賈博為，金軍，莊齊，董偉峰，才曉溪，孫明哲，孫曉麗

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)農(nóng)學(xué)院/作物逆境分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室，大慶 163319）

植物不可移動(dòng)，且生活在不斷變化的環(huán)境中，往往這個(gè)環(huán)境不利于植物的生長(zhǎng)和發(fā)育。這些不利的環(huán)境條件包括生物脅迫，如病原感染和食草動(dòng)物攻擊，以及非生物脅迫，如干旱、熱、冷、營(yíng)養(yǎng)缺乏和土壤中過量的金屬離子。干旱、鹽和溫度脅迫是影響植物自然地理分布、限制農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和威脅糧食安全的主要環(huán)境因素。在非生物脅迫應(yīng)答中，轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在重建和維持離子平衡中起到重要作用，是反應(yīng)植物脅迫耐性能力高低的指標(biāo)之一。

陽離子質(zhì)子逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（CPA，cation proton antiporter）主要參與單價(jià)陽離子的交換和轉(zhuǎn)運(yùn)，除了Na+與H+的轉(zhuǎn)運(yùn)發(fā)生逆轉(zhuǎn)，還參與單價(jià)陽離子，如K+和Li+[1]等的轉(zhuǎn)運(yùn)。在進(jìn)化關(guān)系上，陽離子質(zhì)子逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白可分為CPA1 和CPA2 兩個(gè)超家族。其中，CPA1 超家族可分為兩類，包括與植物耐鹽性相關(guān)、特征明確的重要調(diào)控基因，鹽過度敏感1 家族（SOS1，salt overly sensitive 1）和鈉氫交換蛋白家族（NHX，Na+/H+exchanger）。現(xiàn)有研究表明豇豆、蘋果、馬齒莧、花生和菊芋NHX 基因可參與調(diào)節(jié)耐鹽性[2-6]。且鹽脅迫下，小麥根組織中NHX 的表達(dá)上調(diào)。而CPA2 由KEA（K+efflux antiporter）和CHX（cation/H+exchanger）兩個(gè)亞家族組成[7-8]。其中，CHX 亞家族成員最多，主要存在于高等植物中，參與維持pH 穩(wěn)態(tài)和離子平衡[9-10]。研究表明，AtCHX17 基因主要在花粉、根和葉片中表達(dá)，且受脫落酸、高鹽脅迫、酸性pH 和缺K+的誘導(dǎo)。AtCHX16/17/18/19 主要在擬南芥根、花及花粉中表達(dá)，對(duì)生殖生長(zhǎng)和種子發(fā)育起十分重要的作用[11-13]。野生大豆CHX19.3 基因可促進(jìn)過表達(dá)擬南芥對(duì)鉀離子的吸收，并正向調(diào)節(jié)過表達(dá)擬南芥對(duì)高鹽和碳酸鹽脅迫的耐性，GsCHX19.3 過表達(dá)可增加正常條件下鉀離子的吸收，減少鈉離子的吸收或增加鈉離子的外排，從而緩解鹽堿脅迫引起的離子中毒[14-15]。鹽芥CHX18 在玉米中的過量表達(dá)可顯著提高玉米的耐鹽性[16]。迄今為止發(fā)現(xiàn)有報(bào)道的CHX都可調(diào)控鉀離子轉(zhuǎn)運(yùn)，并且可以在不同pH 發(fā)揮功能，這表明它們?cè)谡{(diào)控堿性陽離子和pH 平衡中扮演著不同于其他CPA 超家族成員的作用[13]。

目前，CHX 基因家族已在多個(gè)植物中有報(bào)道，如擬南芥、葡萄、大豆、水稻和藻類等[10，17-19]。但是，關(guān)于玉米CHX 基因家族的研究尚未見報(bào)道。因此，研究從玉米CHX 基因入手，通過構(gòu)建隱馬爾科夫模型，對(duì)玉米CHX 基因家族進(jìn)行了全基因組鑒定，篩選獲得了16 個(gè)ZmCHXs 基因，并全面分析了其基因家族的理化性質(zhì)、基因結(jié)構(gòu)、基因序列、染色體定位、進(jìn)化關(guān)系、保守結(jié)構(gòu)域、組織表達(dá)特性和非生物脅迫表達(dá)模式，為后續(xù)更深一步解析ZmCHXs 基因耐逆功能提供理論依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 玉米CHX 基因家族成員的篩選與分析

基于已發(fā)表的擬南芥CPA 家族基因蛋白序列[17]通過HMMER 分析，構(gòu)建隱馬爾科夫模型，從Phytozome（https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html）[20]數(shù)據(jù)庫(kù)獲得玉米全基因組和蛋白組序列信息。進(jìn)一步利用SMART（http://smart.embl-heidelberg.de/）[21]和Pfam（http://pfam.xfam.org）[22]軟件篩選候選蛋白，最終獲得含有完整Na+/H+exchanger 結(jié)構(gòu)域（PFAM 號(hào)：PF00999）的ZmCHX 家族基因。采用ExPASy（https://web.expasy.org）預(yù)測(cè)玉米CHX 蛋白的基本理化性質(zhì)。利用CBS（http://www.cbs.dtu.dk）預(yù)測(cè)蛋白亞細(xì)胞定位。SMART 軟件預(yù)測(cè)跨膜結(jié)構(gòu)域。MEME（http://meme-suite.org/tools/meme）[23]分析玉米CHX 家族基因保守Motif。

1.2 玉米CHX 基因家族系統(tǒng)進(jìn)化分析

采用MEGA-X 軟件中的鄰接法（NJ，Neighbor-Joining）構(gòu)建ZmCHX、OsCHX[19]和AtCHX[17]家族系統(tǒng)進(jìn)化樹。其中，自展值（Bootstrap）設(shè)置為1000，數(shù)據(jù)處理選擇Partial deletion，并設(shè)置為95%[24]。

1.3 玉米CHX 基因家族染色體定位及同源性分析

應(yīng)用玉米基因組數(shù)據(jù)庫(kù)Phytozome 獲取基因所在染色體位置信息?；贠rtho Venn2（https://orthovenn2.bioinfotoolkits.net/home）[25]分析玉米、水稻以及擬南芥CHX 基因同源性。最終利用TBtools[26]軟件繪制基因染色體分布和同源關(guān)系圖。

1.4 玉米CHX 基因家族組織表達(dá)模式分析

從ePlant（http://bar.utoronto.ca/eplant/）[27]數(shù) 據(jù) 庫(kù)中下載玉米CHX 家族基因組織表達(dá)數(shù)據(jù)，玉米在鹽脅迫（150 mM NaCl）和冷脅迫（5 ℃）處理下的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)來自黑龍江省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)栽培技術(shù)與作物種質(zhì)改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（NCBI 登錄號(hào)：SRP307694）[28]。進(jìn)一步利用TBtools 軟件繪制玉米CHX 基因家族的表達(dá)熱圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 玉米CHX 基因全基因組鑒定

利用已發(fā)表的擬南芥CPA 超家族蛋白序列信息[1]構(gòu)建隱馬爾科夫模型，以此來搜索玉米數(shù)據(jù)庫(kù)，整合SMART、Pfam 和基于NCBI 的CDD 進(jìn)行結(jié)構(gòu)域分析，最終獲得了31 個(gè)含有完整Na+/H+exchanger 結(jié)構(gòu)域（Pfam 號(hào)：PF00999）的玉米CPA 基因。通過與擬南芥CPA 超家族構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹發(fā)現(xiàn)，其中16 個(gè)基因與CHX 家族聚合在一起，8 個(gè)基因分配到了KEA家族，剩下的7 個(gè)基因?qū)儆贜HX 家族（圖1）。

圖1 玉米和擬南芥CPA 家族進(jìn)化關(guān)系分析Fig.1 Evolutionary relationship analysis of CPA family from maize and Arabidopsis thaliana

進(jìn)一步對(duì)玉米ZmCHXs 基因家族進(jìn)行理化性質(zhì)分析，結(jié)果如表1 所示，16 個(gè)玉米CHX 基因編碼氨基酸序列從743~1141 不等，蛋白序列N 端都包含有一個(gè)Na+/H+exchanger 結(jié)構(gòu)域，并且含有8~12 個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域（表1）。等電點(diǎn)范圍從5.95~9.03，其中6 個(gè)ZmCHXs 蛋白的等電點(diǎn)均大于7，偏堿性。然而，余下的10 個(gè)ZmCHXs 蛋白的等電點(diǎn)均小于7，偏酸性。此外，它們的親疏水性均值在0.117~0.5 之間，表明ZmCHXs 基因都編碼疏水蛋白。進(jìn)一步預(yù)測(cè)蛋白亞細(xì)胞定位，結(jié)果表明16 個(gè)ZmCHXs 均定位在質(zhì)膜或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上，這是轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白發(fā)揮功能的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。

表1 玉米CHX 家族基因的基本信息Table 1 Basic information of CHX genes from maize

2.2 玉米CHX 基因染色體定位及同源基因分析

ZmCHXs 基因染色體定位分析結(jié)果表明16 個(gè)ZmCHXs 基因分布在8 條不同的染色體上。其中8 號(hào)染色體上的基因數(shù)目高達(dá)4 個(gè)，4 號(hào)染色體上有3個(gè)，而其它染色體上只含有1~2 個(gè)（圖2）。進(jìn)一步基于OrthoVenn2 對(duì)玉米、水稻及擬南芥CHX 基因家族同源性分析（圖2），結(jié)果表明玉米和水稻CHX 家族有16 對(duì)直系同源基因，而玉米和擬南芥CHX 家族僅有5 對(duì)直系同源基因，水稻和擬南芥直系同源基因只有4 對(duì)。這是由于玉米和水稻都是單子葉禾本科植物，具有較近的親緣關(guān)系，基因功能也可能相似，而與雙子葉植物擬南芥親緣關(guān)系遠(yuǎn)，導(dǎo)致同源基因少。此外，圖2 結(jié)果顯示，玉米和水稻均具有2 對(duì)旁系同源基因，雙子葉植物擬南芥中發(fā)現(xiàn)了54 對(duì)旁系同源基因，這些基因的擴(kuò)張可能來自于基因復(fù)制。

續(xù)表1 玉米和擬南芥CPA 家族進(jìn)化關(guān)系分析Continued table 1 Basic information of CHX genes from maize

圖2 玉米、水稻和擬南芥CHXs 基因同源關(guān)系分析Fig.2 Homology analysis of CHXs in maize，Oryza sativa and A.thaliana

2.3 玉米CHX 基因家族系統(tǒng)發(fā)育分析

為進(jìn)一步了解ZmCHXs 進(jìn)化關(guān)系，利用玉米（16個(gè)）、擬南芥（28 個(gè)）、水稻（17 個(gè)）共61 個(gè)CHX 蛋白序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。結(jié)果如圖3 所示，與擬南芥CHX 家族分類一樣[17]，61 個(gè)CHX 成員可分為5 組（GroupⅠ~Ⅴ），而研究發(fā)現(xiàn)玉米與水稻CHX 只分成了3 組（GroupⅠ、Ⅲ和Ⅳ），缺少GroupⅡ和GroupⅤ成員[19]。其中GroupⅢ包含的成員最少，只有3 個(gè)基因，而GroupⅣ包含的成員最多，有8 個(gè)基因。這與Sze 等和才曉溪等[17-18]研究結(jié)果一致，GroupⅡ和GroupⅤ可能是擬南芥和大豆等雙子葉植物特有的基因，擬南芥的GroupⅡ和GroupⅤ中缺乏玉米和水稻同源基因（圖3），造成了單子葉植物玉米和水稻缺少這兩個(gè)亞家族的基因。

圖3 玉米、水稻和擬南芥CHXs 進(jìn)化關(guān)系分析Fig.3 Evolutionary relationship analysis of CHXs from maize（Zm），O.sativa（Os）and A.thaliana（At）

2.4 玉米CHX 基因家族的序列和結(jié)構(gòu)域分析

為深入解析玉米CHX 功能，對(duì)玉米其基因結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)除了ZmCHX13.2 和ZmCHX28不含有內(nèi)含子之外，其他14 個(gè)ZmCHX 基因都含有1~6 個(gè)內(nèi)含子不等（圖4）。其中，GroupⅢ的成員最少，并且與其他兩組相比UTR（Untranslated Region）結(jié)構(gòu)較短。GroupⅠ和GroupⅢ基因成員中含有非編碼區(qū)均在N 端，而GroupⅣ的非編碼區(qū)在N 端或C端?？偟膩碚f，非編碼區(qū)占比較少，且都分布在兩端。

圖4 玉米CHXs 家族基因結(jié)構(gòu)分析Fig.4 Gene structure analysis of maize CHXs

利用NCBI 對(duì)保守結(jié)構(gòu)域分析，結(jié)果表明N 端都含有保守的Na+/H+exchanger 結(jié)構(gòu)域，調(diào)控Na+轉(zhuǎn)運(yùn)，從而維持細(xì)胞質(zhì)Na+濃度保持在較低水平[29]。進(jìn)一步利用MEME 軟件分析16 個(gè)ZmCHX 保守基序（motif），結(jié)果如圖5 顯示N 端的motif 4、5、6、8、9、11 和12 共同構(gòu)成了Na+/H+exchanger 結(jié)構(gòu)域。并且，在此結(jié)構(gòu)域的C 端緊鄰一個(gè)AANH-like 結(jié)構(gòu)域（由motif 2、3 和7 構(gòu)成）。除此之外，在C 端還有2 保守結(jié)構(gòu)域（motif 1 和10），但這些結(jié)構(gòu)域的功能仍是未知的。綜上能夠看出這些ZmCHX 基因成員有共同的結(jié)構(gòu)域，并且保守性很高。由此說明玉米CHX 家族在進(jìn)化上是保守的，特別是基因結(jié)構(gòu)和保守結(jié)構(gòu)域的分布上。

圖5 玉米CHXs 保守結(jié)構(gòu)域和基序分析Fig.5 Conserved domain and motif analysis of maize CHXs

2.5 玉米CHX 基因表達(dá)模式分析

基于ePlant 數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)ZmCHX 家族進(jìn)行組織特異性分析。結(jié)果如圖6 所示，玉米的CHX 基因的表達(dá)模式和已發(fā)表的大豆CHX 表達(dá)模式相似[18]，都是在生殖器官中高表達(dá)，表明CHX 家族成員在生殖生長(zhǎng)過程扮演重要角色。而在Croup IV 中，ZMCHX19.1、ZMCHX19.2、ZMCHX19.3 和ZMCHX20 在花中表達(dá)量不高，卻在種子、莖、葉和根上有不同程度的表達(dá)。大部分ZmCHXs 在花藥中表達(dá)量高，ZMCHX15.2 和 ZMCHX15.3、ZMCHX15.1 和 ZMCHX15.2、ZMCHX15.1 和ZMCHX15.3 這三對(duì)同源基因在各組織中表達(dá)模式相似，都是在花粉中表達(dá)量最高（圖6）。據(jù)已有報(bào)道，ZmCHX15.2 的同源基因AtCHX15 在花藥中高表達(dá)，而ZmCHX15.2 表現(xiàn)出了相似的組織表達(dá)模式，在花藥中高表達(dá)。同樣地，ZmCHX20 與同源基因AtCHX20 具有相似的組織表達(dá)模式，在花藥中高表達(dá)[10]。

圖6 玉米CHXs 基因組織表達(dá)模式分析Fig.6 Tissue expression patterns of maize CHXs

為揭示ZmCHX 在脅迫應(yīng)答中的作用，基于玉米根部轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析ZmCHX 脅迫表達(dá)模式。結(jié)果如圖7 所示，在冷脅迫中，ZmCHX13.3 表達(dá)量最高，GroupⅣ中ZmCHX20 表達(dá)量上調(diào)，表明這些基因能夠響應(yīng)玉米冷脅迫。鹽脅迫下，ZmCHX19.2 和GroupⅣ中ZmCHX15.1 的表達(dá)量明顯上升，表明這2 個(gè)基因可能參與鹽脅迫應(yīng)答。ZmCHX2.1、ZmCHX13.3、ZmCHX13.1、ZmCHX15.2、ZmCHX15.1、ZmCHX19.2在鹽脅迫第三天表達(dá)量最高。在逆境脅迫下，GroupⅣ中表達(dá)量升高的成員最多，可能在脅迫應(yīng)答中發(fā)揮重要的作用。

圖7 玉米CHXs 基因冷和鹽脅迫表達(dá)模式Fig.7 Expression profiles of maize CHXs under cold and salt stresses

3 討論

由于植物是固著不可移動(dòng)的，易受外界環(huán)境不利因素的影響。據(jù)統(tǒng)計(jì)，目前鹽和冷脅迫對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成的損失逐年增加。鹽脅迫導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)鈉離子濃度增加，破壞離子體內(nèi)平衡。因此，過量的鈉離子會(huì)抑制酶的活性[30]。因此，植物一旦受到鹽脅迫，需要啟動(dòng)一系列信號(hào)途徑來維持體內(nèi)低鈉離子和高鉀離子含量。冷脅迫導(dǎo)致構(gòu)成膜的脂質(zhì)由液相轉(zhuǎn)變?yōu)楣滔?，即膜脂變相，引起與膜相結(jié)合的酶失活。隨著基因工程和基因組測(cè)序工作的不斷更新和完成，許多玉米基因組密碼陸續(xù)被破解，利用生物信息學(xué)手段分析基因功能和基因家族是現(xiàn)代基因功能研究的一個(gè)熱點(diǎn)。與玉米相關(guān)的基因家族研究已經(jīng)有很多報(bào)道，例如玉米SPP 基因家族[31]、玉米GATA 基因家族[32]、玉米XYLPs 基因家族[33]等，這些研究為了后續(xù)深入研究功能機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

目前，CHX 基因家族已經(jīng)在擬南芥[17]、大豆[18]、水稻[19]、以及藻類等多種植物中被報(bào)道[10]。但是關(guān)于玉米CHX 基因的研究尚未見報(bào)道。因此，研究利用生物信息學(xué)手段對(duì)玉米CHX 基因進(jìn)行了系統(tǒng)全面的分析，共鑒定篩選出16 個(gè)玉米ZmCHX 基因家族成員。值得注意的是，玉米和水稻CHX 基因數(shù)目相近，但二者基因數(shù)目約是擬南芥的一半。家族進(jìn)化和同源關(guān)系結(jié)果表明，玉米和水稻同是單子葉植物，同源基因較多。而玉米和擬南芥不同科不同屬，所以同源基因較少。擬南芥多余的CHX 基因存在功能冗余[17]。利用玉米CHX 基因家族與水稻和擬南芥在一起構(gòu)建物種進(jìn)化樹，從系統(tǒng)進(jìn)化樹和基因結(jié)構(gòu)可以看出，親緣關(guān)系相近的基因之間在保守基序和基因結(jié)構(gòu)上有高度的保守性和相似性。玉米CHX 基因家族成員不均勻的分布在8 條染色體上，亞細(xì)胞定位分析表明，與擬南芥、大豆以及葡萄定位結(jié)果相似，大多數(shù)是定位在細(xì)胞膜上[34]?；蚣易宓臄U(kuò)大主要是由基因復(fù)制引起的，在植物進(jìn)化過程中，復(fù)制的基因可以獲得新的功能或分割現(xiàn)有的功能，以提高植物的適應(yīng)性。不同物種在進(jìn)化中都存在基因復(fù)制關(guān)系[35]，根據(jù)同源性分析結(jié)果表明，玉米CHX 有2 對(duì)旁系同源基因，這說明基因復(fù)制對(duì)玉米基因家族的擴(kuò)增有一定意義。

通過對(duì)玉米CHX 基因家族成員的保守基序分析發(fā)現(xiàn)，蛋白N 端緊鄰Na+/H+exchanger 結(jié)構(gòu)域和蛋白C 末端緊鄰AANH-like 結(jié)構(gòu)域。目前，所有已被研究的植物CHX 成員中都有植物CHX 轉(zhuǎn)運(yùn)體的C 末端AANH-like 保守結(jié)構(gòu)域存在[17，34]。據(jù)前人報(bào)道，CHX 基因家族可以增強(qiáng)植物在生長(zhǎng)發(fā)育過程中抵抗外界不利環(huán)境的能力。水稻的OsCHX14 基因主要在花中表達(dá)[7]。擬南芥的AtCHX16/17/18/19 基因在其根、花粉以及花中有較高的表達(dá)量，當(dāng)擬南芥同時(shí)缺少這四個(gè)基因時(shí)，種子數(shù)量顯著減少[13]。研究中玉米CHX 基因家族成員同樣在花中表達(dá)量較高，表明CHX 家族基因成員可能參與開花結(jié)實(shí)等相關(guān)生物學(xué)過程。冷脅迫表達(dá)分析中，ZmCHX13.3、ZmCHX20 在冷脅迫過程中表達(dá)量上調(diào)，表明這些基因的過表達(dá)參與了低溫脅迫響應(yīng)。鹽堿脅迫下ZmCHX15.1、ZmCHX19.2 上調(diào)表達(dá)，表明這些基因可能參與調(diào)控鹽堿脅迫應(yīng)答。

通過對(duì)玉米ZmCHX 基因的研究分析，為了解和分析ZmCHX 基因家族成員的功能以及在玉米成花器官生長(zhǎng)發(fā)育的調(diào)控機(jī)制及維持細(xì)胞內(nèi)離子平衡等方面奠定了一定的理論基礎(chǔ)。后續(xù)將進(jìn)一步對(duì)玉米CHX 家族基因進(jìn)行功能驗(yàn)證。

4 結(jié)論

通過全基因組鑒定共獲得16 個(gè)ZmCHXs 基因家族成員，分布在8 條不同的染色體上；系統(tǒng)進(jìn)化將其分為3 組，且各組內(nèi)蛋白序列和基因結(jié)構(gòu)保守；進(jìn)一步組織表達(dá)特性和非生物脅迫表達(dá)特性分析表明ZmCHXs 主要表達(dá)在花藥中，且僅有Group Ⅳ基因的表達(dá)受冷及鹽脅迫誘導(dǎo)。