陳建華，李 雪，趙 建，朱洪賡，王海華，朱 明

1. 江蘇海洋大學(xué)/江蘇省海洋生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 連云港 222005

2. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部熱帶亞熱帶水產(chǎn)資源利用與養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510380

3. 江西省水產(chǎn)科學(xué)研究所/南昌市特種水產(chǎn)繁育與健康養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330039

鹽度是與魚(yú)類(lèi)生活密切相關(guān)的非生物環(huán)境因子之一，對(duì)魚(yú)類(lèi)正常生理活動(dòng)具有重要影響[1-2]。當(dāng)水體鹽度發(fā)生變化時(shí)，魚(yú)體內(nèi)滲透壓平衡將被打破，從而對(duì)魚(yú)類(lèi)胚胎發(fā)育[3]、幼魚(yú)存活[4]、體內(nèi)酶活性[5]及激素水平[6]等產(chǎn)生影響。研究表明，過(guò)高[7]或過(guò)低[8-9]的水體鹽度均不利于魚(yú)類(lèi)胚胎正常發(fā)育，導(dǎo)致孵化時(shí)間延長(zhǎng)，孵化率降低及畸形率升高等。水體鹽度的變化也與魚(yú)類(lèi)生長(zhǎng)性能和成活率存在緊密聯(lián)系，適當(dāng)鹽度 (3 和 5 ng·L?1) 有利于提高斑點(diǎn)叉尾鮰 (Ictalurus punctatus) 幼魚(yú)的生長(zhǎng)性能和成活率，但當(dāng)鹽度達(dá)9 ng·L?1時(shí)，其成活率急劇下降[10]。江黃顙魚(yú) (Pseudobagrus vachelliRichardson) 的生長(zhǎng)率和成活率均隨脅迫鹽度升高而下降[11]。鹽度的急性變化對(duì)魚(yú)類(lèi)的影響則更為嚴(yán)重，會(huì)引起魚(yú)類(lèi)的應(yīng)激反應(yīng)，造成其內(nèi)環(huán)境的不穩(wěn)定，能量消耗大增，甚至導(dǎo)致魚(yú)類(lèi)死亡。何燕富等[12]研究顯示馬來(lái)西亞紅羅非魚(yú) (Oreochromis mossambicus×O. niloticus) 幼魚(yú)在鹽度 25 的急性鹽度脅迫下死亡率達(dá)100%。

大鱗副泥鰍 (Paramisgurnus dabryanus)隸屬于鯉形目、鰍科、副泥鰍屬，為底棲小型魚(yú)類(lèi)，是我國(guó)特種淡水養(yǎng)殖品種，具有環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng)、養(yǎng)殖周期短、營(yíng)養(yǎng)豐富等特點(diǎn)。目前，有關(guān)大鱗副泥鰍的報(bào)道主要集中在系統(tǒng)分類(lèi)[13]、攝食規(guī)律[14]、繁殖生物學(xué)[15-16]、免疫反應(yīng)[17]、轉(zhuǎn)錄組測(cè)序[18]以及成鰍耐鹽性[19]等方面。研究顯示，鰍科魚(yú)類(lèi)具有一定的耐鹽特性，其耐鹽能力高于大多數(shù)淡水魚(yú)類(lèi)，可作為鹽堿水域的增養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)[19]，但有關(guān)鹽度對(duì)大鱗副泥鰍胚胎及仔魚(yú)階段影響的報(bào)道較少；此外，我國(guó)擁有大量的鹽堿水域資源，該水域的鹽堿度高于淡水，不利于魚(yú)類(lèi)等水生生物的生存[20]，極大地限制了鹽堿水域資源的利用，造成大量水域資源荒廢。本研究探討了鹽度對(duì)大鱗副泥鰍胚胎及仔魚(yú)發(fā)育的影響，深入了解其對(duì)鹽度的適應(yīng)性，以期為選育鹽堿水域養(yǎng)殖品種提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

從本地泥鰍產(chǎn)業(yè)園挑選健康、活力強(qiáng)的成鰍作為親鰍 [體長(zhǎng) (20±2.2) cm，體質(zhì)量 (142.5±26.4) g]，通過(guò)注射催產(chǎn)藥物后進(jìn)行人工授精獲得受精卵。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 鹽度對(duì)胚胎孵化及仔魚(yú)生長(zhǎng)的影響

依據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果設(shè)置鹽度0 (對(duì)照)、2、4、6、8、10組，每組設(shè)3個(gè)平行。各鹽度組試液均用充分曝氣的自來(lái)水與過(guò)濾的海水配制并用鹽度計(jì)校正。實(shí)驗(yàn)所用容器為長(zhǎng) 300 mm×寬 200 mm×高147 mm的塑料箱，每個(gè)塑料箱中盛入3 L相應(yīng)鹽度的實(shí)驗(yàn)用水，隨機(jī)放入100枚發(fā)育至原腸期的胚胎開(kāi)始實(shí)驗(yàn)，直至仔魚(yú)卵黃囊完全吸收為止。實(shí)驗(yàn)期間，每12 h更換1/3相應(yīng)鹽度的水體，水溫為23～24 ℃。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中用Nikon體視鏡觀察并拍攝胚胎及仔魚(yú)的形態(tài)特征，計(jì)算各組孵化率、畸形率、仔魚(yú)成活率、孵化時(shí)間、仔魚(yú)全長(zhǎng)及特定生長(zhǎng)率(SGR) 和卵黃囊吸收率 (R)。

式中：LT為仔魚(yú)最終全長(zhǎng) (μm)；L0為初孵仔魚(yú)全長(zhǎng) (μm)；t為仔魚(yú)孵化到實(shí)驗(yàn)結(jié)束所經(jīng)歷的時(shí)間 (d)。

式中：V0為初孵仔魚(yú)卵黃囊體積；Vt為實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)仔魚(yú)卵黃囊體積；t為經(jīng)歷的時(shí)間 (h)。

由于大鱗副泥鰍發(fā)育不同時(shí)期卵黃囊形狀不同，分別選取2種不同形狀時(shí)卵黃囊體積的計(jì)算公式[21-22]。當(dāng)卵黃囊成錘形時(shí)，其體積分為兩部分，即膨大部分和狹長(zhǎng)部分，計(jì)算公式為V=L1H12π/6+L2H22π/12；當(dāng)卵黃囊成柱狀時(shí)，為V=LH2π/12。兩式中：L1為卵黃囊膨大部分長(zhǎng)徑；L2為卵黃囊狹長(zhǎng)部分長(zhǎng)徑；H1為卵黃囊膨大部分短徑；H2為卵黃囊狹長(zhǎng)部分短徑；L為卵黃囊長(zhǎng)徑；H為卵黃囊短徑。

1.2.2 不同鹽度下不投餌存活系數(shù) (Survival activity index, SAI) 的測(cè)定

仔魚(yú)活力以SAI作為衡量指標(biāo)[23]。仔魚(yú)完全孵出后，挑選無(wú)畸形的正常仔魚(yú)50尾，放入不同鹽度 (0、2、4、6、8、10)、直徑為 20 cm 的圓形桶中靜水培育，每組設(shè)3個(gè)平行。實(shí)驗(yàn)期間不投餌，每天更換1/2相應(yīng)鹽度的水體，發(fā)現(xiàn)死魚(yú)及時(shí)撈出，每日統(tǒng)計(jì)仔魚(yú)死亡情況，直至仔魚(yú)全部死亡，比較其 SAI。SAI計(jì)算公式為：

式中：N為起始的仔魚(yú)數(shù)；k為仔魚(yú)全部死亡所需時(shí)間 (d)；hi為第i天時(shí)仔魚(yú)的累計(jì)死亡數(shù)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差 (SD)”表示，利用SPSS 26.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析 (One-way ANOVA) 和 LSD 多重比較分析組間的差異性，P<0.05為差異顯著。柱狀圖由Origin 2018軟件繪制，圖片處理使用Photoshop 2020軟件。

2 結(jié)果

2.1 鹽度對(duì)胚胎孵化時(shí)間和孵化率的影響

胚胎在不同鹽度水體中的孵化情況見(jiàn)表1。胚胎孵化時(shí)間在鹽度為2和4時(shí)顯著短于其他組 (P<0.05)，之后隨著鹽度的升高其孵化時(shí)間延長(zhǎng)并顯著長(zhǎng)于對(duì)照組 (P<0.05)。胚胎孵化率在低鹽度 (2和4) 時(shí)略有增加，之后則隨著鹽度的增加而下降，但不同鹽度組間差異不顯著 (P>0.05)。

表1 不同鹽度下大鱗副泥鰍胚胎的孵化時(shí)間和孵化率 (±SD)Table 1 Incubation time and hatching rate of P. dabryanus at different salnities

表1 不同鹽度下大鱗副泥鰍胚胎的孵化時(shí)間和孵化率 (±SD)Table 1 Incubation time and hatching rate of P. dabryanus at different salnities

注：同行中不同字母表示差異顯著 (P<0.05)。Note:Values with different letters within the same column have significant difference (P<0.05).

指標(biāo)Index鹽度組 Salinity group對(duì)照 Control 2 4 6 8 10孵化時(shí)間Incubation time/h 26.1±0.1d 22.2±0.2e 22.1±0.3e 28.8±0.0c 31.3±0.64b 31.2±0.17a孵化率Hatching rate/% 50.67±2.5ab 51.00±4.36ab 53.67±2.1a 47.33±7.57ab 43.67±4.04b 43.33±3.79b

2.2 鹽度對(duì)仔魚(yú)畸形率和成活率 [3 日齡 (Days after hatching, dah)]的影響

仔魚(yú)畸形率隨鹽度的升高而逐漸增加，其中鹽度10組畸形率最高，為對(duì)照組的6.08倍 (圖1)。通過(guò)對(duì)仔魚(yú)形態(tài)的觀察發(fā)現(xiàn)，在鹽度脅迫下仔魚(yú)主要出現(xiàn)尾部彎曲、短小，脊柱彎曲、圍心腔水腫及卵黃囊異常等畸形現(xiàn)象 (圖2)。仔魚(yú)出膜3 dah后，鹽度0、2、4組成活率均達(dá)90%以上，而從鹽度6組開(kāi)始顯著降低，在鹽度10時(shí)幾乎全部死亡 (圖1)。

圖1 不同鹽度對(duì)大鱗副泥鰍仔魚(yú)畸形率和成活率的影響注：同一系列方柱上不同字母表示差異顯著 (P<0.05)。后圖同此。Fig. 1 Effects of different salnities on abnormality rate and survival rate of P. dabryanus larvaeNote:Different letters on the same series of columns indicate significant difference (P<0.05). The same case in the following figures.

圖2 不同鹽度對(duì)大鱗副泥鰍仔魚(yú)發(fā)育的影響Fig. 2 Effects of different salinities on development of P. dabryanus larvae

2.3 不同鹽度對(duì)仔魚(yú)生長(zhǎng)的影響

在鹽度為2、4和6時(shí)，初孵仔魚(yú)全長(zhǎng)顯著低于對(duì)照組 (P<0.05)，之后隨著鹽度上升而增加，其中鹽度10組的全長(zhǎng)高于對(duì)照組 (圖3)。3 dah仔魚(yú)的全長(zhǎng)則隨著鹽度升高而下降，其中鹽度8組的全長(zhǎng)顯著低于對(duì)照組 (P<0.05)。大鱗副泥鰍仔魚(yú)特定生長(zhǎng)率呈現(xiàn)先升后降的趨勢(shì) (圖4)，其中鹽度2和4組顯著高于對(duì)照組 (P<0.05)，而鹽度8組則顯著降低 (P<0.05)。

圖4 不同鹽度對(duì)大鱗副泥鰍仔魚(yú)特定生長(zhǎng)率的影響Fig. 4 Effects of different salinities on specific growth rate of P. dabryanus larvae

2.4 不同鹽度對(duì)仔魚(yú)卵黃囊吸收率的影響

隨著鹽度的升高，仔魚(yú)卵黃囊吸收率呈現(xiàn)先升后降的趨勢(shì)，其中鹽度2和4組仔魚(yú)卵黃囊吸收率顯著高于對(duì)照組 (圖5，P<0.05)。

圖5 不同鹽度對(duì)大鱗副泥鰍仔魚(yú)卵黃囊吸收率的影響Fig. 5 Effects of different salinities on yolk absorption rate of P. dabryanus larvae

2.5 不同鹽度對(duì)仔魚(yú) SAI的影響

仔魚(yú)SAI隨著水體鹽度的升高先增后降 (圖6)。當(dāng)鹽度為4時(shí)SAI最高；而在鹽度8和10時(shí)SAI顯著下降 (P<0.05)。鹽度≤6時(shí)仔魚(yú)存活時(shí)間最長(zhǎng)(9 d)；鹽度8時(shí)仔魚(yú)存活4～5 d，而鹽度10時(shí)仔魚(yú)在第3天時(shí)全部死亡。

圖6 不同鹽度對(duì)大鱗副泥鰍仔魚(yú)活力的影響Fig. 6 Effects of different salinities on survival activity index of P. dabryanus

3 討論

3.1 大鱗副泥鰍胚胎發(fā)育與鹽度的關(guān)系

鹽度是影響魚(yú)類(lèi)胚胎發(fā)育的重要生態(tài)因子之一。環(huán)境鹽度的變化將影響魚(yú)類(lèi)受精卵膜內(nèi)外滲透壓平衡，盡管魚(yú)類(lèi)受精卵本身具有一定的滲透壓調(diào)節(jié)能力，但能力有限[24]。鹽度過(guò)高或過(guò)低會(huì)造成卵膜內(nèi)外滲透壓差變化劇烈，使膜與周?chē)h(huán)境之間正常的物質(zhì)交換受阻，導(dǎo)致發(fā)育中的胚胎細(xì)胞不能正常分裂或存活[25]，引起胚胎發(fā)育畸形甚至死亡，最終影響到胚胎孵化率[26-27]。本研究中，胚胎孵化率在低鹽度 (2和4) 時(shí)略有增加，之后隨著鹽度增加而下降，這可能是在適鹽范圍內(nèi)，通過(guò)卵內(nèi)原生質(zhì)層調(diào)節(jié)使受精卵內(nèi)滲透壓保持相對(duì)穩(wěn)定[28]，從而使胚胎具有較高的孵化率；但隨著水體鹽度的升高，卵膜內(nèi)外滲透壓差超過(guò)胚胎的調(diào)節(jié)能力范圍，導(dǎo)致其胚胎孵化率下降。

魚(yú)類(lèi)胚胎孵化出膜主要依靠孵化酶作用和胚體運(yùn)動(dòng)，前者使卵膜溶解減薄[29]。有研究表明，孵化酶的活性受環(huán)境因子的影響，如底鳉 (Fundulus grandis) 孵化酶具有嗜鹽性，當(dāng)鈉離子(Na+)強(qiáng)度低于0.05 mol·L?1時(shí)，在 18 h 內(nèi)酶的活力便會(huì)喪失 50%，但添加氯化鈉 (NaCl) 可使其在 48 h 內(nèi)恢復(fù)活性[30]。本研究中，在較低鹽度時(shí)胚胎孵化時(shí)間縮短，而隨著鹽度升高其孵化時(shí)間則明顯延長(zhǎng)。這種情況在尖鰭鯉 (Cyprinus acutidorsalis)[31]和廣東魴 (Megalobrama hoffmanni)[32]中也存在，適當(dāng)?shù)乃w鹽度能夠縮短孵化時(shí)間，但當(dāng)鹽度超過(guò)一定范圍時(shí)，其胚胎發(fā)育則受到抑制，從而導(dǎo)致胚胎孵化時(shí)間延長(zhǎng)。這種現(xiàn)象可能是低鹽度環(huán)境有利于激活孵化酶活性，而在較高的鹽度環(huán)境中孵化酶的活性受到破壞所致。

3.2 大鱗副泥鰍仔魚(yú)畸形率和成活率與鹽度的關(guān)系

研究表明，鹽度對(duì)早期仔魚(yú)生長(zhǎng)有一定影響，鹽度升高可能造成仔魚(yú)畸形率上升，進(jìn)而導(dǎo)致成活率下降[33]。本研究中，從鹽度6開(kāi)始大鱗副泥鰍仔魚(yú)的成活率顯著下降，在鹽度10時(shí)幾乎全部死亡；仔魚(yú)畸形率也隨鹽度的升高而逐漸增加。這說(shuō)明鹽度對(duì)大鱗副泥鰍仔魚(yú)發(fā)育和成活產(chǎn)生一定影響，在適當(dāng)鹽度范圍內(nèi)仔魚(yú)成活率較高，鹽度進(jìn)一步升高則不利于發(fā)育及成活。這可能由于低鹽度更接近魚(yú)類(lèi)等滲點(diǎn)，此時(shí)仔魚(yú)用于調(diào)節(jié)體內(nèi)滲透壓平衡所消耗的能量較少；而在較高鹽度的水體中，由于仔魚(yú)出膜后失去了卵膜的保護(hù)作用，其滲透壓調(diào)節(jié)機(jī)制尚不完善，對(duì)環(huán)境變化的耐受力差，而且仔魚(yú)需要消耗更多能量用于維持體內(nèi)滲透壓的穩(wěn)定，導(dǎo)致其活動(dòng)能力減弱，從而引起死亡率急劇上升[34]。

3.3 鹽度對(duì)大鱗副泥鰍仔魚(yú)生長(zhǎng)發(fā)育的影響

仔魚(yú)的體生長(zhǎng)與其發(fā)育程度密切相關(guān)[35]，早期發(fā)育階段是魚(yú)類(lèi)的各種器官系統(tǒng)、生理機(jī)能形成和完善的重要時(shí)期，此時(shí)環(huán)境因子的變化極易影響其發(fā)育程度，從而影響仔魚(yú)生長(zhǎng)[36]。本研究中，鹽度8組的3 dah仔魚(yú)全長(zhǎng)和特定生長(zhǎng)率均顯著降低，說(shuō)明較高鹽度對(duì)大鱗副泥鰍仔魚(yú)的生長(zhǎng)具有一定的抑制作用。這主要是因?yàn)樗w鹽度升高，使仔魚(yú)發(fā)育過(guò)程中需要?jiǎng)佑酶嗟哪芰縼?lái)維持體內(nèi)滲透壓平衡，而用于仔魚(yú)生長(zhǎng)的能量則相應(yīng)減少，從而減緩仔魚(yú)全長(zhǎng)的增加。

仔魚(yú)在開(kāi)口攝食前通過(guò)吸收卵黃囊中的營(yíng)養(yǎng)維持機(jī)體發(fā)育需要，卵黃囊吸收的快慢能反映出仔魚(yú)的生長(zhǎng)發(fā)育狀況。本研究中，鹽度2和4組仔魚(yú)卵黃囊消耗速度最快，而鹽度8低于對(duì)照組。這可能是因?yàn)榈望}度 (2和4) 有利于大鱗副泥鰍仔魚(yú)的生長(zhǎng)發(fā)育，其生長(zhǎng)速度相對(duì)較快，從而需要消耗更多的能量來(lái)滿足機(jī)體生長(zhǎng)，而鹽度的升高則延遲了卵黃囊期仔魚(yú)發(fā)育，導(dǎo)致其卵黃囊吸收減慢。

初孵仔魚(yú)出膜后，在不投餌的情況下依靠卵黃囊可以存活一段時(shí)間，其存活時(shí)間長(zhǎng)短與受精卵質(zhì)量、卵黃囊營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)數(shù)量和質(zhì)量以及仔魚(yú)生活環(huán)境等因素有關(guān)[37-38]。SAI是判斷仔魚(yú)活力、質(zhì)量好壞的常用指標(biāo)之一[39-40]。通常來(lái)說(shuō)，仔魚(yú)存活時(shí)間越久，SAI越大，表明仔魚(yú)活力越好。本研究中，鹽度為0～6時(shí)，仔魚(yú)SAI較高，活力較好；而鹽度8～10時(shí)，SAI 下降明顯，表明鹽度偏高不利于大鱗副泥鰍仔魚(yú)生存，這與馮廣鵬等[41]及王宏田和張培軍[25]的研究結(jié)果相似?？赡苁且?yàn)榈望}度條件下，仔魚(yú)用于維持體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定所消耗的能量較小，而更多的能量可用于機(jī)體正常生長(zhǎng)發(fā)育。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，適當(dāng)?shù)乃w鹽度對(duì)大鱗副泥鰍胚胎孵化及仔魚(yú)生長(zhǎng)有一定的促進(jìn)作用，但當(dāng)鹽度高于6時(shí)則不利于其胚胎及仔魚(yú)發(fā)育。綜合各項(xiàng)指標(biāo)，大鱗副泥鰍胚胎發(fā)育及仔魚(yú)生長(zhǎng)的適宜鹽度為0～4。因此，在大鱗副泥鰍苗種繁育生產(chǎn)實(shí)踐中使用適宜鹽度的孵化用水可獲得更佳的苗種生產(chǎn)效果。