榮譽(yù) 胡志東 趙娜

口腔鱗癌(oral squamous cell carcinoma,OSCC)是口腔頜面部最高發(fā)的惡性腫瘤，主要發(fā)生于舌部、口底部、牙齦、頰黏膜等部位，具有高復(fù)發(fā)性和轉(zhuǎn)移性[1]?？谇击[癌在臨床上主要是以手術(shù)為主，結(jié)合全身化學(xué)藥物治療、局部放射治療、生物治療等方法進(jìn)行輔助治療。NEAT1(nuclear paraspeckle assembly transcript1)基因產(chǎn)生一個長鏈非編碼RNA(lncRNA)，主要富集于細(xì)胞核中，是形成和維持細(xì)胞核亞結(jié)構(gòu)paraspeckle的關(guān)鍵非編碼RNA[2]。LncRNA NEAT1可以通過VEGF-A和Notch信號通路介導(dǎo)口腔鱗癌的進(jìn)展，具有顯著的加速腫瘤細(xì)胞生長和促癌作用[3]。LncRNA NEAT1是否可以通過Hippo/YAP信號通路調(diào)控口腔鱗癌細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展尚不清晰，Hippo信號通路在腫瘤發(fā)生、干細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)、組織再生和器官大小控制中起著關(guān)鍵作用。在口腔鱗癌中，激活Hippo信號通路可以抑制腫瘤的惡性生物學(xué)行為、上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，提高患者的生存率[4]。

本研究將通過轉(zhuǎn)染si-NEAT1探究NEAT1是否可以通過Hippo/YAP信號通路對人口腔鱗癌細(xì)胞SCC-9、CAL27和Tca8113增殖、凋亡、細(xì)胞周期停滯具有調(diào)控作用，并探究其磷酸化修飾在其中發(fā)揮的作用，為lncRNA NEAT1基因在腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮的作用及Hippo/YAP信號通路在口腔鱗癌中的分子修飾調(diào)控提供分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株

人口腔鱗癌細(xì)胞SCC-9、CAL27和Tca8113細(xì)胞株(中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫提供)。

1.2 主要試劑

高糖DMEM、胎牛血清和青鏈霉素(Gibco，美國)； 兔抗人Mst1/2、Lats1、P-YAP、β-actin 抗體及辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(CST公司, 美國)； si-NEAT1和陰性對照 si-NC質(zhì)粒(上海GenePharma公司)； 轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000(Invitrogen公司, 美國)。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

人口腔鱗癌細(xì)胞SCC-9、CAL27和Tca8113細(xì)胞培養(yǎng)條件: 用含有 10% FBS和1% 雙抗(100 U/mL青霉素和 100 μg/mL 鏈霉素) 的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)條件：5% CO237 ℃，按照1∶3～1∶4比例傳代[5]。劃痕實驗將調(diào)整為1×106接種于6 孔板， 24 h后用槍頭垂直于皿底劃痕， PBS清洗3 次，加入無血清培養(yǎng)基， 37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱，培養(yǎng)24 h后拍照。

將細(xì)胞調(diào)整為2×106的細(xì)胞密度接種于培養(yǎng)皿中，當(dāng)細(xì)胞生長至對數(shù)期時采用LipofectamineTM2000分別將si-NEAT和 si-NC轉(zhuǎn)染進(jìn) SCC-9、CAL27和TCA8113細(xì)胞，12 h后換液去除LipofectamineTM2000，36 h后用于各組實驗。

1.4 MTT法檢測SCC-9、CAL27和Tca8113細(xì)胞活力

將1×104個SCC-9、 CAL27和Tca8113細(xì)胞接種到6 孔板，待細(xì)胞貼壁后將細(xì)胞分為對照組、 si-NC組和si-NEAT1轉(zhuǎn)染組，并將細(xì)胞培養(yǎng)24、 48、 72 h，嚴(yán)格按照MTT試劑說明進(jìn)行操作，與酶標(biāo)儀下測定樣品吸光度[7]。

1.5 流式檢測細(xì)胞凋亡

取對數(shù)生長期的細(xì)胞按照1×104個/ml細(xì)胞密度為分別接種于6 孔板進(jìn)行培養(yǎng)，貼壁后分組對照組、 si-NC組和si-NEAT1轉(zhuǎn)染組， 48h后收集全部細(xì)胞，重懸細(xì)胞，加入Annexin V和PI混勻，BD流式細(xì)胞儀(BD FACSCantoTMⅡ 流式細(xì)胞儀, BD公司，美國)進(jìn)行細(xì)胞凋亡分析，所有操作均在冰上完成并避光孵育[8]。

1.6 Western blot 檢測蛋白表達(dá)

將對照組、 si-NC組和si-NEAT1轉(zhuǎn)染組SCC-9、CAL27和Tca8113細(xì)胞用RIPA蛋白裂解液冰上提取細(xì)胞總蛋白，將總蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳70 V 15 min、 120 V 2 h， 120V 2.5 h轉(zhuǎn)膜，TBST漂洗3 次，每次5 min， 5%脫脂奶粉封閉1 h， TBST漂洗3 次,每次5 min，5%脫脂奶粉封閉1 h，分別按照說明書加入一抗和二抗孵育，TBST漂洗后ECL顯色，發(fā)光儀(ChemiDoc 凝膠成像系統(tǒng), Bio-Rad公司，美國)曝光、拍照[9]。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 si-NEAT1對SCC-9、CAL27和Tca8113細(xì)胞活力的影響

與對照組相比，si-NEAT1組在實驗終點細(xì)胞活力顯著受到抑制，并且具有時間依賴性，差異具有顯著的統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)，而si-NC組相對于對照組沒有顯著的統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)(表 1)。

表 1 si-NEAT1對SCC-9、CAL27和Tca8113細(xì)胞活力的影響

2.2 si-NEAT1對SCC-9、CAL27和Tca8113細(xì)胞遷移能力的影響

與對照組相比，各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染si-NEAT1后遷移能力下降的趨勢，差異具有顯著的統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，而si-NC組相對于對照組沒有顯著的統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)(圖 1)。

2.3 si-NEAT1轉(zhuǎn)染對SCC-9、CAL27和Tca8113細(xì)胞凋亡的影響

通過流式分析發(fā)現(xiàn)si-NEAT1組轉(zhuǎn)染人口腔鱗癌SCC-9、CAL27和Tca8113細(xì)胞后，細(xì)胞出現(xiàn)顯著凋亡現(xiàn)象，結(jié)果具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)，而si-NC組與對照組沒有顯著的差異(P>0.05)(圖 2)。

圖 1 si-NEAT1轉(zhuǎn)染對SCC-9、CAL27和Tca8113細(xì)胞遷移的影響

圖 2 si-NEAT1轉(zhuǎn)染對SCC-9、CAL27和Tca8113細(xì)胞凋亡的影響

2.4 si-NEAT1轉(zhuǎn)染對SCC-9、CAL27和Tca8113細(xì)胞周期的影響

為了進(jìn)一步探究si-NEAT1轉(zhuǎn)染對SCC-9、CAL27和Tca8113細(xì)胞周期的影響，通過流式細(xì)胞實驗進(jìn)行了分析，結(jié)果表明si-NEAT1組細(xì)胞細(xì)胞增殖受到顯著抑制， G2/M期細(xì)胞比例顯著增高，G0/G1期細(xì)胞比例顯著降低，細(xì)胞周期阻滯在G2/M期，結(jié)果具有顯著的統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.01)。流式細(xì)胞檢測顯示si-NEAT1轉(zhuǎn)染后人口腔鱗癌SCC-9、CAL27和Tca8113發(fā)生顯著凋亡WB結(jié)果表明si-NEAT1組細(xì)胞原癌基因Bcl-2的表達(dá)顯著降低(P<0.001)。

2.5 si-NEAT1轉(zhuǎn)染對SCC-9、CAL27和Tca8113細(xì)胞抑癌通路Hippo/YAP的影響

為了探究si-NEAT1轉(zhuǎn)染抑制人口腔鱗癌SCC-9、CAL27和Tca8113生長的機(jī)制，研究了抑癌通路Hippo/Yap信號通路中關(guān)鍵分子Mst1/2、Lats1和p-Lats1， P-Yap的蛋白表達(dá)水平。Western blot結(jié)果顯示(圖3)相對于內(nèi)參β-actin，Mst1/2、Lats1蛋白表達(dá)量上調(diào)(P<0.05)， p-Lats1、P-Yap 蛋白水平增高(P<0.05)，相對定量結(jié)果進(jìn)一步證實出這種趨勢。

表 2 si-NEAT1轉(zhuǎn)染對SCC-9、CAL27和Tca8113細(xì)胞周期的影響(%)

3 討 論

口腔鱗癌通常發(fā)生在口腔， 包括舌、牙齦、頰、腭、口底等部位，由于口腔黏膜被覆的是鱗狀上皮，這些部位發(fā)生的癌變就稱為鱗狀上皮癌?？谇坏镊[狀上皮癌除了局部增生，侵蝕周圍組織造成功能障礙以外，還經(jīng)常會發(fā)生相應(yīng)的頸部的淋巴引流區(qū)的淋巴轉(zhuǎn)移[10]，是口腔癌里邊高發(fā)的惡性腫瘤。

NEAT1主要富集于細(xì)胞核中，是形成與維持細(xì)胞核亞結(jié)構(gòu)paraspeckle的關(guān)鍵非編碼RNA。NEAT1具有促進(jìn)腫瘤生長的作用，研究表明在前列腺癌種，NEAT1可被招募并富集CDC5L蛋白至細(xì)胞核中的paraspeckle，促進(jìn)CDC5L對靶基因AGRN的轉(zhuǎn)錄激活作用，AGRN起到了促進(jìn)DNA損傷修復(fù)的作用。對NEAT1表達(dá)水平的敲低抑制了CDC5L-AGRN轉(zhuǎn)錄調(diào)控通路的活性，導(dǎo)致前列腺癌細(xì)胞DNA損傷的累積，從而影響了細(xì)胞周期與增殖[11]。既有研究表明細(xì)胞的增殖,線粒體依賴性凋亡以及G2/M期周期阻滯在口腔鱗癌中發(fā)揮重要作用[12]，同時在胃癌的研究表明NEAT1在胃癌細(xì)胞中高表達(dá)，可以作為癌基因調(diào)控胃癌細(xì)胞的凋亡、侵襲、增殖和化療耐藥，可能成為胃癌新的潛在治療靶點之一[13]。

本研究發(fā)現(xiàn)si-NEAT1可使人口腔鱗癌SCC-9、CAL27和Tca8113細(xì)胞活力顯著受到抑制，與時間呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，同時可以顯著誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，同時可以顯著誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，從增殖和凋亡雙向抑制中細(xì)胞生長，進(jìn)一步本研究發(fā)現(xiàn)，si-NEAT1組細(xì)胞細(xì)胞增殖受到顯著抑制，G2/M期細(xì)胞比例顯著增高，G0/G1期細(xì)胞比例顯著降低，細(xì)胞周期阻滯在G2/M期。

Hippo信號傳導(dǎo)通路是癌癥發(fā)生和轉(zhuǎn)移、組織再生以及干細(xì)胞的功能調(diào)控上發(fā)揮著重要的信號通路。Hippo信號通路上游的膜蛋白受體感受到胞外環(huán)境的生長抑制信號后，經(jīng)過一系列激酶的磷酸化反應(yīng)，最終作用于下游效應(yīng)因子YAP。YAP蛋白能夠抑制細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡、控制器官生長發(fā)育，其功能的發(fā)揮與蛋白磷酸化相關(guān)[14]。本研究表明，si-NEAT1組細(xì)胞Mst1/2、Lats1蛋白表達(dá)量上調(diào)，p-Lats1、P-YAP蛋白水平增高，這提示si-NEAT1轉(zhuǎn)染后可以激活Hippo-YAP信號通路上游關(guān)鍵分子Mst1/2、Lats1，促使YAP蛋白磷酸化，進(jìn)而實現(xiàn)腫瘤細(xì)胞活性抑制的作用。

綜上, 本研究通過證實轉(zhuǎn)染si-NEAT1可以抑制口腔鱗癌細(xì)胞細(xì)胞增殖，細(xì)胞凋亡，調(diào)控細(xì)胞周期引發(fā)周期停滯，抑癌通路Hippo/YAP信號通路及YAP蛋白的磷酸化在此過程中發(fā)揮重要作用。