王倩倩 胡耀仁 高國生,3

1.寧波大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，浙江寧波 315020；2.中國科學(xué)院大學(xué)寧波華美醫(yī)院肝病科，浙江寧波 315010；3.浙江省消化系統(tǒng)腫瘤診治及研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江寧波 315010

慢加急性肝衰竭（acute–on–chronic liver failure，ACLF）是指在慢性肝臟疾病基礎(chǔ)上經(jīng)急性誘因刺激導(dǎo)致的大量肝細(xì)胞壞死的肝衰竭綜合征，臨床表現(xiàn)為急性黃疸加深、凝血功能重度障礙等。ACLF 的誘因眾多，主要包括嗜肝病毒感染、藥物和肝毒性物質(zhì)（如酒精、化學(xué)制劑等）攝入等；我國為乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染的高流行區(qū)域，因此HBV 相關(guān)ACLF 占比高達(dá)90%以上。慢性HBV 感染相關(guān)疾病重癥化的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，與免疫損傷、內(nèi)毒素血癥、微循環(huán)障礙等均有關(guān)聯(lián)，系病毒和宿主兩方面共同作用的結(jié)果，其中HBV 基因突變導(dǎo)致的病毒生物學(xué)特性改變及免疫耐受失衡是重要的影響因素。本文基于基因芯片技術(shù)對(duì)慢性乙型肝炎（chronic hepititis B，CHB）和HBV 相關(guān)ACLF 患者基本核心啟動(dòng)子區(qū)（basic core promoter，BCP）A1762T/G1764A、前C 區(qū)G1896A 突變情況進(jìn)行檢測(cè)，以期為闡明HBV 相關(guān)ACLF 發(fā)病機(jī)制提供循證醫(yī)學(xué)依據(jù)，并為臨床診治提供新思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料

納入2010 年9 月至2020 年10 月在中國科學(xué)院大學(xué)寧波華美醫(yī)院肝病中心就診的403 例慢性HBV感染患者，其中男349 例，女54 例，年齡36.00（30.00～42.00）歲。根據(jù)是否發(fā)生ACLF 將其分為CHB 組（369 例）和ACLF 組（34 例）；ACLF 組患者病情好轉(zhuǎn)出院或3 個(gè)月內(nèi)病情穩(wěn)定者歸為緩解組，病情惡化、放棄治療自動(dòng)出院、死亡者歸為惡化組。納入標(biāo)準(zhǔn)：①慢性HBV 感染診斷符合《慢性乙型肝炎防治指南（2019 年版）》，臨床表現(xiàn)為乏力、畏食、惡心、腹脹、肝區(qū)疼痛等；ACLF 診斷符合《肝衰竭診療指南（2018 年版）》，臨床表現(xiàn)為迅速加深的黃疸、嚴(yán)重凝血功能障礙和程度不等的肝衰竭。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他肝炎病毒感染；②合并惡性腫瘤；③合并酒精性肝病、藥物性肝病、自身免疫性肝病；④妊娠期女性；⑤關(guān)鍵實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)缺失。本研究經(jīng)中國科學(xué)院大學(xué)寧波華美醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)同意（批件號(hào)：PJ–NBEY–KY–2017–070–01），所有患者均簽署書面告知同意書。

1.2 檢測(cè)方法

所有患者均于入院時(shí)檢測(cè)肝功能、乙肝三系定量、HBV–DNA 和A1762T/G1764A、G1896A 突變，261 例患者檢測(cè)了凝血酶原時(shí)間（prothrombin time，PT）。乙肝三系定量檢測(cè)采用美國 Abbott 公司ARCHITECT i2000SR化學(xué)發(fā)光免疫分析儀及配套試劑盒；HBV–DNA 檢測(cè)采用美國Applied Biosystems公司ABI 7500型熒光定量PCR儀和中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司提供的試劑盒；A1762T/G1764A、G1896A 突變檢測(cè)采用基因芯片法，相關(guān)技術(shù)由寧波瑞芯生物科技有限公司提供，操作步驟見課題組前期文獻(xiàn)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 16.0 軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料經(jīng)Shapiro–Wilk 檢驗(yàn)均為非正態(tài)分布，采用中位數(shù)（四分位數(shù)間距）即（Q，Q）表示，兩組間比較采用Mann–Whitney檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料用例數(shù)（百分率）[（%）]表示，比較采用χ檢驗(yàn)；采用多因素Logistic 回歸分析篩選發(fā)生ACLF的獨(dú)立影響因素，并構(gòu)建聯(lián)合預(yù)測(cè)模型。同時(shí)繪制受試者操作特征曲線（receiver operating characteristic curve，ROC 曲線），以曲線下面積（area under curve，AUC）評(píng)價(jià)模型的診斷價(jià)值。<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CHB 組和ACLF 組患者的臨床特征及A1762T/G1764A、G1896A 突變情況

ACLF 組患者的年齡、總膽紅素（total bilirubin，TBiL）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（aspartate transaminase，AST）、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、甲胎蛋白（alpha fetoprotein，AFP）、凝血酶原時(shí)間（prothrombin time，PT）均顯著高于 CHB 組（<0.05），乙型肝炎e 抗原（hepatitis B e antigen，HBeAg）陽性率、白蛋白（albumin，ALB）均顯著低于CHB 組（<0.05）。兩組患者A1762T/G1764A突變率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（>0.05），ACLF 組患者G1896A 突變率顯著高于CHB 患者（<0.05），見表1。

2.2 影響ACLF 發(fā)生的多因素Logistic 回歸分析

對(duì)表1 中存在差異的指標(biāo)進(jìn)行多因素Logistic 回歸分析，結(jié)果顯示年齡、TBiL、ALB、G1896A 突變均是發(fā)生ACLF 的獨(dú)立影響因素（<0.05），見表2?；谏鲜? 項(xiàng)指標(biāo)建立聯(lián)合預(yù)測(cè)模型，其診斷ACLF的AUC 為0.950（<0.001），敏感度和特異性分別為88.24%和93.22%，見圖1。

圖1 聯(lián)合預(yù)測(cè)模型診斷ACLF 的ROC 曲線

表1 CHB 組和ACLF 組患者的臨床特征及A1762T/G1764A、G1896A 突變情況比較

表2 影響ACLF 發(fā)生的多因素Logistic 回歸分析

2.3 緩解組和惡化組患者的A1762T/G1764A、G1896A突變率比較

緩解組和惡化組患者的A1762T/G1764A、G1896A突變率比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（>0.05），見表3。

表3 緩解組和惡化組患者的A1762T/G1764A、G1896A 突變率比較[n（%）]

3 討論

患者感染HBV 后的臨床結(jié)局受病毒、肝細(xì)胞及宿主免疫反應(yīng)等多方面影響。由于HBV 的復(fù)制要經(jīng)過前基因組RNA 的反轉(zhuǎn)錄過程，而反轉(zhuǎn)錄酶缺乏穩(wěn)定的校對(duì)功能，在環(huán)境壓力及藥物誘導(dǎo)等作用下，發(fā)生突變的頻率較高。HBV 變異可打破機(jī)體內(nèi)已經(jīng)建立的固有免疫平衡，通過改變病毒的生物學(xué)特性誘導(dǎo)肝細(xì)胞炎癥加重，促使嚴(yán)重肝損害的發(fā)生。針對(duì)乙型肝炎重癥化機(jī)制的探討一直是臨床關(guān)注的焦點(diǎn)，目前針對(duì)HBV 變異與ACLF 相關(guān)性的研究較少，且結(jié)論存在爭(zhēng)議。

本研究對(duì)369 例CHB 患者和34 例ACLF 患者的A1762T/G1764A、G1896A 突變進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)ACLF 患者的A1762T/G1764A 和G1896A 突變率分別為61.76%、50.00%，而CHB 患者A1762T/G1764A和G1896A 的突變率分別為59.08%、31.17%，其中G1896A 突變?cè)贏CLF 患者中顯著增高。有研究者認(rèn)為ACLF 患者的A1762T/G1764A 和G1896A 突變率均顯著高于CHB 患者，特別是馬曉艷等發(fā)現(xiàn)A1762T/G1764A 突變率高達(dá)90%。閆濤等則認(rèn)為ACLF 患者的A1762T/G1764A 突變率約為73.50%，且不具備ACLF 特異性。趙振剛也認(rèn)為A1762T/G1764A 突變?cè)贏CLF 和CHB 患者之間無差異。Malik等對(duì)567 例印度籍HBV 感染者的病毒變異情況進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)A1762T/G1764A 突變?cè)贑HB和暴發(fā)性肝炎中的發(fā)生率分別為33.5%和37.6%，兩組間未見顯著差異，認(rèn)為A1762T/G1764A 突變與肝臟炎癥加劇無關(guān)。由此可見不同文獻(xiàn)對(duì)HBV 基因突變率的報(bào)道差異較大，分析原因可能與納入研究對(duì)象的選擇、地域、種族，甚至檢測(cè)手段等的不同均有關(guān)聯(lián)。

本研究結(jié)果顯示，年齡、TBiL、ALB、G1896A突變均是發(fā)生ACLF 的獨(dú)立影響因素，G1896A 突變者發(fā)生ACLF 的風(fēng)險(xiǎn)是無突變者的3.6 倍。徐航娣通過多因素分析發(fā)現(xiàn)T216C、G1896A、C1913A/G 和A2159G/C 均是ACLF 發(fā)病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，這與本研究結(jié)論吻合，由此可見G1896A 突變與慢性乙肝重癥化密切相關(guān)。由于HBeAg 與乙型肝炎核心抗原（hepatitis B core antigen，HBcAg）針對(duì)T 細(xì)胞表現(xiàn)出類似的免疫原性，故前者在某種程度上抑制細(xì)胞毒性T 淋巴細(xì)胞對(duì)肝細(xì)胞表面的HBcAg 免疫攻擊，進(jìn)而誘導(dǎo)機(jī)體免疫耐受的產(chǎn)生。G1896A 突變的出現(xiàn)導(dǎo)致第28 位密碼由色氨酸TGG 突變成終止密碼TAG，減少或終止HBeAg 的合成，這將引起機(jī)體免疫系統(tǒng)對(duì)受感染的肝細(xì)胞發(fā)動(dòng)高強(qiáng)度的殺傷作用，促使肝細(xì)胞大量急性壞死而發(fā)生肝衰竭。另外，HBV 基因突變還可引起調(diào)節(jié)性T 淋巴細(xì)胞、輔助性T 淋巴細(xì)胞17 表達(dá)上調(diào)，進(jìn)一步加劇機(jī)體免疫狀態(tài)的失衡。既往關(guān)于A1762T/G1764A、G1896A 突變與ACLF 預(yù)后的關(guān)系也多有探討，余彩霞等認(rèn)為A1762T/G1764A、G1896A 突變與預(yù)后不良有關(guān)；但肖蕾發(fā)現(xiàn)A1762T/G1764A、G1896A 突變可能與轉(zhuǎn)歸無關(guān)，這與本研究結(jié)論一致。

綜上，HBV 相關(guān)ACLF 患者的前C 區(qū)G1896A突變率顯著增高，G1896A 突變是ACLF 發(fā)病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，而BCP 區(qū)A1762T/G1764A 突變與ACLF的關(guān)系可能并不緊密。本研究也存在一定的局限性，某些關(guān)鍵性指標(biāo)如PT 由于檢測(cè)不完整，未納入最終的分析可能影響最終結(jié)果，且本研究樣本量較小，確切結(jié)論仍需大樣本、多中心、設(shè)計(jì)更合理的研究予以驗(yàn)證。