賴名耀，李少群，李新晨，邵媛，郁潔，李海南，李娟，胡清軍，周江芬，艾茹玉，周兆明，林濤，金鑫，穆林森，歐陽(yáng)輝，魯明，范曉虎，蔡林波（1.廣東三九腦科醫(yī)院 a.腫瘤科;b.病理科;c.神經(jīng)外科，廣東 廣州 510510；.南京傳奇生物科技有限公司，江蘇 南京 11100）

膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（glioblastoma，GBM）為顱內(nèi)最常見的原發(fā)性惡性腦腫瘤，發(fā)病率為3.2/10 000[1]，治療手段有限，臨床上常用手術(shù)、放療、化療及腫瘤電場(chǎng)治療[2]，患者預(yù)后差，復(fù)發(fā)率極高，中位生存期僅為14～15 個(gè)月，5 年生存率不足10%[3]。近年來(lái)，新興療法如靶向治療和免疫治療已成為GBM的研究熱點(diǎn)，但腫瘤異質(zhì)性[4]和免疫微環(huán)境[5]等問(wèn)題導(dǎo)致臨床研究結(jié)果不佳[6]。在臨床前研究[7-8]中，常用的GBM 腫瘤模型采用人源腫瘤細(xì)胞異種移植和人源腫瘤組織來(lái)源移植瘤模型，但兩者均無(wú)法再現(xiàn)臨床腫瘤的異質(zhì)性和微環(huán)境，用于藥物開發(fā)和臨床療效預(yù)測(cè)具有一定的局限性。近年來(lái)興起的腫瘤組織類器官模型彌補(bǔ)了以上缺點(diǎn)。類器官作為3D細(xì)胞培養(yǎng)物高度模擬人體組織，具有與親本組織相似的結(jié)構(gòu)和功能，使得體外研究結(jié)果更加接近體內(nèi)真實(shí)情況[9-10]。腫瘤組織類器官已廣泛覆蓋各種類型的實(shí)體瘤[11-18]，并應(yīng)用于體外腫瘤免疫微環(huán)境的建立[19]、藥物敏感性檢測(cè)、腫瘤發(fā)展與耐藥機(jī)制研究[13,20]等各個(gè)方面。本研究探索膠質(zhì)母細(xì)胞瘤類器官（glioblastoma organoid，GBO）的制備方法，通過(guò)將腫瘤組織剪成小的碎片，在三維條件下培養(yǎng)形成類器官球組織，為后續(xù)GBM患者的個(gè)體化治療研究提供實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?/p>

1 材料與方法

1.1 GBM標(biāo)本來(lái)源

腫瘤組織標(biāo)本取自2021年3月至11月在廣東三九腦科醫(yī)院新診斷GBM患者，納入研究患者共8例，所有患者均行MRI 影像檢查，按照2016 年WHO 中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤診斷標(biāo)準(zhǔn)確診為GBM，研究方案經(jīng)廣東三九腦科醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（倫理審批編號(hào)：2020-040-073）。

1.2 主要試劑

兩性霉素B（貨號(hào)：S1636）購(gòu)自美國(guó)Selleckchem公司，Hibernate-A 培養(yǎng)基（貨號(hào)：A12475-01）、神經(jīng)基質(zhì)培養(yǎng)基（貨號(hào)：21103-049）、DMEM/F12 培養(yǎng)基（貨號(hào)：11320-033）、100×N2 添加劑（貨號(hào)：17502-048）、50×B27 添加劑（貨 號(hào)：17504-044）、100×GlutaMAX（貨 號(hào)：35050-061）、100×MEM NEAA（貨號(hào)：11140-050）、青鏈霉素雙抗（貨號(hào)：15140-122）均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，人胰島素（貨號(hào)：I9278-5ML）購(gòu)自Sigma 公司，β-巰基乙醇（貨號(hào)：21985023）購(gòu)自賽默飛世爾科技有限公司，6 孔低吸附培養(yǎng)板（貨號(hào)：3471）購(gòu)自美國(guó)康寧公司，Y-27632（貨號(hào)：72306）購(gòu)自加拿大Stemcell 公司。免疫組化抗體：一抗GFAP抗體（貨號(hào)：CGM-0150）購(gòu)自賽諾特生物，OLIGO2 抗體（貨號(hào)：GT221302）、ATRX 抗體（貨號(hào)：GT224102）、Ki67抗體（貨號(hào)：GT209407）均購(gòu)自基因科技股份有限公司。

1.3 培養(yǎng)基配制

組織清洗液：含青鏈霉素雙抗的DPBS 溶液；組織剪切液：Hibernate-A 培養(yǎng)基中加入1×GlutaMax、100 U/mL 青鏈霉素雙抗、2 μg/mL 兩性霉素B；類器官完全培養(yǎng)基：參考文獻(xiàn)[21]并做了如下改進(jìn)：向50% DMEM/F12 培養(yǎng)基中加入50%神經(jīng)基質(zhì)培養(yǎng)基、1×N2添加劑、1×B27添加劑、1×GlutaMAX、1×MEM NEAA、100 IU/mL青鏈霉素雙抗、2.5 μg/mL人胰島素、50 μmol/L β-巰基乙醇，并混合均勻；類器官凍存液：向類器官完全培養(yǎng)基中加入10%DMSO和10 μmol/L的Y-27632。

1.4 GBO的培養(yǎng)

取術(shù)中切除的新鮮GBM 組織，嚴(yán)格按照無(wú)菌操作原則將腫瘤組織放入提前預(yù)冷的Hibernate-A培養(yǎng)基中保存，取回的腫瘤組織標(biāo)本放入90 mm 培養(yǎng)皿內(nèi)，用組織清洗液清洗3次，盡可能地去除血塊、壞死及非腫瘤組織；將清理干凈的組織放入組織切割液中，將腫瘤組織剪成0.5～1 mm直徑的腫瘤組織碎片，收集于15 mL 無(wú)菌離心管，用10 mL DPBS 緩沖液清洗2 次后，用紅細(xì)胞裂解液去除紅細(xì)胞，再用10 mL DMEM/F12 培養(yǎng)基清洗2次，最后用GBO 培養(yǎng)液重懸腫瘤組織碎片；取干凈的低吸附6 孔培養(yǎng)板，每孔加入4 mL 類器官培養(yǎng)液，每孔加入的腫瘤組織碎片約為20個(gè)，然后放入培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)。在37 ℃、5%CO2、90%濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔48 h 換液1次，1～2周后GBM組織碎片可培養(yǎng)形成球形的GBO。

1.5 GBO的傳代、凍存和復(fù)蘇

GBO傳代：腫瘤組織生長(zhǎng)到一定程度，組織球中間會(huì)因缺氧和營(yíng)養(yǎng)出現(xiàn)壞死。因此，GBO 培養(yǎng)時(shí)間超過(guò)4周或組織球的直徑大于1 mm時(shí)可進(jìn)行傳代培養(yǎng)；將直徑大于1 mm 的GBO 放置在玻璃皿中，用精細(xì)剪刀將GBO 剪成0.5 mm 左右的腫瘤組織碎片。剪完后收集組織球碎片至15 mL 離心管，棄上清液，用DMEM/F12 培養(yǎng)基清洗3次，再用GBO 培養(yǎng)基重懸腫瘤組織碎片，放置于低吸附6孔板中繼續(xù)培養(yǎng)。

GBO凍存：用精細(xì)剪刀將GBO剪成0.3 mm左右的腫瘤組織碎片，用GBO 培養(yǎng)基清洗1 次去除細(xì)胞碎片，用含有10 μmol/L 的Y-27632 的GBO 培養(yǎng)基重懸，孵育1 h后收集腫瘤組織碎片于15 mL離心管，棄上清液，再用GBO凍存液重懸組織碎片，室溫中靜置15 min，后按照每管20個(gè)GBO進(jìn)行分裝，放入程序降溫盒中進(jìn)行凍存，24 h后轉(zhuǎn)移至液氮罐中長(zhǎng)期保存。

GBO 復(fù)蘇：從液氮罐中取出凍存管，采用37 ℃水浴快速?gòu)?fù)溫，將液體轉(zhuǎn)移至15 mL 離心管，然后逐滴加入含有10 μmol/L 的Y-27632 的GBO 培養(yǎng)基，同時(shí)輕搖離心管緩慢稀釋DMSO，棄上清液，用DMEM/F12 培養(yǎng)基清洗1次，然后用含有10 μmol/L的Y-27632 的GBO培養(yǎng)基重懸，溫箱過(guò)夜培養(yǎng)，第2 天將培養(yǎng)基換成無(wú)Y-27632 的GBO 培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)1～2周后組織可呈球形并用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.6 H-E染色法觀察GBO的形態(tài)

將培養(yǎng)的球形類器官轉(zhuǎn)移至吸水紙上，包裹好后經(jīng)4%多聚甲醛溶液中固定24 h，常規(guī)梯度乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋和切片。切片厚度為4μm，常規(guī)二甲苯脫蠟、透明、梯度乙醇下行復(fù)水，蘇木精染色、1%鹽酸乙醇分色，流水沖洗、返藍(lán)后，伊紅復(fù)染，梯度乙醇上行脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片，室溫陰干。對(duì)患者原發(fā)灶的親本腫瘤組織和類器官的H-E染色結(jié)果進(jìn)行鑒定。鑒定的標(biāo)準(zhǔn)為GBO組織保留與GBM（親本）組織一致的細(xì)胞類型和形態(tài)。

1.7 免疫組織化學(xué)染色法觀察GBO中GFAP、OLIG2、Ki67和ATRX的表達(dá)

包埋、切片、烤片、脫蠟、復(fù)水方法同上。置于高壓鍋內(nèi)沸水中進(jìn)行抗原修復(fù)3 min，3%H2O2阻斷非特異性，室溫封閉30 min，在GFAP抗體、OLIGO2抗體、ATRX抗體、Ki67抗體（抗體均為工作液，直接使用）37 ℃處理1 h，二抗酶標(biāo)羊抗兔/小鼠IgG聚合物（工作液，直接使用）37 ℃處理1 h，DAB顯色1 min，蘇木精復(fù)染30 s后脫水透明、中性樹膠封片，室溫陰干。對(duì)患者原發(fā)灶的親本腫瘤組織和類器官的免疫組化分子檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行鑒定。鑒定的標(biāo)準(zhǔn)為類器官保留與GBM組織表達(dá)相同的分子，包括GFAP、OLIG2、Ki67和ATRX，以驗(yàn)證培養(yǎng)出的GBO與GBM組織的一致性。

2 結(jié)果

2.1 剪小的GBM組織可培養(yǎng)形成球形的GBO

與國(guó)內(nèi)報(bào)道的用單細(xì)胞與基質(zhì)膠共培養(yǎng)的方法建立類器官不同，本實(shí)驗(yàn)采用的是將GBM組織剪成細(xì)小的組織碎片，在特殊的無(wú)血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)形成球形組織，該方法制備的類器官更加接近親本腫瘤組織。8 例GBM 組織中，003 號(hào)與007 號(hào)剪碎的GBM 組織碎片在1 周內(nèi)即可形成緊密的球形GBO，并能夠持續(xù)生長(zhǎng)（表1、圖1A）；當(dāng)初代GBO球體培養(yǎng)到2 周或球體直徑大于1 mm 時(shí)進(jìn)行傳代，剪小的腫瘤組織碎片可在1周內(nèi)再次成球，形成GBO（圖1B）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，GBM 類器官在體外可進(jìn)行傳代。此外，還發(fā)現(xiàn)GBO 凍存復(fù)蘇后仍能繼續(xù)生長(zhǎng)形成緊密的球體，由此建立GBO生物庫(kù)。

表1 8例GBM患者臨床資料和GBO制備的情況

2.2 GBO保留了親本腫瘤的組織細(xì)胞學(xué)特征

H-E 染色結(jié)果（圖2）顯示，003、007 號(hào)患者GBM組織和GBO 組織均表現(xiàn)出細(xì)胞的多形性和核分裂象，兩者在結(jié)構(gòu)上高度相似。此外，003號(hào)與007號(hào)患者的GBM 組織與培養(yǎng)至第2 代的GBO 組織免疫組化染色結(jié)果（圖3）顯示，兩組織中GFAP、OLIG2、Ki67 和ATRX 的表達(dá)程度也高度相似。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，2例GBO 均保留了與GBM 一致的組織學(xué)與細(xì)胞學(xué)特征。

3 討論

早期研究[22-23]報(bào)道，將GBM 組織解離成單細(xì)胞懸液，再和基質(zhì)膠混合在含有堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子和表皮生長(zhǎng)因子的培養(yǎng)基中，經(jīng)2個(gè)月后培養(yǎng)成最大直徑約3～4 mm的類器官，相比腫瘤細(xì)胞構(gòu)建的類器官，更好地保留了細(xì)胞的異質(zhì)性，再現(xiàn)了體內(nèi)腫瘤的低氧梯度和腫瘤干細(xì)胞的異質(zhì)性，但是此方法也具有一些不足之處：（1）可能不利于敏感細(xì)胞類型的存活并破壞天然細(xì)胞與細(xì)胞之間的相互作用；（2）在外源性生長(zhǎng)因子、小分子或血清存在的情況下培養(yǎng)，會(huì)有克隆選擇和無(wú)法保留的原始腫瘤細(xì)胞的類型，這些成分的添加可能與正在測(cè)試的藥物相互作用，使藥物治療后結(jié)果的解釋也變得復(fù)雜了；（3）培養(yǎng)周期長(zhǎng)且通量小，不能完整概括母體腫瘤的特征，培養(yǎng)成功率尚不明確。還有其他類器官模型，如使用膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生物打印和芯片上的細(xì)胞外基質(zhì)來(lái)實(shí)現(xiàn)高通量藥物測(cè)試等，但這些類器官概括腫瘤的細(xì)胞異質(zhì)性和組織的能力尚不確定[24]。本研究采用的是無(wú)血清培養(yǎng)基，這種方法沒有將腫瘤標(biāo)本解離消化，而是將標(biāo)本剪成0.5～1 mm左右的碎片，較好地保留了細(xì)胞之間的相互作用及腫瘤異質(zhì)性，培養(yǎng)出的類器官更接近親本組織。類器官的鑒定主要依靠與原組織進(jìn)行H-E 染色和免疫組化染色相關(guān)分子表達(dá)進(jìn)行對(duì)比，有條件的還會(huì)進(jìn)行基因組測(cè)序，在基因水平上進(jìn)行對(duì)比[25]。本研究成功構(gòu)建了GBO并使用H-E 染色和免疫組化染色法進(jìn)行了鑒定。培養(yǎng)出的GBO 表現(xiàn)出與親本腫瘤組織類似的組織細(xì)胞特征，GFAP、Ki67、OLIG2和ATRX的表達(dá)情況也相似。因此，初步認(rèn)為本次構(gòu)建的GBO 在組織和細(xì)胞層面可以代表原GBM組織。

在國(guó)內(nèi)鮮有成功培養(yǎng)腦腫瘤類器官的情況下，本研究參考國(guó)外已發(fā)表的研究成果[21]，共收集8 例GBM，其中2 例成功培養(yǎng)出與親本腫瘤在組織和細(xì)胞形態(tài)上相似的GBO，在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中總結(jié)的經(jīng)驗(yàn)和注意事項(xiàng)如下：（1）嚴(yán)格限制從組織切除到處理的時(shí)間，制備培養(yǎng)類器官的腫瘤樣本應(yīng)確保新鮮，腫瘤組織離體時(shí)間太長(zhǎng)會(huì)影響其組織活性，001號(hào)組織就是因?yàn)殡x體時(shí)間太久、活性降低而制備失?。唬?）腫瘤組織取材方法很關(guān)鍵，需要與外科醫(yī)生密切協(xié)調(diào)，在不進(jìn)行燒灼的情況下整體切除腫瘤組織，并與病理學(xué)家快速確認(rèn)診斷，盡可能去除非腫瘤組織或壞死組織，004 號(hào)與006 號(hào)的類器官均因切取的腫瘤組織中有壞死組織無(wú)法存活而致培養(yǎng)失??；（3）腫瘤組織質(zhì)量極大地影響類器官的形成和保真度，低腫瘤細(xì)胞密度可以影響類器官衍生效率，鏡下觀察002號(hào)培養(yǎng)出的類器官發(fā)現(xiàn)球體不夠密實(shí)，為低質(zhì)量的GBO，后續(xù)無(wú)法繼續(xù)長(zhǎng)大存活；（4）腫瘤本身的特性及取材過(guò)少也會(huì)導(dǎo)致類器官培養(yǎng)不成功，如005 號(hào)與008號(hào)。總之，新鮮、細(xì)胞密集的GBM組織比重度燒灼、經(jīng)抽吸或高度壞死和細(xì)胞稀疏的GBM 組織更易培養(yǎng)成功。

GBO培養(yǎng)成功到其應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ瓦€有許多問(wèn)題需要解決，如GBO中可能存在一些非腫瘤細(xì)胞，如何精確地評(píng)估類器官中的腫瘤細(xì)胞數(shù)是后續(xù)研究中需要解決的問(wèn)題。另外，當(dāng)GBO 生長(zhǎng)到直徑大于1 mm時(shí)，球體中心由于缺氧及無(wú)法獲取足夠的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)可能會(huì)出現(xiàn)壞死，所以鑒定時(shí)GBO直徑基本在1 mm左右，經(jīng)過(guò)脫水包埋后會(huì)萎縮，導(dǎo)致包埋制片難度加大，這為鑒定帶來(lái)了一定難度。因此，本課題組今后將從取材、剪裁大小、培養(yǎng)液成分、包埋、切片等方面進(jìn)一步完善GBO 的培養(yǎng)和標(biāo)本制備方法，使其適于大規(guī)模培養(yǎng)和廣泛鑒定，為類器官應(yīng)用于GBM研究打下更堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。