李靜，陳井生，郭永霞，3，周園園，3，曹尚

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學，大慶 163319；2.國家雜糧工程技術研究中心；3.黑龍江省作物有害生物互作生物學及生態(tài)防控重點實驗室；4.重慶三峽學院）

大豆胞囊線蟲（Soybean cyst nematode，SCN）病，是危害世界大豆生產(chǎn)的最主要病害之一。研究發(fā)現(xiàn)，大豆胞囊線蟲的二齡幼蟲侵入植物的根系后，會引起根系組織的機械損傷和代謝紊亂，感病的大豆會表現(xiàn)出根系短粗，植株矮化、萎黃和不易結實等癥狀[1]。大豆胞囊線蟲是一種典型的定居性內(nèi)寄生線蟲，對大豆等重要油料作物危害嚴重。由于線蟲分布廣泛，生存能力強，危害性大等特點，防治相對困難。大豆胞囊線蟲除了對大豆造成危害外，還可以在其它500多個作物種類上寄生。主要為害的作物是豆科，如：菜豆、兵豆、箭舌豌豆、香豌豆、豌豆等[2]。

紅小豆（Vigna angularis），學名赤豆，因種皮呈紅色，又名赤小豆、朱豆，是豆科一年生、直立或纏繞草本植物。我國的紅小豆種植面積和總產(chǎn)量均居世界首位[3]。紅小豆營養(yǎng)豐富，富含淀粉、蛋白質(zhì)、鐵、鈣、磷、鉀等礦物質(zhì)元素，脂肪含量低。同時現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，紅小豆對人體有顯著的抗氧化、護肝護腎、抗癌、降血壓降膽固醇、抗菌抗病毒等多種作用。由于紅小豆是醫(yī)食同源作物，且紅小豆的價格比主要糧食作物高、投入少，對農(nóng)民來說，紅小豆是重要的經(jīng)濟作物，也是欠發(fā)達地區(qū)脫貧攻堅的主要收入來源。因此，保證紅小豆的產(chǎn)量對于農(nóng)民來說是非常重要的。近些年，關于紅小豆的研究開始逐漸增多[4]。然而，紅小豆上的病害逐年增加，每年因病害引起的減產(chǎn)問題十分嚴重。紅小豆上的大豆胞囊線蟲病也嚴重影響了小豆的產(chǎn)量和品質(zhì)。然而，農(nóng)民對該病缺乏了解，導致未能及時有效地預防該病，造成不必要的經(jīng)濟損失?，F(xiàn)階段，關于大豆胞囊線蟲對紅小豆的致病性不明確，在紅小豆根內(nèi)的發(fā)育狀況尚無報道，大豆和紅小豆胞囊線蟲的侵染差異也尚不清楚。

大豆胞囊線蟲（Heterodera glycines Ichinohe）是一種土傳內(nèi)寄生線蟲[5]，是危害全球大豆生產(chǎn)的主要病害之一，由俄羅斯植物病理學家Jaczevski 在中國東北地區(qū)首次發(fā)現(xiàn)[6]。大豆胞囊線蟲由卵孵化，一齡幼蟲（J1）在卵內(nèi)發(fā)育，二齡幼蟲（J2）在15~30 ℃開始發(fā)育[7]，幼蟲侵染大豆根并在根內(nèi)寄生生活[8]，定殖后蟲體開始膨大，經(jīng)過蛻皮，三齡、四齡幼蟲出現(xiàn)。雌蟲與雄蟲交配最后一次蛻皮后，蟲體發(fā)育為成蟲，完成一個世代的發(fā)育循環(huán)[9]。該病害可使通常會使中國東北大豆產(chǎn)量減少5%~100%[10]。隨著大豆種植面積的逐年增加，大豆胞囊線蟲病每年給全球造成的經(jīng)濟損失超過16.2 億美元[11]。大豆胞囊線蟲的世代受溫度和季節(jié)的影響，如果溫度條件適宜，它完成一個世代大約需要25~30 d 的時間。由于溫度的影響，在北方地區(qū)，如東北，大豆胞囊線蟲一年可發(fā)生3~4 代，第一代歷時55 d[12]，在南方一年可發(fā)生4~5 代。但是，在不同植物中，其發(fā)育周期略有不同。

研究以大豆和紅小豆為試驗材料，在根部接種二齡幼蟲。取樣后，用次氯酸鈉-酸性品紅染色法對根組織中的線蟲進行染色，并在體視顯微鏡下對各齡期的根部線蟲數(shù)量進行檢測和計數(shù)，明確大豆胞囊線蟲對于紅小豆的侵染情況，大豆胞囊線蟲在大豆和紅小豆根部的發(fā)育動態(tài)揭示了大豆胞囊線蟲在紅小豆根部的發(fā)育過程和完成一個生活史所需的大致時間，為大豆胞囊線蟲在紅小豆上的有效防治提供了科學的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試品種

試驗所用的大豆品種為合豐50，由黑龍江省農(nóng)科院大慶分院提供；

試驗所用的紅小豆種質(zhì)資源為北7，由黑龍江八一農(nóng)墾大學作物育種研究室提供。

1.1.2 供試線蟲

試驗所用到的胞囊為黑龍江省農(nóng)科院大慶分院胞囊線蟲發(fā)病土壤分離獲得。胞囊置于自制孵化池中孵化。

大豆胞囊線蟲胞囊和J2 的獲得如下：

土壤樣品采集自黑龍江省農(nóng)科院大慶分院實驗基地，采用改良淘洗-過篩法[13]進行胞囊分離。具體方法是：用2 000 mL 燒杯取適量的大豆根際病土，置于淘洗桶中。加入適量水攪拌均勻。靜置10~20 s 后，依次通過堆疊的20 目、40 目、60 目、80 目金屬篩，用強水流將金屬篩上的雜物從20 目洗至40 目。再將80 目篩上的殘留物反復沖洗至水流清為止。于體式顯微鏡下挑取飽滿的胞囊。挑好的胞囊用0.5%NaClO 溶液消毒3~4 min，無菌水沖洗3 次。干燥后，將胞囊儲存于4 ℃的冰箱中，備用。

大豆胞囊線蟲懸液的制備：將胞囊放入自制的滅菌孵化池，將孵化池置于滅菌的培養(yǎng)皿中，向培養(yǎng)皿中加入適量無菌水，于25 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)孵化，期間更換無菌水，及時收集孵化出的二齡幼蟲（J2），置于4 ℃冰箱內(nèi)備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 大豆胞囊線蟲感染紅小豆田間驗證

試驗選紅小豆種質(zhì)資源為北7，播種于黑龍江省農(nóng)科院大慶分院實驗基地田間自然發(fā)病圃，于胞囊顯嚢期，將植株連根挖出，保持根系完整，調(diào)查根上胞囊數(shù)量。

1.2.2 大豆胞囊線蟲接種

采用盆栽試驗，用0.5% NaClO 對供試大豆和小豆種子進行表面滅菌3 min，并用無菌水沖洗。將供試大豆種子和紅小豆種子用濕潤的醫(yī)用紗布包裹，置于培養(yǎng)皿中，30 ℃條件下催芽，期間及時換水。待種子芽長2~3 cm 左右時，將種子播種于裝有經(jīng)過高溫滅菌砂土（體積比1∶2）的黑色塑料缽中。待植株長至兩葉期，分別在幼苗根部接種J2 懸浮液約（600 條·mL-1）1 mL。接種后每3 d 取一次樣，每次取5 株，進行根組織染色并計數(shù)。

1.2.3 植物根組織中線蟲的染色并計數(shù)

參照劉維志[14]方法，采用NaClO-酸性品紅對侵入根組織內(nèi)的線蟲進行染色，將洗凈的植株根系置于1.5%NaClO 溶液中浸泡5 min 后，用清水沖洗30 s以便去除根系表面殘留的NaClO，于蒸餾水中浸泡15 min。將根系轉(zhuǎn)入盛有酸性品紅的100 mL 的燒杯中，煮沸1~5 min，冷卻后用自來水沖洗根系表面的殘留的品紅，然后轉(zhuǎn)移到盛有100 mL 酸性甘油（甘油中加幾滴5 mol·L-1HCl）的燒杯中加熱褪色1~5 min，于體視解剖鏡下鏡檢大豆和紅小豆根內(nèi)線蟲的數(shù)量及發(fā)育動態(tài)。

1.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

分別計算每顆大豆根組織和紅小豆根組織中的各蟲態(tài)數(shù)量，即群體密度；統(tǒng)計各取樣時期各蟲態(tài)的平均群體密度，并利用origin 2018 軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。

2 結果分析

2.1 紅小豆外部癥狀

大豆胞囊線蟲侵染紅小豆后紅小豆的整株癥狀和地下部癥狀見圖1，可以看到大豆胞囊線蟲侵染紅小豆后，紅小豆地上部葉片缺綠，植株矮小，根系發(fā)育不良，主根長勢弱，根部著生大量白色胞囊。

圖1 大豆胞囊線蟲危害紅小豆植株的癥狀Fig.1 Symptoms of soybean cyst nematode endangering adzuki bean plants

2.2 紅小豆根組織染色觀察結果

圖2 是紅小豆根內(nèi)不同齡期線蟲，圖A 為接種后5 d 時紅小豆根內(nèi)的二齡幼蟲（J2），蟲體細長線條狀，寄生在紅小豆根內(nèi)維管束中；圖B 為接種后10 d時紅小豆根內(nèi)的三齡幼蟲（J3），蟲體逐漸膨脹呈臘腸狀；圖C 為接種后20 d 時紅小豆根內(nèi)的四齡幼蟲（J4），蟲體繼續(xù)膨大，呈豆莢狀；圖D 和E 接種后28 d 時紅小豆根內(nèi)的雌蟲和雄蟲，雌雄蟲形態(tài)不同，雌蟲呈檸檬形或近圓形，雄蟲呈細長蠕蟲狀，彎曲盤繞在紅小豆根組織內(nèi)。

圖2 不同齡期線蟲在紅小豆根內(nèi)發(fā)育情況Fig.2 The development of nematodes at different ages in the roots of Adzuki bean

2.3 大豆和紅小豆根組織中大豆胞囊線蟲的群體動態(tài)

大豆和紅小豆根組織中大豆胞囊線蟲J2、J3、J4的群體密度變化見圖3。由圖3（a）可知，在3 d 時，在大豆和紅小豆根組織中均已出現(xiàn)二齡幼蟲，根內(nèi)侵染的線蟲數(shù)量分別為25.8 條·株-1和20.0 條·株-1。在大豆的根組織內(nèi)，J2 群體密度在第9 天時出現(xiàn)高峰，為55.4 條·株-1，此后J2 數(shù)量開始減少，18 d 時最少。而在紅小豆根組織中，J2 群體密度在第12 天時最大，為87.6 條·株-1，此后數(shù)量逐漸減少，18 d 時數(shù)量最少。

由圖3（b）可知，J3 在大豆和紅小豆根組織中都最早出現(xiàn)在第6 天，侵染數(shù)量分別為0.2 條·株-1和1.4 條·株-1。在大豆根組織中，J3 群體密度在第12 天時達到高峰，侵染數(shù)量為60.4 條·株-1；此后J3 數(shù)量減少，持續(xù)到第27 天。在紅小豆根組織中，J3 群體密度在第18 天時出現(xiàn)高峰，數(shù)量為49.8 條·株-1，此后J3 數(shù)量減少，持續(xù)到第27 天。

由圖3（c）可知，大豆和紅小豆根組織中的J4 都出現(xiàn)在18 d，侵染數(shù)量分別為2.4 條·株-1和5.4 條·株-1。在大豆的根組織中，J4 群體密度在第24 天時出現(xiàn)高峰，為35 條·株-1；此后J4 數(shù)量開始減少，至30 d 為8.2 條·株-1。在紅小豆根組織內(nèi)，J4 群體密度在第24 天出現(xiàn)高峰，為32 條·株-1；此后數(shù)量開始減少，至30 d為2.4 條·株-1。

圖3 大豆和紅小豆根組織中大豆胞囊線蟲的群體動態(tài)Fig.3 Population dynamics of soybean cell cystic worms in soybean and Adzuki bean root tissue

2.4 大豆和紅小豆根組織中大豆胞囊線蟲的發(fā)育動態(tài)

大豆和紅小豆根組織中大豆胞囊線蟲J2、J3、J4的發(fā)育動態(tài)變化見圖4。大豆和紅小豆根內(nèi)線蟲在接種3 d 后開始侵入，均為J2 幼蟲。接種6 d 后，大豆和紅小豆根內(nèi)開始出現(xiàn)J3，但仍以J2 幼蟲為主。接種9 d 后，大豆根內(nèi)J2 的數(shù)量達到了峰值，為55.4 條·株-1。接種12 d 后，紅小豆根內(nèi)J2 幼蟲最多，為87.6 條·株-1，大豆根內(nèi)的J2 幼蟲開始減少，J3 幼蟲數(shù)量增加并且達到高峰，數(shù)量為60.4 條·株-1。

從圖4 可以看到，9 d 后大豆根內(nèi)和紅小豆根內(nèi)J2 的數(shù)量開始減少，并且都是在接種后第6 d 檢測到J3，18 d 檢測到J4，說明從J3 發(fā)育到J4 約9 d。但是在大豆根組織內(nèi)J3 在第12 d 達到發(fā)育高峰，J4 在24 d 時達到高峰，在大豆根組織中J3 發(fā)育高峰到J4 發(fā)育高峰歷經(jīng)12 d；在紅小豆根內(nèi)J3 在第18 d時達到高峰；J4 的發(fā)育高峰在24 d，在紅小豆根組織中J3 發(fā)育高峰到J4 發(fā)育高峰歷經(jīng)6 d?？梢钥闯黾t小豆根組織中J3 到J4 的發(fā)育時間較短，大豆根內(nèi)大豆胞囊線蟲的發(fā)育進程要長于紅小豆根內(nèi)的大豆胞囊線蟲。

圖4 大豆和紅小豆根組織中大豆胞囊線蟲的發(fā)育動態(tài)Fig.4 The developmental dynamics of soybean cell cystic worms in soybean and Adzuki bean root tissue

2.5 大豆和紅小豆根組織中大豆胞囊線蟲發(fā)育時間的確定

由圖3（d）可知，大豆在接種后21，24，27，30 d檢測到成熟雌蟲，且在30 d 是部分大豆根組織內(nèi)還有未發(fā)育完成的雌蟲。紅小豆在接種后21，24，27 d檢測到成熟雌蟲，在第30 天時部分紅小豆根組織內(nèi)已無成熟雌蟲。說明在研究中，在大豆根組織內(nèi)，大豆胞囊線蟲二齡幼蟲發(fā)育為成熟雌蟲大約需要21~30 d 以上的時間，而在紅小豆根組織內(nèi)，大豆胞囊線蟲二齡幼蟲發(fā)育為成熟雌蟲大約需要21~27 d 的時間。但這只代表部分發(fā)育較快線蟲完成其生活史所需要的時間，不能代表線蟲的一個發(fā)生世代。

3 討論

大豆胞囊線蟲病是危害大豆產(chǎn)量的一個重要因素，大豆胞囊線蟲侵染大豆根系引起病害，導致大豆植株矮化發(fā)黃，影響產(chǎn)量[15]。研究表明，大豆胞囊線蟲寄主范圍廣，能侵染大部分豆科植物以及一些豆區(qū)不常見植物[11]，研究通過對大豆和紅小豆上大豆胞囊線蟲侵染情況進行比較分析，發(fā)現(xiàn)大豆和紅小豆根組織中大豆胞囊線蟲的群體動態(tài)不同，紅小豆上J2的群體密度高峰大于大豆上的J2 的群體密度，且在紅小豆根系中大豆胞囊線蟲各蟲態(tài)發(fā)生量均明顯較高，因此，在條件適宜的情況下，大豆胞囊線蟲在紅小豆上的發(fā)病程度不次于大豆。紅小豆種植面積不斷加大，線蟲病害發(fā)生日趨嚴重，但該病害發(fā)生于植株根部，常常被人們忽視，因此，對該病害的有效防治也越來越重要。

在中國，大豆胞囊線蟲在大豆上1 年發(fā)生3~4或6 代。在美國明尼蘇達州南部大豆上大豆胞囊線蟲能夠完成3~4 代[16]。在研究中，從大豆和紅小豆根組織中大豆胞囊線蟲J2、J3、J4 的發(fā)育動態(tài)變化可以看到，J2、J3 在紅小豆中的出現(xiàn)高峰都比大豆要晚，而J4 出現(xiàn)的高峰要早?？芍t小豆中J3 到J4 的發(fā)育時間較短。究其原因，大豆胞囊線蟲對不同寄主的適合性和致病性存在差異[17]，研究中，大豆胞囊線蟲對紅小豆侵染這方面的探討未見報道，大豆胞囊線蟲對大豆和紅小豆的侵染存在一定的差異，適宜條件下，紅小豆內(nèi)的大豆胞囊線蟲發(fā)育更快，更快的出現(xiàn)雌蟲，并進入下一個侵染循環(huán)。

在22~23 ℃下，SCN 完成1 個世代需要21~27 d[18]，Niblack 等[19]指出，理論上大豆胞囊線蟲在1 個大豆生長季可以完成6 代，具體代數(shù)主要取決于寄主適合性、播種時間、雜草寄主狀況和土壤溫度等條件。試驗對大豆和紅小豆根組織中線蟲染色，鏡檢各齡期線蟲數(shù)量發(fā)現(xiàn)，大豆內(nèi)的大豆胞囊線蟲完成第一個生活史大概需要21~30 d。這與已報道的大豆胞囊線蟲完成一個世代為21~27 d 的結論一致[20]。研究表明，在接種J2 后21、24、27 d，在紅小豆中檢測到成熟雌蟲，而在紅小豆根組織內(nèi)，大豆胞囊線蟲二齡幼蟲發(fā)育為成熟雌蟲大約需要21~27 d 的時間。因此，適宜條件下，紅小豆內(nèi)的部分發(fā)育較快的大豆胞囊。

國內(nèi)外對于大豆上大豆胞囊線蟲的侵染、發(fā)育動態(tài)、發(fā)生世代的報道有很多，人們知道大豆胞囊線蟲是如何侵染大豆、線蟲的發(fā)生世代以及對于大豆上大豆胞囊線蟲的防治方法[21]。但是對于紅小豆上的大豆胞囊線蟲的侵染、發(fā)育動態(tài)的研究未見報道。研究明確了大豆胞囊線蟲對于紅小豆的侵染情況，并根據(jù)大豆胞囊線蟲在大豆和紅小豆根內(nèi)的發(fā)育動態(tài)，明確了紅小豆根內(nèi)線蟲的發(fā)育進程，為有效防治紅小豆上的大豆胞囊線蟲病提供了理論依據(jù)。

4 結論

紅小豆上的大豆胞囊線蟲的研究國內(nèi)一直未見報道，說明農(nóng)民對于紅小豆上大豆胞囊線蟲的危害并不清楚，研究證明了大豆胞囊線蟲會造成紅小豆地上部葉片缺綠，植株矮小，根系發(fā)育不良，主根長勢弱。因此，對于紅小豆上大豆胞囊線蟲病的防治不可忽視。藥劑防治大豆胞囊線蟲時，要結合線蟲各齡期的發(fā)育情況。掌握好使用藥劑的時間，才能達到理想的防治效果[20]?？刂拼蠖拱揖€蟲蟲口密度的關鍵時期是在線蟲侵染第一個高峰期出現(xiàn)時[22]，根據(jù)研究數(shù)據(jù)表明，線蟲侵染紅小豆的第12 d 是J2 數(shù)量的高峰，由于試驗接種的是已經(jīng)孵化出的二齡幼蟲。因此，田間防治紅小豆上的大豆胞囊線蟲病時，應在紅小豆出苗后及時調(diào)查，加強防治，以保證防治達到理想效果。