韓建濤，謝興旺（武漢市第三醫(yī)院首義院區(qū) 肝膽胰外科，湖北 武漢 430060）

肝癌是全球第五大常見癌癥和第三大癌癥相關(guān)死亡原因[1]。盡管近年來(lái)在診斷和治療方面取得了較大的進(jìn)展，但肝癌患者的長(zhǎng)期預(yù)后依然很差，且晚期肝癌患者的5年生存率小于5%。肝內(nèi)復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是肝癌治療的主要困難和挑戰(zhàn)，也是導(dǎo)致肝癌患者預(yù)后不佳的關(guān)鍵原因[2]。然而，肝癌復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制尚未完全闡明。一些研究[3-4]表明，多種微小核糖核酸（microRNA，miRNA）在包括肝癌在內(nèi)的腫瘤中異常表達(dá)，其在轉(zhuǎn)錄后或翻譯水平負(fù)調(diào)控基因表達(dá)，進(jìn)而參與調(diào)控細(xì)胞增殖、遷移等細(xì)胞惡性生物學(xué)行為。miR-1243 是研究較少的一種miRNA，已被證實(shí)在甲狀腺乳頭狀癌[5]、胰腺癌[6]、膠質(zhì)瘤[7]中低表達(dá)，目前并無(wú)miR-1243在肝癌中的研究。核不均一核糖核蛋白A2/B1（heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A2/B1，hnRNPA2B1）屬于hnRNPs 家族，是一種重要的RNA 結(jié)合蛋白，參與調(diào)節(jié)前體RNA 的選擇性剪接、RNA 核轉(zhuǎn)運(yùn)、翻譯等過程。hnRNPA2B1 在乳腺癌[8]、胰腺癌[9]、肝癌[10]等多種腫瘤中呈高表達(dá)，抑制hnRNPA2B1 表達(dá)可抑制腫瘤細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為。本研究將探討miR-1243 是否靶向hnRNPA2B1調(diào)控肝癌HepG2 細(xì)胞的增殖和遷移，為尋找肝癌診斷和治療的靶點(diǎn)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

RPMI 1640 培養(yǎng)基、DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清和青、鏈霉素均購(gòu)自武漢尚恩生物技術(shù)有限公司。miR-1243 模擬物（miR-1243 mimic）及其陰性對(duì)照miR-NC、miR-1243 抑制物（anti-miR-1243）及其陰性對(duì)照anti-miR-NC、hnRNPA2B1過表達(dá)重組載體質(zhì)粒（pc-hnRNPA2B1）及其空載體質(zhì)粒（pcDNA3.1）均購(gòu)自廣州銳博生物公司，LipofectamineTM2000購(gòu)自美國(guó)Invitrogen 公司。TRIzol 試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green Super Mix均購(gòu)自賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司，雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒、CCK-8試劑盒、RIPA 裂解液均購(gòu)自翌圣生物科技（上海）股份有限公司，BCA試劑盒購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司，兔抗人hnRNPA2B1、cyclin D1、MMP-2 抗體及HRP偶聯(lián)的山羊抗兔二抗均購(gòu)自美國(guó)Abcam公司。

1.2 組織樣本收集與細(xì)胞培養(yǎng)

收集2019 年1 月至2021 年8 月在武漢市第三醫(yī)院首義院區(qū)手術(shù)切除的40例肝癌患者的肝癌組織及其癌旁組織，經(jīng)病理醫(yī)師診斷證實(shí)均為肝細(xì)胞癌。所有患者均未接受過化療、放療或靶向治療，并簽署了知情同意書。該研究方案得到本院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號(hào)：20171259）。

人正常肝QSG-7701細(xì)胞與肝癌HepG2、Hep3b、HuH-7細(xì)胞均由北納生物公司提供。QSG-7701細(xì)胞的基礎(chǔ)培養(yǎng)基為RPMI 1640，Hep3b、HuH-7、HepG2細(xì)胞的基礎(chǔ)培養(yǎng)基為DMEM，所有培養(yǎng)基均含10%胎牛血清和1%青鏈霉素。細(xì)胞置于在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 細(xì)胞分組與轉(zhuǎn)染

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2 細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，分為對(duì)照組（不轉(zhuǎn)染）、miR-NC 組（miR-NC 轉(zhuǎn)染細(xì)胞）、miR-1243 mimic 組（miR-1243 mimic 轉(zhuǎn)染 細(xì)胞）、miR-1243 mimic+pcDNA3.1 組（miR-1243 mimic和pcDNA3.1 共轉(zhuǎn)染細(xì)胞）、miR-1243 mimic+pc-hnRNPA2B1組（miR-1243 mimic和pc-hnRNPA2B1共轉(zhuǎn)染細(xì)胞）。轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格按照LipofectamineTM2000說(shuō)明書進(jìn)行，轉(zhuǎn)染24 h后收集各組HepG2細(xì)胞備用。

1.4 qPCR 法檢測(cè)肝癌組織和細(xì)胞中miR-1243 和hnRNPA2B1 mRNA的表達(dá)

用TRIzol提取各組肝癌組織、各種細(xì)胞和轉(zhuǎn)染后各組HepG2細(xì)胞中的總RNA。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書合成cDNA。采用SYBR Green試劑進(jìn)行qPCR實(shí)驗(yàn)。qPCR反應(yīng)條件：預(yù)變性95 ℃10 min，95 ℃10 s、58 ℃30 s、72 ℃30 s，共40個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。用2-ΔΔCT法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量，以U6 為內(nèi)參基因，分析miR-1243 表達(dá)水平；以GAPDH 為內(nèi)參基因，分析hnRNPA2B1 mRNA表達(dá)水平。所用引物序列：miR-1243 正向引物為 5'-TAGGAGTGAAATAAAG GTCCATCTC-3'，反向引物為5'-CCAAAGCAAAGTA ATAAATAGGCAG-3'；U6正向引物為5'-GCTTCG GCAGCACATATACTAAAAT-3'，反向引物為5'-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3'；hnRNPA2B1正向引物為5'-AGCGACTGA GTCCGCGATGGA-3'，反向引物為5'-GCAGGATCC CTCATTACCACACAGT-3'；GAPDH正向引物為5'-GAACGGGAAGCTCACTGG-3'，反向引物為5'-GCCTGCTTCACCACCTTCT-3'。

1.5 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證miR-1243 與hnRNPA2B1間的靶向關(guān)系

TargetScanHuman 7.1在線網(wǎng)站（http://www.targetscan.org/vert 71）預(yù)測(cè)miR-1243 與hnRNPA2B1存在結(jié)合位點(diǎn)，根據(jù)其結(jié)合位點(diǎn)序列構(gòu)建hnRNPA2B1的野生型（WT-hnRNPA2B1）和突變型（MUThnRNPA2B1）載體，然后分別與miR-1243 mimic 或miR-NC 共轉(zhuǎn)染至HepG2 細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48 h 后收集細(xì)胞，檢測(cè)其熒光素酶活性。

1.6 CCK-8法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后各組HepG2細(xì)胞的增殖能力

將轉(zhuǎn)染后各組HepG2 細(xì)胞密度調(diào)整為1×105個(gè)/mL，取100 μL 接種在96 孔板中，每組設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)至24、48 和72 h時(shí)，每孔加入10 μL CCK-8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，清除培養(yǎng)液，每孔加入150 μL DMSO試劑。在酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)各孔光密度（D）值，以D值表示細(xì)胞的增殖能力。

1.7 劃痕愈合實(shí)驗(yàn)檢測(cè)轉(zhuǎn)染后各組HepG2細(xì)胞的遷移能力

轉(zhuǎn)染后HepG2 細(xì)胞以2×105個(gè)細(xì)胞/孔接種在6 孔板上，待細(xì)胞生長(zhǎng)至匯合度約80%時(shí)，使用無(wú)菌吸頭進(jìn)行垂直水平劃線，用磷酸緩沖液清洗后，在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，然后在光學(xué)顯微鏡下觀察各組HepG2細(xì)胞的劃痕愈合情況并拍照。劃痕愈合率=（1-24 h劃痕寬度/0 h劃痕寬度）×100%。

1.8 WB 法檢測(cè)肝癌組織及細(xì)胞和轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞的hnRNPA2B1、cyclin D1、MMP-2蛋白表達(dá)水平

將肝癌組織及細(xì)胞和轉(zhuǎn)染后各組HepG2細(xì)胞用RIPA 裂解液裂解15 min，離心并收集上清液。蛋白質(zhì)濃度通過BCA 試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。接著將蛋白樣品與加樣緩沖液混合，煮沸10 min，用SDSPAGE 分離，轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，使用5%的脫脂牛奶封閉1 h，加入hnRNPA2B1、cyclin D1、MMP-2、GAPDH一抗（1∶1 000），4 ℃處理24 h，加入相應(yīng)的二抗（1∶8 000），室溫處理1 h，接著加入ECL試劑顯影，最后用BioRad VersaDoc 4000成像系統(tǒng)直接成像，并通過Quantity One軟件將條帶量化。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

以上主要實(shí)驗(yàn)均獨(dú)立重復(fù)3 次。采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，符合正態(tài)分布的計(jì)量數(shù)據(jù)以xˉ±s表示。兩組間數(shù)據(jù)比較采用t檢驗(yàn)，多組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析。以P<0.05或P<0.01表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肝癌組織和細(xì)胞中miR-1243 呈低表達(dá)而hnRNPA2B1呈高表達(dá)

qPCR 和WB 法檢測(cè)結(jié)果（圖1）顯示，與癌旁組織比較，肝癌組織中miR-1243 明顯呈低表達(dá)，hnRNPA2B1 mRNA 和其蛋白呈高表達(dá)（均P<0.05）；與正常人肝QSG-7701細(xì)胞比較，肝癌HepG2、Hep3b、HuH-7 細(xì)胞中miR-1243呈低表達(dá)、hnRNPA2B1 mRNA和其蛋白呈高表達(dá)（均P<0.05）。在HepG2細(xì)胞中miR-1243表達(dá)水平最低，hnRNPA2B1 mRNA和其蛋白表達(dá)水平最高，因此選擇HepG2 細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。

2.2 miR-1243與hnRNPA2B1間存在靶向關(guān)系且前者負(fù)調(diào)控后者的表達(dá)

TargetScanHuman7.1在線網(wǎng)站（http://www.targetscan.org/vert_71）預(yù)測(cè)結(jié)果（圖2A）顯示，miR-1243 與hnRNPA2B1 存在互補(bǔ)位點(diǎn)。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果（圖2B）顯示，與miR-NC+WT-hnRNPA2B1組比較，miR-1243 mimic+WThnRNPA2B1組相對(duì)熒光素酶活性顯著降低（P<0.05），而miR-NC+MUT-hnRNPA2B1 組、miR-1243 mimic+MUT-hnRNPA2B1 組相對(duì)熒光素酶活性基本不變（均P>0.05）。WB 法檢測(cè)結(jié)果（圖2C 和圖2D）顯示，與miR-NC組相比，miR-1243 mimic 組hnRNPA2B1 蛋白表達(dá)水平顯著下降（P<0.05）；與anti-miR-NC 組相比，anti-miR-1243 組hnRNPA2B1 蛋白表達(dá)水平顯著上升（P<0.05）。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，miR-1243 與hnRNPA2B1 間存在靶向關(guān)系，miR-1243 通過靶向hnRNPA2B1且負(fù)調(diào)控其表達(dá)。

2.3 miR-1243 通過負(fù)調(diào)控hnRNPA2B1 影響肝癌HepG2細(xì)胞的增殖

qPCR 和WB 法檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組或miR-NC 組比較，miR-1243 mimic 組HepG2 細(xì)胞中miR-1243 表達(dá)升高（圖3A，P<0.05），hnRNPA2B1 和cyclin D1 蛋白表達(dá)減少（圖3B、C，均P<0.05），說(shuō)明在轉(zhuǎn)染的HepG2 細(xì)胞中miR-1243 過表達(dá)成功，過表達(dá)miR-1243可抑制hnRNPA2B1、cyclin D1 表達(dá)。與miR-1243mimic組比較，miR-1243mimic+pc-hnRNPA2 B1組HepG2細(xì)胞中miR-1243表達(dá)下降，hnRNPA2B1和cyclinD1蛋白表達(dá)增加（P<0.05）；miR-1243 mimic+pcDNA3.1組HepG2細(xì)胞中miR-1243、hnRNPA2B1和cyclin D1蛋白均無(wú)明顯差異（P>0.05），說(shuō)明過同時(shí)過表達(dá)hnRNAPA2B1 和miR-1243 可逆轉(zhuǎn)過表達(dá)miR-1243 對(duì)HepG2 的抑制作用。CCK-8法檢測(cè)結(jié)果（圖3D）顯示，與對(duì)照組或miR-NC 組比較，miR-1243 mimic 組HepG2 細(xì)胞增殖能力下降（P<0.05），miR-1243 mimic+pcDNA3.1組HepG2細(xì)胞增殖能力無(wú)明顯差異（P>0.05）；與miR-1243 mimic+pcDNA3.1 組比較，miR-1243 mimic+pc-hnRNPA2B1組HepG2細(xì)胞明顯升高（P>0.05），說(shuō)明過表達(dá)hnRNPA2B1 可促進(jìn)HepG2 細(xì)胞的增殖。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，miR-1243通過負(fù)調(diào)控hnRNPA2B1表達(dá)而影響肝癌HepG2細(xì)胞增殖。

2.4 miR-1243 通過負(fù)調(diào)控hnRNPA2B1 表達(dá)影響肝癌HepG2細(xì)胞的遷移

劃痕愈合實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖4）顯示，與對(duì)照組或miR-NC組比較，miR-1243 mimic組HepG2細(xì)胞的劃痕愈合率和MMP-2蛋白表達(dá)均明顯降低（均P<0.05），表明miR-1243 抑制HepG2 細(xì)胞的遷移；與miR-1243 mimic組和miR-1243 mimic+pcDNA3.1組比較，miR-1243 mimic+pc-hnRNPA2B1 組HepG2 細(xì)胞的劃痕愈合率和MMP-2蛋白表達(dá)均明顯升高（均P<0.05），說(shuō)明同時(shí)過表達(dá)miR-1243 和hnRNPA2B1 可逆轉(zhuǎn)單純過表達(dá)miR-1243 對(duì)HepG2 細(xì)胞遷移的抑制作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，miR-1243通過靶向hnRNPA2B1調(diào)控肝癌HepG2細(xì)胞遷移。

3 討論

由于肝癌早期癥狀無(wú)特異性且進(jìn)展迅速，因而導(dǎo)致多數(shù)患者在確診時(shí)就已到中、晚期，藥物、放射等治療方式效果不佳[11]。有研究[12]顯示，miRNA可參與調(diào)控肝癌的發(fā)生發(fā)展進(jìn)程，能夠作為生物標(biāo)志物在肝癌的診斷和預(yù)后中起作用。

QIAN 等[13]研究發(fā)現(xiàn)，miR-1243在舌鱗癌細(xì)胞中表達(dá)降低，其過表達(dá)能挽救circ_0043265對(duì)SCC25和Cal27 細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的抑制作用。沉默circ_0002570 表達(dá)可通過靶向miR-1243 抑制高糖誘導(dǎo)的人視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移和血管生成能力[14]。在PTC中，miR-1243 的低表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM 分期顯著相關(guān)，而且miR-1243 過表達(dá)可抑制其癌細(xì)胞的增殖和遷移能力[15]。本研究結(jié)果顯示，miR-1243在肝癌組織和其細(xì)胞Hep3b、HuH-7、HepG2中的表達(dá)水平顯著低于其癌旁組織和人正常肝QSG-7701細(xì)胞（均P<0.05），說(shuō)明miR-1243可能作為分子標(biāo)志物參與肝癌的發(fā)生發(fā)展。本研究通過轉(zhuǎn)染miR-1243 mimic 發(fā)現(xiàn)，miR-1243 表達(dá)明顯升高，HepG2細(xì)胞增殖能力和劃痕愈合率明顯降低（均P<0.05），提示miR-1243對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞的增殖和遷移能力有明顯的抑制作用。

Cyclin D1、MMP-2 分別是與細(xì)胞增殖和遷移相關(guān)的蛋白，可作為標(biāo)志物評(píng)估細(xì)胞的增殖、遷移水平。Cyclin D1可調(diào)節(jié)DNA復(fù)制過程，MMP-2屬于基質(zhì)金屬蛋白酶家族，兩者下調(diào)表達(dá)可使細(xì)胞增殖、遷移能力降低，進(jìn)而減緩肝癌的發(fā)展進(jìn)程[16]。本研究結(jié)果顯示，miR-1243 過表達(dá)后cyclin D1、MMP-2 蛋白表達(dá)顯著下降（P<0.05），進(jìn)一步說(shuō)明miR-1243 通過抑制cyclin D1、MMP-2 蛋白表達(dá)抑制肝癌HepG2 細(xì)胞的增殖和遷移。

本研究的實(shí)驗(yàn)雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證實(shí)miR-1243 可靶向hnRNPA2B1 并抑制其表達(dá)。故本研究推測(cè)miR-1243 通過調(diào)控hnRNPA2B1 表達(dá)抑制肝癌細(xì)胞的增殖和遷移。hnRNPA2B1在結(jié)腸癌中表達(dá)上調(diào)，并通過調(diào)控MAPK 途徑促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖，調(diào)節(jié)細(xì)胞周期和凋亡[17]。hnRNPA2B1 是頭頸癌中的致癌基因，可促進(jìn)頭頸癌細(xì)胞的EMT 進(jìn)程[18]。敲減hnRNPA2B1 通過下調(diào)Lin28B 表達(dá)抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖、遷移能力并促進(jìn)細(xì)胞凋亡[19]。而在肝癌中，敲減hnRNPA2B1 表達(dá)可激活PI3K/AKT 信號(hào)通路進(jìn)而抑制細(xì)胞增殖[20]。本研究結(jié)果顯示，肝癌組織和細(xì)胞中hnRNPA2B1 mRNA 和蛋白表達(dá)水平明顯升高，這與吳桐等[20]的研究結(jié)果一致，提示hnRNPA2B1 的表達(dá)失調(diào)與肝癌進(jìn)展有關(guān)。此外，雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)和WB 法結(jié)果顯示，miR-1243 靶向且負(fù)調(diào)控hnRNPA2B1蛋白表達(dá)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，在miR-1243過表達(dá)的基礎(chǔ)上繼續(xù)過表達(dá)hnRNPA2B1，HepG2細(xì)胞增殖、遷移能力及cyclin D1、MMP-2 蛋白表達(dá)水平均顯著升高（均P<0.05），提示hnRNPA2B1 過表達(dá)可逆轉(zhuǎn)miR-1243 對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞增殖、遷移的影響，其與抑制cyclin D1、MMP-2蛋白表達(dá)有關(guān)。

綜上所述，本研究首次證實(shí)了miR-1243 在肝癌細(xì)胞增殖和遷移中的作用，miR-1243 在肝癌組織和細(xì)胞中低表達(dá)，miR-1243 過表達(dá)對(duì)HepG2 細(xì)胞的增殖、遷移有抑制作用，其機(jī)制與靶向抑制hnRNPA2B1表達(dá)有關(guān)，為肝癌的靶向治療提供了新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。