杜艷麗，張兆寧，李思琪，趙強，張琦，杜吉到，2

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學，大慶 163319；2.黑龍江省鹽堿地改良工程技術(shù)研究中心）

干旱脅迫是自然界中常見的一種非生物脅迫，世界范圍內(nèi)干旱、半干旱區(qū)域面積約占陸地總面積的30%[1]。干旱脅迫對作物的影響通常表現(xiàn)為降低細胞內(nèi)水勢、葉片相對含水量、葉片水勢、氣孔導度和蒸騰速率等，引起光合能力的下降，嚴重影響作物的生長、品質(zhì)和產(chǎn)量[2-3]。隨著全球氣候的不斷變化，近年來世界范圍內(nèi)年內(nèi)和年際間降水分布不均勻?qū)е碌暮禐?zāi)發(fā)生頻率和程度逐漸加重[4]。我國土地面積的50%以上地區(qū)屬于干旱和半干旱區(qū)域，嚴重制約我國農(nóng)業(yè)的發(fā)展。大豆（Glycine max（Linn.）Merr）是重要的糧食作物之一，是人類食用油和植物蛋白的主要來源，也是畜牧業(yè)重要的飼料來源[5-6]。同時，大豆是一種需水量較大，而耐旱性較弱的作物[7]。大豆從萌發(fā)開始到生育時期結(jié)束的各個生長階段都有可能受到干旱脅迫的影響。黑龍江地區(qū)是我國大豆的主產(chǎn)區(qū)，年大豆種植面積和總產(chǎn)量占全國大豆種植總面積和總產(chǎn)量的40%以上。但是，由于黑龍江地區(qū)冬季氣候干燥、多大風、低降水的氣候特點，極易導致春旱的發(fā)生，嚴重影響當?shù)氐拇蠖股a(chǎn)。因此，篩選適宜黑龍江地區(qū)種植的、耐旱性強的大豆種質(zhì)資源，對于耐旱大豆品種的選育、提高當?shù)卮蠖巩a(chǎn)量和保障國家糧食安全具有重要的意義。

萌發(fā)期是大豆生長的起始時期，幼苗的生長狀態(tài)影響植株的后續(xù)生物量的積累和產(chǎn)量潛力的發(fā)揮。前人研究表明，大豆萌發(fā)期幼苗的耐旱性與大豆植株的出苗率、出苗整齊度和幼苗健壯程度等生長指標密切相關(guān)[5]。因此，萌發(fā)期是評價大豆品種耐旱性的關(guān)鍵時期之一。干旱脅迫能夠顯著的抑制作物種子內(nèi)蛋白質(zhì)、脂類和碳水化合物的代謝活動，從而影響種子的萌發(fā)率、下胚軸的伸長、胚根的生長等生理活動[8-9]。干旱脅迫對植物的影響又與植物種類、基因型、干旱發(fā)生時期和程度等因素相關(guān)[6]。因此，利用綜合指標來評價植株的抗旱性能夠更加全面反應(yīng)植株的耐旱性。在相關(guān)研究中，聚乙二醇（PEG）因其高滲透性、無毒、能夠調(diào)節(jié)水勢等特點而被廣泛的應(yīng)用于干旱脅迫模擬試驗中[10-13]，相關(guān)研究結(jié)果為大豆的耐旱研究奠定了試驗和理論基礎(chǔ)。例如，肖佳雷等[14]利用20%（M/V）PEG-6000 模擬干旱脅迫，以相對發(fā)芽率作為篩選指標，對黑龍江省主栽的78 份春大豆品種進行芽期抗旱能力鑒定，篩選得到5 份抗旱品種。譚春燕等[15]采用15%（M/V）PEG-6000 模擬干旱脅迫，并利用隸屬函數(shù)評價法對干旱脅迫下20 份春大豆的萌發(fā)相關(guān)指標進行分析，篩選等到5 份耐旱較強的大豆品種。李文濱等[16]分別在大豆芽期、苗期和花期利用19%（M/V）PEG-6000 進行干旱脅迫處理，測定了20 份大豆品種的發(fā)芽指標、生理、光合指標和農(nóng)藝性狀等指標，并利用抗旱系數(shù)、抗旱指數(shù)和隸屬值函數(shù)法綜合分析得到3 個耐旱大豆品種。張海平等[17]利用16% PEG-6000 溶液模擬干旱脅迫，測定了大豆品種的相對發(fā)芽勢、相對胚根長、相對發(fā)芽率、相對苗高、萌發(fā)耐旱指數(shù)和活力指數(shù)等6 項指標，利用平均隸屬函數(shù)法從568 份大豆種質(zhì)資源中篩選得到4 個抗旱大豆品種。

研究以38 份東北地區(qū)主栽的大豆品種為材料，使用15% PEG-6000 溶液模擬干旱脅迫，對不同大豆品種發(fā)芽率、發(fā)芽勢、種子萌發(fā)指數(shù)、平均發(fā)芽時間、平均發(fā)芽速度、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)等指標進行測定，并利用相關(guān)分析、主成分分析、隸屬函數(shù)分析和聚類分析等方法對不同大豆品種的抗旱性進行綜合性鑒定和評價，以建立抗旱大豆品種的篩選指標及評價方法，篩選適應(yīng)東北地區(qū)的抗旱大豆種質(zhì)資源，為東北地區(qū)大豆抗旱育種和種植提供參考。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

試驗所用38 個大豆品種均為經(jīng)審定的、東北地區(qū)的主栽品種，種子由黑龍江八一農(nóng)墾大學遺傳研究室提供。供試大豆品種包括：龍墾333、龍墾3002、龍墾306、黑河52 號、黑科69 號、龍墾330、龍墾356、龍墾310、龍墾316、黑河49 號、北豆19、黑科58 號、黑科57 號、九研17 號、黑科68 號、黑科60號、黑科88 號、龍墾3307、黑河53 號、九研2 號、龍墾3402、華疆2 號、金源73、昊疆2 號、昊疆4 號、合農(nóng)95、黑河38 號、黑河43 號、黑河45 號、黑河53號、華疆4 號、黑科60 號、圣豆43、賀豆1 號、克山1號、中黃901、龍達3 號、蒙豆46。

1.2 試驗設(shè)計

基于前人的研究和實驗室預實驗的結(jié)果，使用15%（W/V）PEG-6000 溶液模擬干旱條件對大豆種子進行處理。挑選籽粒飽滿、大小均一、無蟲斑、無病斑的大豆種子，使用2% NaClO 溶液消毒10 min，用蒸餾水洗滌2 次后，使用處理液（蒸餾水或15%（W/V）PEG-6000 溶液）清洗2 次。將消毒后的大豆種子均勻地擺放在鋪有兩張濾紙的培養(yǎng)皿中（直徑90 mm），每皿放置大豆種子20 粒，隨后在種子表面再覆蓋一層濾紙，并加入10 mL 處理液。將培養(yǎng)皿置于恒溫人工氣候箱中黑暗培養(yǎng)7 d，溫度設(shè)置為25±1 ℃。每天更換濾紙和處理液。每個處理進行3 次實驗重復。

1.3 測定項目和方法

當大豆種子胚根長度到達種子長度，胚芽長度達到種子長度的1/2 時，記為種子萌發(fā)第1 天。每天觀察并統(tǒng)計大豆種子的發(fā)芽數(shù)目，連續(xù)統(tǒng)計7 d，并每天更換濾紙。在種子萌發(fā)第7 天時，測量種子的胚根長，隨后將大豆種子的子葉和胚根分開，使用萬分之一天平分別稱量其鮮重；將樣品置于牛皮紙信封中，于105 ℃烘箱內(nèi)烘干20 min，隨后于85 ℃烘干至恒重，并測定其干重。

根據(jù)連續(xù)7 d 的統(tǒng)計數(shù)據(jù)分別計算大豆種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢、種子萌發(fā)指數(shù)、平均發(fā)芽時間、平均發(fā)芽速度、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)、相對含水量和根冠比。為了消除品種間種子活力差異帶來的影響，利用了鑒定指標的相對值進行評價，具體計算公式如下：

（3）種子萌發(fā)指數(shù)（SGC）=1.00×nd2+0.70×nd4+0.30×nd6，式中，nd2、nd4、nd6 分別指第2、4、6 天的種子發(fā)芽率）；

（7）活力指數(shù)（VI）=發(fā)芽指數(shù)×胚根鮮重；

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

1.4.1 隸屬函數(shù)值的計算

隸屬函數(shù)值μ（Xi）的計算公式如下：

μ（Xi）=，i=1，2，…，n，式中，Xi為第i個綜合指標，Xmin為第i 個綜合指標的最小值，Xmax為第i 個綜合指標的最大值。

1.4.2 各綜合指標權(quán)重和綜合評價值的計算

（1）綜合指標權(quán)重（wi）的計算公式如下：

（2）綜合評價值（D）的計算公式如下：（D=∑［μ（Xi）×wi］，i=1，2，…，n，式中，D 值為干旱脅迫下使用綜合指標計算所得的各品種的耐旱性綜合評價值。

1.4.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

使用Microsoft Excel 2016 對數(shù)據(jù)進行整理和分析，使用SPSS26.0 軟件進行主成分分析、聚類分析和相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 大豆萌發(fā)期耐旱性指標的差異

如表1 所示，與對照相比較，15% PEG-6000 處理降低了38 個大豆品種的總鮮重、胚根鮮重、胚根干重、子葉鮮重、相對含水量、根冠比、胚根長、發(fā)芽率、發(fā)芽勢、萌發(fā)指數(shù)、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)等12 項指標，而增加了38 個大豆品種的總干重、子葉干重、平均發(fā)芽時間和平均發(fā)芽速度。不同大豆品種中各測量指標的變化程度呈現(xiàn)明顯的基因型差異，其中活力指數(shù)、發(fā)芽勢和胚根長等指標在所有測量指標中變異系數(shù)最大，分別為0.431、0.331 和0.301。

表1 萌發(fā)期干旱脅迫下不同大豆品種耐旱指標的差異Table 1 Differences of drought tolerance indexes of soybean cultivars under drought stress during germination

2.2 主成分分析

對大豆品種的16 個耐旱性指標進行主成分分析，設(shè)置特征值大于1 為閾值，結(jié)果如表2 所示。主成分分析共得到4 個主成分，對應(yīng)的特征根分別為2.607、1.623、1.470、1.286，其貢獻率分別為42.49%、16.46%、13.57%和10.33%，累計貢獻率為82.85%。結(jié)果表明，這4 個主成分可以充分反映萌發(fā)期干旱脅迫下大豆品種16 個測量指標的變化趨勢。根據(jù)計算結(jié)果，將這4 個主成分分別定義為第1 主成分（CI1）、第2 主成分（CI2）、第3 主成分（CI3）和第4 主成分（CI4）。其中，第1 主成分的貢獻率最高，為干旱脅迫高度敏感主成分，而其中活力指數(shù)、發(fā)芽指數(shù)、萌發(fā)指數(shù)和發(fā)芽勢等指標的特征向量最高，分別達到0.367、0.347、0.33 和0.302。第2 主成分和第3 主成分的合計貢獻率達到30.03%，為干旱脅迫中度敏感主成分。在第2 主成分中，鮮重、根冠比和相對含水量等指標的特征向量最高，分別為0.366、0.358 和0.333。在第3 主成分中，總干重和胚根干重特征向量最高，分別為0.519 和0.471。第4 主成分為干旱脅迫低度敏感成分，其中子葉鮮重、總鮮重、子葉干重和總干重等指標的特征向量最高，分別為0.546、0.481、0.101 和0.349。

表2 萌發(fā)期干旱脅迫下大豆各綜合指標的系數(shù)及貢獻率Table 2 Coefficient and contribution rate of comprehensive indexes of soybean cultivars under drought stress during germination

2.3 不同大豆品種耐旱性的綜合評價

2.3.1 隸屬函數(shù)分析

根據(jù)隸屬函數(shù)公式計算得出萌發(fā)期干旱脅迫下不同大豆品種各綜合指標的隸屬函數(shù)值，結(jié)果如表3所示。結(jié)果表明，各品種的綜合指標的隸屬函數(shù)值具有顯著的差異，在綜合指標CI1中，黑科68 號的隸屬函數(shù)值μ（X1）最大（1.000），說明在CI1中黑科68號耐旱性最強；而金源73 的隸屬函數(shù)值μ（X1）最?。?.000），說明在CI1中金源73 耐旱性最差。在CI2中，龍墾356 的隸屬函數(shù)值μ（X2）最大（1.000），說明在CI2中龍墾356 耐旱性最強；而龍墾333 的隸屬函數(shù)值μ（X2）最?。?.000），說明CI2中龍墾333 耐旱性最差。在CI3中，九研17 號的隸屬函數(shù)值μ（X3）最大（1.000），說明在CI3中九研17 號耐旱性最強；而黑河53 號的隸屬函數(shù)值μ（X3）最?。?.000），說明CI3中黑河53 號耐旱性最差。在CI4中，黑科69 號的隸屬函數(shù)值μ（X4）最大（1.000），說明在CI4中黑科69號耐旱性最強；而黑河49 號的隸屬函數(shù)值μ（X4）最?。?.000），說明CI4中黑河49 號耐旱性最差。綜合指標權(quán)重計算結(jié)果表明，這4 個綜合指標的權(quán)重分別為0.513、0.199、0.164 和0.125。

表3 38 個大豆品種的綜合指標值、權(quán)重、μ（X）和D 值Table 3 Comprehensive indexes（CI），index weight，μ（X），and D value of 38 soybean varieties

2.3.2 綜合評價及聚類分析

根據(jù)綜合評價值公式計算得到大豆各品種萌發(fā)期耐旱性綜合指標值（D 值），并根據(jù)D 值對不同品種的耐旱性進行排序，結(jié)果如表3 所示。同時，利用組間聯(lián)接法對綜合指標進行聚類分析，在平方歐氏距離等于4 處，將38 份大豆材料劃分為五大類，結(jié)果如圖1 所示。由圖1 可知，第Ⅰ大類共包含2 個大豆品種，分別為黑科88 號和黑科68 號，數(shù)量占供試材料總數(shù)的5.26%，為強耐旱性品種；第Ⅱ大類包含6 個品種，分別為九研17 號、九研2 號、黑河53 號、黑河52 號、龍墾3402 和龍墾316，數(shù)量占供試材料總數(shù)的15.79%，為中等耐旱性品種；第Ⅲ大類共包含有黑科57 號、黑科69 號等12 個大豆品種，數(shù)量占供試材料總數(shù)的31.58%，為干旱耐性中間型品種；第Ⅳ大類包含龍墾3307、黑河43 號等16 個品種，數(shù)量占供試材料總數(shù)的42.11%，為干旱中度敏感品種；第Ⅴ大類包含華疆2 號和金源73 共2 個品種，數(shù)量占供試材料總數(shù)的5.26%，為干旱極敏感品種。

圖1 38 個大豆品種的抗旱性聚類圖Fig.1 Cluster map of drought tolerance of 38 soybean varieties

2.4 大豆萌發(fā)期耐旱性指標的相關(guān)性分析

對大豆萌發(fā)期耐旱性指標間的相關(guān)性進行分析（圖2）得知：發(fā)芽勢、萌發(fā)指數(shù)、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)、發(fā)芽率、總鮮重、胚根鮮重、相對含水量、胚根干重、根冠比和胚根長等指標均與D 值呈顯著正相關(guān)性（P<0.01）；子葉干重、平均發(fā)芽時間、平均發(fā)芽速度與D 值呈顯著負相關(guān)性（P<0.01）。以D 值作為因變量，各項測量指標作為自變量進行逐步回歸分析，建立萌發(fā)期大豆耐旱性評價的回歸方程：D’=-0.447+1.087X1+0.006X2-0.032X3+0.116X4+0.171X5+0.114X6+0.001X7，其中，D’：耐旱性綜合評價值、X1：胚根鮮重、X2：根冠比、X3：平均發(fā)芽速度、X4：子葉鮮重、X5：胚根長、X6：總干重、X7：發(fā)芽率，各指標的系數(shù)分別代表各指標對D 值的影響權(quán)重，回歸方程的決定系數(shù)為R2=0.945（P<0.001）。由于胚根鮮重、根冠比、平均發(fā)芽速度、胚根長、發(fā)芽率與D 值呈極顯著相關(guān)性，可將這5個指標可作為大豆萌發(fā)期耐旱能力評價的一級指標，子葉鮮重、總干重可作為大豆萌發(fā)期耐旱能力評價的二級指標。

圖2 萌發(fā)期各耐旱性指標間的相關(guān)系數(shù)聚類熱圖Fig.2 Cluster heatmap of correlation coefficients between drought-tolerance indexes at germination stage

3 討論

萌發(fā)期是植物生長的關(guān)鍵階段，對外界環(huán)境變化十分敏感[18-20]。大量的研究結(jié)果表明，大豆萌發(fā)期出苗率的高低直接影響植株后期的生長和產(chǎn)量的形成[21-22]。因此，在萌發(fā)期對大豆品種的抗旱性進行測定和評價是一種高效的、快速的、準確的抗旱大豆品種篩選方法。

水分是大豆種子萌發(fā)的必需條件之一。大豆種子吸收水分的多少影響貯存物質(zhì)的水合、酶解、代謝、DNA 損傷修復和細胞周期的進行[20]。研究表明，萌發(fā)期干旱能夠顯著的抑制大豆種子的萌發(fā)及幼苗的生長[18-22]。在研究中，使用15% PEG-6000 溶液模擬干旱脅迫能夠顯著的降低所有大豆種子的發(fā)芽勢、發(fā)芽率以及胚根長度，但是相關(guān)指標的降低程度存在顯著的基因型差異。植物的耐旱性往往是復雜的、受多基因控制的數(shù)量性狀，并且，不同植物的耐旱能力差異可能與其干旱脅迫響應(yīng)途徑的差異相關(guān)。大量的研究表明，使用單一性狀或生理指標對植物的耐旱性進行評價往往不能全面、精準反映品種間抗旱能力。因此，近年來，研究者們多采取綜合評價法來對不同植物的耐旱性進行評價。其中，利用主成分分析法和隸屬函數(shù)法對多個抗逆性指標進行綜合分析的評價方法，不僅考慮了不同指標在植物抗逆性中的權(quán)重，并且消除了植物品種（系）間固有的生理性狀差異，能夠?qū)γ總€材料的真實抗逆能力進行定量的評價，已被廣泛的應(yīng)用于玉米[23]、水稻[24]、大豆[17]、谷子[25]、胡麻[26]、苦蕎[27]等作物的耐旱品種篩選研究中。

在研究中，為了消除不同品種間種子活力、生理特性等固有差異所帶來的影響，使用性狀指標的相對值進行相關(guān)數(shù)據(jù)的分析，這種方法能夠更加真實地反映出品種間的耐旱性差異，這與荊瑞勇[24]、楊鳳軍[28]、張海波[29]等的評價方式相同。研究采用16 個與萌發(fā)相關(guān)的性狀指標作為大豆耐旱性鑒定指標，綜合利用主成分分析、隸屬函數(shù)分析、聚類分析和相關(guān)性分析等方法對這些鑒定指標進行綜合性評價。結(jié)果表明，主成分分析可將16 個鑒定指標簡化為4 個主成分；根據(jù)隸屬函數(shù)計算出綜合指標值（D 值）；經(jīng)聚類分析可將38 個大豆品種分為5 類：強耐旱型、中等耐旱型、中間型、干旱中度敏感型和干旱極敏感型，其中黑科88 號和黑科68 號為強耐旱材料，華疆2 號和金源73 為干旱極敏感材料。由于D 值是一個無量綱的純數(shù)[30]，研究結(jié)果使得各品種間的抗旱性差異具有可比性，能夠綜合的反應(yīng)出不同大豆品種的耐旱性差異。

在簡化種質(zhì)資源抗旱性篩選步驟時，選擇合理、有效的鑒定指標是關(guān)鍵。在棉花的抗旱性鑒定時，王俊娟等[31]將第7 d 的胚根長度作為篩選指標；在裸燕麥的抗旱性鑒定中，陳新等[32]將種子活力作為篩選指標；張海平等[17]在對大豆種子萌發(fā)期耐旱性鑒定時，將萌發(fā)耐旱指數(shù)作為篩選指標。研究基于逐步回歸分析建立了評價不同大豆品種對萌發(fā)期干旱耐受能力的回歸方程，并進一步根據(jù)各耐旱脅迫指數(shù)與耐旱綜合評價值（D）的相關(guān)分析得到大豆萌發(fā)期耐旱性鑒定評價的主要指標為：胚根鮮重、根冠比、平均發(fā)芽速度、胚根長、發(fā)芽率。研究應(yīng)用的耐旱性鑒定評價指標能夠更加合理、全面地對萌發(fā)期大豆的耐旱性進行鑒定。

4 結(jié)論

15% PEG-6000 溶液模擬的萌發(fā)期干旱脅迫處理對38 個大豆品種的生長指標均有影響。通過主成分分析、隸屬函數(shù)分析和聚類分析等方法，篩選出黑科88 號和黑科68 號為強耐旱材料，華疆2 號和金源73 為干旱極敏感材料，并選定胚根鮮重、根冠比、平均發(fā)芽速度、胚根長和發(fā)芽率等5 項指標作為對萌發(fā)期大豆品種耐旱性進行簡化鑒定評價的主要指標。