yīng)位置進(jìn)行穿刺取樣。然后，將穿刺所得的微圓柱形結(jié)構(gòu)植入預(yù)先制備的受體蠟塊的陣列孔中。

1.3 免疫組織化學(xué)

抗體使用以下濃度：PRDX4抗體(184167， 1∶1 000，Abcam，英國(guó))；E-cad(MX020，1∶300)、vimentin(福州邁新V9，1∶1 000)，操作步驟嚴(yán)格按試劑盒說明進(jìn)行。

1.4 結(jié)果判定

PRDX4及Vimentin染色以細(xì)胞漿出現(xiàn)黃色或棕黃色顆粒為陽性； E-cad染色以胞膜出現(xiàn)黃色或棕黃色為陽性。采取二次計(jì)分法：每例標(biāo)本隨機(jī)選取5 個(gè)高倍視野(×400)計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞所占腫瘤細(xì)胞數(shù)的百分比計(jì)分，陽性細(xì)胞數(shù)<5%為0 分；陽性細(xì)胞數(shù)5%～30%為1 分；陽性細(xì)胞數(shù)31%～60%為2 分；陽性細(xì)胞數(shù)>60%為3 分。染色強(qiáng)度計(jì)分： 0 分為無色， 1 分為淡黃色， 2 分為棕黃色， 3 分為棕褐色。用染色強(qiáng)度得分和染色百分比得分的乘積作為判斷標(biāo)準(zhǔn)， 0～3 分為陰性(-)， 3～6 分為弱陽性(+)， >6 分為強(qiáng)陽性(++)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。運(yùn)用秩和檢驗(yàn)分析癌組織、癌旁正常組織中PRDX4的表達(dá)情況，運(yùn)用非參數(shù)檢驗(yàn)及多元Logistic有序回歸分析PRDX4表達(dá)與OSCC病理特征的關(guān)系，利用Spearman相關(guān)性分析對(duì)PRDX4與E-cad、Vimentin之間相關(guān)關(guān)系進(jìn)行分析，Kaplan-Meier方法對(duì)患者隨訪的生存情況進(jìn)行分析。

2 結(jié) 果

2.1 OSCC中PRDX4的表達(dá)及其與臨床病理的關(guān)系

通過免疫組織化學(xué)檢測(cè) PRDX4在108 對(duì)OSCC及正常組織中的表達(dá)情況，結(jié)果顯示在口腔鱗狀細(xì)胞癌組織種PRDX4表達(dá)陽性率為68.5%(74/108)，癌旁正?？谇簧掀颖局蠵RDX4表達(dá)陽性率為4.6%(5/108)，PRDX4在口腔癌組織中高表達(dá)(P<0.001)(表 1)。PRDX4的表達(dá)與腫瘤組織分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況及神經(jīng)侵犯情況有關(guān)(P<0.05)；與患者的性別、年齡、TNM分期及淋巴間質(zhì)及脈管癌栓無關(guān)(P>0.05)(圖 1， 表 2)。通過進(jìn)一步Logistic回歸分析，發(fā)現(xiàn)腫瘤分化程度低(低分化vs高分化，OR=6.579，P=0.002)、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(OR=2.375，P=0.039)是PRDX4高表達(dá)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素 (表 3)。

表 1 口腔鱗狀細(xì)胞癌組織及癌旁正常組織中PRDX4的表達(dá)

圖 1 PRDX4在正常鱗狀上皮及不同分化程度的口腔鱗狀細(xì)胞癌中表達(dá)情況(IHC, ×200)

表 2 口腔癌中PRDX4的表達(dá)與臨床病理參數(shù)的相關(guān)性

表 3 影響PRDX4表達(dá)的多元Logistic回歸分析

2.2 OSCC中PRDX4與E-cad和Vimentin表達(dá)的關(guān)系

分析OSCC腫瘤組織中PRDX4、E-cad及Vimentin的表達(dá)情況(圖 2)，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果顯示：PRDX4與Vimentin的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.313，P=0.001)，與E-cad的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.327,P=0.001)。

圖 2 PRDX4、 Vimentin及E-cad的表達(dá)(IHC， ×200)

2.3 OSCC患者PRDX4的表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系

Kaplan Meier生存分析結(jié)果顯示PRDX4的表達(dá)與OSCC患者總體生存時(shí)間顯著相關(guān)，PRDX4高表達(dá)組(強(qiáng)陽性組)總體生存時(shí)間顯著低于低表達(dá)組(陰性或弱陽性)(Log Rankχ2=9.936，P=0.002)(圖 3)。

圖 3 不同PRDX4表達(dá)水平OSCC患者總生存率的K-M分析

3 討 論

口腔癌是全球第六大最常見的癌癥，每年約超過30 萬新增病例，其中OSCC約占口腔癌的90%[8]。OSCC對(duì)患者的生活質(zhì)量有極大影響，同時(shí)也危及著患者的生命，其中高淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率是造成OSCC預(yù)后不良的主要因素之一[6,9]。

PRDX4是一種主要的抗氧化劑，越來越多的證據(jù)表明它在多種腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移中的作用。在乳腺癌和結(jié)腸癌中，PRDX4的升高與遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移相關(guān)[10-11]。在前列腺癌中，PRDX4的高表達(dá)與腫瘤分期的增加相關(guān)[12]。在對(duì)該院口腔頜面頭頸手術(shù)108 例OSCC患者的研究中，結(jié)果證實(shí)了PRDX4在OSCC組織中的表達(dá)水平明顯高于癌旁正常組織。這與既往PRDX4在前列腺癌、結(jié)腸癌、乳腺癌中表達(dá)升高究結(jié)論相似，提示PRDX4可能參與多種腫瘤包括口腔鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生[5]。本研究還發(fā)現(xiàn)PRDX4表達(dá)與腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及神經(jīng)侵犯相關(guān)，提示PDRX4可能參與OSCC腫瘤的進(jìn)展；在生存分析曲線中顯示，PRDX4高表達(dá)患者的預(yù)后較低表達(dá)者差，提示PRDX4可能作為OSCC的預(yù)后預(yù)測(cè)因素；結(jié)果與于玢玢等[9]報(bào)道一致。

本研究進(jìn)一步通過Logistic回歸分析多因素與PRDX4表達(dá)關(guān)系，發(fā)現(xiàn)腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及分化程度低是影響PRDX4的表達(dá)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。Capilla等[13]報(bào)道了淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致OSCC患者死亡的主要因素之一。但是根據(jù)組織病理學(xué)檢查在臨床淋巴結(jié)檢測(cè)陰性的OSCC患者中，實(shí)際淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的發(fā)生率為34%[6]。故對(duì)于活檢標(biāo)本PRDX4表達(dá)較高的OSCC患者，術(shù)前影像學(xué)評(píng)估淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移掃描應(yīng)更全面，有助于更準(zhǔn)確的臨床評(píng)估及預(yù)后預(yù)測(cè)。

有報(bào)道表明，PRDX4可通過上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)換(EMT)參與調(diào)控腫瘤的進(jìn)展[7,14]。EMT的分子特征是E-cad下調(diào)，Vimentin、N-cadherin等上調(diào)[15]。E-cad是一種維持上皮細(xì)胞與細(xì)胞間穩(wěn)定接觸的跨膜糖蛋白，E-cad低表達(dá)與預(yù)后密切相關(guān)，也促進(jìn)各種上皮癌的侵襲和轉(zhuǎn)移[16-18]。Vimentin是誘導(dǎo)EMT過程的重要間葉標(biāo)記[19]。為了進(jìn)一步探討PRDX4與EMT的關(guān)系，本課題研究了PRDX4與E-cad及Vimentin表達(dá)之間的關(guān)系，結(jié)果顯示，在OSCC中PRDX4的表達(dá)與E-cad的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，即隨著PRDX4的表達(dá)水平升高，E-cad的表達(dá)水平明顯下降；PRDX4的表達(dá)與Vimentin的表達(dá)呈正相關(guān)，即隨著PRDX4表達(dá)水平的上升，Vimentin的表達(dá)水平明顯升高，由此表明PRDX4的過表達(dá)可能與EMT相關(guān)，通過促進(jìn)腫瘤侵襲及轉(zhuǎn)移參與了OSCC的發(fā)生發(fā)展。

綜上所述，本研究證實(shí)PRDX4在OSCC組織中高表達(dá)，且其的表達(dá)水平與OSCC的分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況及生存時(shí)間呈現(xiàn)相關(guān)性，隨著PRDX4的表達(dá)水平的增高，OSCC分化越差、越容易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，生存期越短，其可能作為判斷 OSCC 患者預(yù)后的標(biāo)志物并且是OSCC治療的潛在靶標(biāo)，PRDX4與Vimentin的表達(dá)呈正相關(guān)，而與E-cad的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，表明PRDX4可能通過EMT促進(jìn)OSCC的發(fā)生發(fā)展。但在探討PRDX4在OSCC發(fā)生發(fā)展中的機(jī)制方面，本實(shí)驗(yàn)僅研究了其與E-cad及Vimentin之間的相關(guān)關(guān)系，還有待進(jìn)一步深入研究。