尹美娟，劉真一

(河北中醫(yī)學院，河北 石家莊 050091)

枸杞子為茄科植物寧夏枸杞LyciumbarbarumL.的干燥成熟果實，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》。具有滋補肝腎，益精明目的功效，可堅筋骨，延緩衰老，其藥用價值備受歷代醫(yī)家的推崇。同時現(xiàn)代藥理學研究證明：枸杞有免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、抗衰老、抗腫瘤、抗疲勞、降血脂、降血糖、降血壓、補腎、保肝、明目、養(yǎng)顏、健腦、排毒、保護生殖系統(tǒng)、抗輻射損傷等16項功能[1]。

枸杞子是我國傳統(tǒng)中藥材，也是國家衛(wèi)生部規(guī)定的藥食同源的物品。由于市場需求及出口總量的不斷擴大，其種植正在逐年遞增[2-3]。近年來關于枸杞子的鑒定及化學成分的研究更為醫(yī)家和國內(nèi)外學者所矚目。市場上流通多為道地產(chǎn)區(qū)寧夏的枸杞子，除寧夏外也被廣泛種植于青海、甘肅、河北等中國北方省份。多種栽培品形態(tài)相似，因生長環(huán)境不同在化學成分和藥理作用等方面出現(xiàn)些許差異。不同產(chǎn)地的枸杞子之所以具有藥理活性差異與其成分含量有著一定聯(lián)系，如： 原兒茶醛有廣譜抗菌抗炎、抗氧化清除自由基等作用[4]; 兒茶素、表兒茶素具有清除自由基、抗癌、抗炎、抗突變、延緩衰老、降低膽固醇等作用[5]; 咖啡酸有抗菌抗病毒、凝血、降血脂、中樞興奮等作用[6]。所以，酚酸類成分成為枸杞子生物活性的物質(zhì)基礎之一。

本研究建立HPLC法同時測定寧夏、青海、甘肅、河北四種不同產(chǎn)區(qū)的枸杞子中東莨菪內(nèi)酯、表兒茶素、原兒茶酸、兒茶素、咖啡酸、蘆丁的含量，并對該方法進行方法學考察，為枸杞子藥材質(zhì)量提供一種高效、方便、簡潔的檢測方法。

1 儀器與材料

1.1 試驗設備器材

高效液相色譜儀(配置泵LC-20A型，DGU-20A5R真空脫氣機，LC-20AT溶液傳輸單元，CTO-20A柱溫箱，SPD-M20A二級管陣列檢測器和色譜工作站)，日本島津公司；Bp211-D型電子天平(十萬分之一)，德國Sartorous公司；KQ-250DE型數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 試驗材料

寧夏產(chǎn)枸杞和青海產(chǎn)枸杞都源于安國市祁溴中藥飲片有限公司；甘肅瓜州產(chǎn)枸杞源于寧夏寧馨兒生物科技有限公司；河北產(chǎn)枸杞源于承德中澤源農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司。蘆丁、原兒茶酸和兒茶素購于源葉生物有限公司；咖啡酸和東莨菪內(nèi)酯購于中國食品藥品檢定研究院；表兒茶素購于中國藥品生物制品檢定所；甲醇(分析純)購于天津市永太化學試劑有限公司；乙腈購于北京科寧興業(yè)有限公司；冰醋酸購于天津市科密歐化學試劑有限公司；水為超純水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱為Diamonsil C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)柱，流動相A為乙腈-水-醋酸(5∶94.5∶0.5)，流動相B為乙腈-水-醋酸(72∶27.5∶0.5)，梯度洗脫(0～18 min，100%～90%A；18～35 min，90%～70%A；35～45 min，70%～50%A；)；流速1 mL/min，進樣量10 μL，柱溫30 ℃，檢測波長為280 nm，對照品及樣品色譜圖見圖1。

圖1 混合對照品(A)與樣品(B)HPLC色譜圖

2.2 對照品溶液的制備

分別精密稱取原兒茶酸1.72 mg，兒茶素1.95 mg，咖啡酸1.08 mg，東莨菪內(nèi)酯0.68 mg，表兒茶素3.36 mg，置于10 mL量瓶中，加50%甲醇溶解，稀釋至刻度，搖勻，制成相應的貯備液。精密稱取蘆丁1.98 mg，置于25 mL量瓶中，加50%甲醇溶解，稀釋至刻度，搖勻，制成相應的貯備液。然后，精密吸取各貯備液1 mL，置于10 mL量瓶中，既得混合對照品溶液(每1 mL溶液中分別含有原兒茶酸0.0172 mg，兒茶素0.0195 mg，咖啡酸0.0108 mg，表兒茶素0.0336 mg，東莨菪內(nèi)酯0.0068 mg，蘆丁0.0079 mg)。

2.3 供試品溶液的制備

精密稱取干燥的寧夏枸杞、青海枸杞、甘肅枸杞和河北枸杞10.000 g，用50%甲醇超聲提取15 min，料液比為(1∶20)。提取完成后，提取液過濾，并用少量的甲醇多次洗滌濾渣，合并濾液濃縮提取液，并定容于10 mL量瓶中備用。使用時，從10 mL的量瓶中精密吸取濃縮的提取液1 mL于10 mL的量瓶中，并用50%的甲醇定容，用0.45 μm的有機濾膜過濾，即得供試品溶液。

2.4 線性關系考察

分別吸取“2.2”項下的混合對照品溶液，依照“2.1”項下的方法分別取5、10、15、20、25、30、40、45 μL注入色譜儀，以進樣量(μg)為自變量(X)，色譜峰面積為因變量(Y)，繪制標準曲線，建立回歸方程。線性考察結果見表 1所示。

表1 各化學成分線性關系

2.5 精密度試驗

精密吸取混合對照品溶液10 μL，依照“2.1”項下的方法進行實驗，連續(xù)重復進樣測定7次，計算峰面積RSD。結果原兒茶酸、兒茶素、表兒茶素、咖啡酸、東莨菪內(nèi)酯、蘆丁的RSD分別為0.1788%、0.2698%、0.3176%、0.2268%、1.7916%、0.1582%，表明儀器精密度良好。

2.6 重現(xiàn)性試驗

精密稱取同一枸杞樣品(寧夏)，按“2.3”項下的方法平行制備6 份供試品溶液，并按“2.1”項下色譜條件進行測定。計算東莨菪內(nèi)酯、表兒茶素、原兒茶酸、兒茶素、咖啡酸和蘆丁的平均含量分別為0.2934、0.2715 、0.2369、0.1472、0.0597 、0.2649 mg/g，RSD 分別為1.9%、1.4%、1.7%、1.8%、1.2%、1.2%。

2.7 穩(wěn)定性試驗

精密吸取“2.3”項下的供試品溶液10 μL，依照“2.1”項下的方法，分別于0、2、4、8、12、24 h進樣，計算峰面積RSD。結果原兒茶酸、兒茶素、表兒茶素、咖啡酸、東莨菪內(nèi)酯、蘆丁的RSD分別為0.95%、1.45%、2.00%、0.49%、0.39%、1.07%，表明樣品在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8 加樣回收率試驗

精密量取已測定含量的供試品(產(chǎn)地寧夏)9份，每份 5 mL。然后，3份加入“2.2”項下的混合對照品溶液2 mL，3份加入混合對照品溶液3 mL，3份加入混合對照品溶液 4 mL，在“2.1“項色譜條件下測定，計算加樣回收率RSD。結果見表2所示。

表2 加樣回收率結果

續(xù)表2

2.9 含量測定

精密吸取“2.3”項下的各供試品溶液10 μL，依照“2.1”項下的方法進行實驗，采用標準曲線法計算各產(chǎn)地供試品中東莨菪內(nèi)酯、表兒茶素、原兒茶酸、兒茶素、咖啡酸和蘆丁的含量，結果見表3所示。

表3 不同產(chǎn)地枸杞子的含量測定結果(n=3)

3 結 論

枸杞是藥食同源的特色型植物資源，具有延緩衰老、增強免疫力的功效，可強身健體，已被越來多的人所喜愛，枸杞藥材質(zhì)量也備受關注。枸杞在我國分布廣泛，應用歷史悠久，其中寧夏枸杞已經(jīng)在我國寧夏地區(qū)形成大規(guī)模種植[7]，其他地區(qū)如甘肅、青海、內(nèi)蒙古、新疆、河北產(chǎn)枸杞也在枸杞市場占有很大比例，對這些枸杞產(chǎn)區(qū)的枸杞藥材質(zhì)量進行進一步的研究有著深刻的現(xiàn)實意義。建立簡單快捷能夠反映藥材質(zhì)量的研究方法就成為枸杞藥材質(zhì)量研究的前提，本文采用的高效液相色譜法是中藥材質(zhì)量控制常用的方法，可以準確的測定藥材的活性成分是否達標，保證藥材質(zhì)量。已有研究發(fā)現(xiàn)，用HPLC 法測定枸杞的石油醚、乙酸乙酯、甲醇、正丁醇和水的不同溶劑提取物中總酚含量，并分別檢測每一溶劑提取物抗氧化能力，發(fā)現(xiàn)抗氧化能力主要與其總酚含量相關[8]?，F(xiàn)代藥理研究證明，枸杞子生理活性廣泛，其所表現(xiàn)出來的生物活性都與抗氧化活性相關[9]，如抗衰老[10]、保護心臟[11]、抗糖尿病[12]、保肝[13]、抗阿爾茨海默病[14]等。研究證實，由自由基引發(fā)的氧化作用是導致身體中組織器官損傷、病變的重要原因之一，人體內(nèi)自由基的過度氧化會引起慢性疾病及衰老效應，適量補充抗氧化的藥食兩用的藥材是清除人體自由基、增強抗氧化防御系統(tǒng)、延緩衰老、預防疾病的最佳保健方法[15]。綜上，酚酸性成分在枸杞生物活性中占有重要地位，本研究建立了枸杞中6種酚酸性活性成分的含量測定方法，該方法簡單便捷，回收率高，精密度、線性、穩(wěn)定性均符合要求，可作為枸杞藥材質(zhì)量標準含量測定的方法。由實驗測定結果分析可知： 所有樣品中6種酚酸性成分的平均含量大體上依次為東莨菪內(nèi)酯>表兒茶素>蘆丁>原兒茶酸>兒茶素>咖啡酸。實驗結果表明，東莨菪內(nèi)酯在6種酚酸類成分中含量最高，東莨菪內(nèi)酯是枸杞各部位如枸杞子、地骨皮、天精草中重要的有效成分之一[16-18]，東莨菪內(nèi)酯被認為是枸杞子中抑制前列腺癌細胞PC3 增殖效果最好的活性成分[19]，有研究表明，蘆丁、東莨菪內(nèi)酯、阿魏酸可能是枸杞子含有的具有體外抗氧化活性的化合物，其中，蘆丁是枸杞子清除DPPH自由基活性的代表物質(zhì)，東莨菪內(nèi)酯是枸杞子還原能力的有效物質(zhì)[20]。本研究結果也進一步證實，東莨菪內(nèi)酯和蘆丁在各產(chǎn)地的枸杞中含量均比較高，說明蘆丁和東莨菪內(nèi)酯作為枸杞中主要的抗氧化活性化合物可能與其具有較高的含量有關。另外，東莨菪內(nèi)酯在植物適應環(huán)境中具有非常重要的生態(tài)功能[21]，這可能是枸杞適于我國北方大面積區(qū)域生長的主要原因。不同產(chǎn)地樣品中6種酚酸性成分的含量大體上依次為寧夏樣品>青海樣品>甘肅樣品>河北樣品。實驗結果表明，寧夏枸杞作為道地藥材6種酚酸性成分含量均比較高，這也進一步證實四個產(chǎn)地的枸杞藥材質(zhì)量寧夏產(chǎn)枸杞最好。