劉鼎鑫，孟凡舜，李仕韋，董稼詩(shī)，呂紅明，李鵬

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，大慶 163319）

寒冷氣候下，哺乳動(dòng)物主要通過兩方面來維持體溫恒定，減少散熱（如血管收縮）和增加產(chǎn)熱[1]。產(chǎn)熱分為顫栗性產(chǎn)熱和非顫栗性產(chǎn)熱，二者相互合作，機(jī)體首先不自覺顫抖，骨骼肌反復(fù)收縮，消耗儲(chǔ)存的糖原產(chǎn)生熱量，當(dāng)產(chǎn)生的熱量不足以抵抗外界寒冷刺激時(shí)，機(jī)體會(huì)激活棕色脂肪組織等不以骨骼肌產(chǎn)熱的非顫栗性產(chǎn)熱來維持體溫恒定[2]。非震顫性產(chǎn)熱主要發(fā)生在棕色脂肪組織中，低溫時(shí)，位于下丘腦上的冷熱感受器受到刺激，促使交感神經(jīng)興奮，交感神經(jīng)末梢會(huì)釋放去甲腎上腺素，去甲腎上腺素（NE）通過作用于棕色脂肪細(xì)胞上的β3 腎上腺素受體，在棕色脂肪細(xì)胞中最終啟動(dòng)甘油三酯分解[2]成游離脂肪酸，棕色脂肪細(xì)胞中含有大量的脂肪酸結(jié)合蛋白，在胞漿中與脂肪酸結(jié)合，運(yùn)送至線粒體，然后通脂肪酸過肉堿穿梭進(jìn)入到線粒體內(nèi)膜，通過β-ox 氧化代謝生成乙酰輔酶A 和NADH，后續(xù)產(chǎn)物參與到線粒體呼吸鏈中，脂肪酸還可以用于激活解偶聯(lián)蛋白（UCP1）。

酪氨酸是合成去甲腎上腺素的前體物質(zhì)，廣泛存在于食物蛋白中，同時(shí)也能在機(jī)體中合成，屬于非必需氨基酸[3]。長(zhǎng)期暴露于冷環(huán)境下，會(huì)造成去甲腎上腺素的耗竭，補(bǔ)充酪氨酸可以減弱去甲腎上腺素衰弱所造成的影響[4]。半胱氨酸是一種具有生理功能的氨基酸，是組成蛋白質(zhì)的20 多種氨基酸中唯一具有還原性巰基（-SH）的氨基酸，是還原型谷胱甘肽（GSH）的前體物[5]，由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸組成，廣泛存在于動(dòng)物組織細(xì)胞中。GSH 可參與機(jī)體多種重要的生化反應(yīng)，保護(hù)體內(nèi)重要酶蛋白巰基不被氧化、滅活，保證能量代謝、細(xì)胞利用[6]。同時(shí)，其通過巰基與體內(nèi)的自由基結(jié)合，可直接使自由基還原成酸性物質(zhì)，從而加速自由基的代謝，并對(duì)抗自由基對(duì)重要臟器的損害[7]。

酪氨酸和半胱氨酸與多種激素生成有關(guān)，兩者都可以在機(jī)體抵抗冷應(yīng)激中發(fā)揮作用，試圖通過在日糧中增加酪氨酸和半胱氨酸的攝食量，觀察機(jī)體在冷環(huán)境下脂質(zhì)代謝的變化。并初步探討其中的產(chǎn)熱機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器

甘油三脂（TC）、總膽固醇（TG）、高密度脂蛋白（HDL-C）、低密度脂蛋白（LDL-C）檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成公司；BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒（增強(qiáng)型）、SDS-PAGE 制膠試劑盒、SDA-PAGE 蛋白上樣緩沖液（5X）購(gòu)自上海碧云天公司；蛋白marker、底物發(fā)光液、PVDF 膜購(gòu)自美國(guó)MILLIPORE 公司；UCP1 兔單克隆抗體、β-Tublin 兔多克隆抗體、HRP 標(biāo)記的山羊抗兔IgG 購(gòu)自美國(guó)Proteinch 公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF 級(jí)C57 小鼠，雄性，3 周齡，體重14~16 g，購(gòu)自遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)股份有限公司。分為室溫對(duì)照組和4 °冷刺激組，冷刺激組又分為基礎(chǔ)日糧組和3組不同濃度的氨基酸飼料組，每組8 只。晝夜12 h 交替光照，自由飲水，室溫（27±2）°條件下飼養(yǎng)，一個(gè)月后進(jìn)行脫頸處死。

1.3 實(shí)驗(yàn)飼料

半胱氨酸純度99.66%，酪氨酸純度＞98%，購(gòu)自浙江一諾生物科技有限公司。分別在1Kg 鼠糧中添加20、60、100 g 的酪氨酸混合半胱氨酸（1∶1 混合），加工自沈陽前民飼料廠。

1.4 血液生化指標(biāo)檢測(cè)

小鼠禁食12 h，眼球采血1~2 mL，3 000 rpm·min-1離心10 min，提取血清。按試劑盒說明，血清TC 和TG 采用酶比色法進(jìn)行測(cè)定；高密度脂蛋白和低密度脂蛋白采用清除法進(jìn)行測(cè)定。

1.5 棕色脂肪組織的形態(tài)學(xué)分析

將各組小鼠肩胛脂肪組織放入4%多聚甲醛溶液中固定24 h，酒精梯度脫水，石蠟包埋，切片5 μm厚，蘇木精-伊紅（HE）染色，20 倍物鏡下觀察各組小鼠脂肪的形態(tài)。

1.6 UCP1 蛋白表達(dá)水平的檢測(cè)

采用Western blot 法。3 周齡小鼠喂養(yǎng)4 周后，斷頸處死，冰上分離肩胛脂肪組織。提取總蛋白后，使用BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白濃度。配制10%SDS-page 膠進(jìn)行電泳，每個(gè)樣本上樣量為20 μg，電泳程序?yàn)?0 V 30 min，80 V 30 min，120 V 30 min。將蛋白轉(zhuǎn)移至0.45 μm PVDF 膜上，用5%奶粉搖床室溫封閉2 h；加入U(xiǎn)CP1 兔單克隆抗體（1∶1 000）稀釋，4°孵育過夜；加入HRP 標(biāo)記的山羊抗兔（1∶10 000稀釋）孵育1 h；進(jìn)行化學(xué)發(fā)光成像。以β-tublin 為內(nèi)參照，使用Image Lab 軟件分析目標(biāo)條帶的目的蛋白與內(nèi)參蛋白的灰度比值。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

全部用Graphdprism8.0 進(jìn)行繪圖分析，采用spss26.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，試驗(yàn)結(jié)果采用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示（X±s），組間多重比較采用單因素方差分析，各組間兩兩比較采用t 檢驗(yàn)，P＜0.05 表示差異具有顯著性，P＜0.01 表示差異具有極顯著性，P＜0.001 表示差異極其顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 血脂水平

與常溫（Rt）組相比，正常冷刺激（Cold）組TG 水平顯著下降（P<0.05），低密度脂蛋白水平顯著下降（P＜0.05），TC 水平下降，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），高密度脂蛋白水平顯著升高（P＜0.01）；與Cold 組相比，1%C、3%C 和5%C 組TG、低密度脂蛋白水平均顯著減少（P＜0.05），高密度脂蛋白水平均顯著升高（P＜0.05），1%C 組TC 含量顯著下降（P＜0.05），3%C組下降不顯著（P＞0.05），5%C 組含量上升不顯著（P＞0.05）。

表1 各組小鼠血脂水平（X±s）Table 1 Blood lipid levels of mice in each group（X±s）

圖1 血脂四項(xiàng)的變化Fig.1 Changes of blood lipid

2.2 肩胛脂肪組織形態(tài)學(xué)的變化

棕色脂肪組織主要由脂肪細(xì)胞構(gòu)成，脂肪細(xì)胞內(nèi)分布著大大小小的脂滴，染色過程中由于酒精和二甲苯的作用，脂滴被溶解成空泡狀，因此被稱為多泡脂肪細(xì)胞，核基本成圓形[8]。HE 染色結(jié)果表明，在200 倍物鏡下觀察，Rt 組脂肪細(xì)胞內(nèi)的空泡相對(duì)較大，Cold 組及1%C、3%C 和5%C 組隨著氨基酸補(bǔ)充濃度的增加，大空泡相對(duì)減小，小空泡相對(duì)增多（圖2）。

圖2 小鼠肩胛脂肪組織HE 染色形態(tài)圖（×200）Fig.2 HE staining morphology of scapular adipose tissue in mice（×200）

2.3 UCP1 蛋白表達(dá)水平

Western blot 結(jié)果顯示，與Rt 組相比，Cold 組UCP1 表達(dá)升高但差異無顯著性（P＞0.05）；與Rt 和Cold 組相比，1%C、3%C 和5%C 組均有升高，3%C 組與5%C 組差異極顯著（P＜0.01），1%C 組差異不顯著（P＞0.05）。

3 討論

在北方寒區(qū)畜牧生產(chǎn)中，冷應(yīng)激是不可避免的問題，帶來一系列的負(fù)面影響，包括：內(nèi)環(huán)境失衡引起的生理代謝異常、免疫力下降導(dǎo)致的后續(xù)感冒等疾病、生產(chǎn)繁殖能力降低，甚至猝死[1]。如何防止動(dòng)物發(fā)生不良應(yīng)激或動(dòng)物在應(yīng)激時(shí)如何減輕一直是營(yíng)養(yǎng)生理學(xué)家研究的主要內(nèi)容，早期，楊煥民[9]研究發(fā)現(xiàn) 膽堿、酪氨酸與色氨酸具有較好的抗冷應(yīng)激效果。

圖3 Western blot 檢測(cè)各組肩胛脂肪中UCP1 蛋白表達(dá)水平Fig.3 Western blot was used to detect the expression of UCP1 protein in scapular fat of each group

機(jī)體暴露在寒冷中會(huì)引起特定的急性和慢性生理反應(yīng)[10]，冷暴露的急性生理反應(yīng)包括血管收縮和寒顫產(chǎn)熱，它們分別為減少熱量損失和增加代謝產(chǎn)熱[11]。血管收縮是通過反射和局部降溫引起的。當(dāng)身體失去熱量時(shí)，血管收縮和顫抖結(jié)合在一起，維持熱平衡[12]。急性冷應(yīng)激通常指冷暴露的時(shí)間從5 min 到幾小時(shí)，而慢性是指至少暴露24 h 以上[13]，實(shí)驗(yàn)小鼠連續(xù)每天放在4 °下3 h·d-1，3 周，對(duì)小鼠進(jìn)行慢性冷應(yīng)激，觀察小鼠脂肪變化。棕色脂肪組織是非顫抖性產(chǎn)熱的主要部位，約80%的熱量產(chǎn)生發(fā)生在棕色脂肪組織中[14]。

生熱需要能量，維持高能量消耗需要攝取葡萄糖、氨基酸和脂質(zhì)作為能量底物。動(dòng)物基礎(chǔ)代謝加強(qiáng)，消耗甘油三酯，分解成游離脂肪酸，作為棕色脂肪產(chǎn)熱的底物進(jìn)行產(chǎn)熱[15]。血脂四項(xiàng)結(jié)果顯示Cold組相對(duì)于Rt 組血清中TG、TC、低密度脂蛋白下降，高密度脂蛋白升高。說明小鼠在受到寒冷刺激時(shí)，外周組織器官中的甘油三酯減少，膽固醇由血液運(yùn)向肝臟增多；與Cold 組相比，補(bǔ)充酪氨酸與氨基酸組TG、TC、低密度脂蛋白逐漸下降，高密度脂蛋白逐漸升高，說明膳食補(bǔ)充劑酪氨酸聯(lián)合半胱氨酸會(huì)加快冷環(huán)境下的脂肪分解。有趣的是，我們觀察到TC 在1%C組、3%C 組逐步下降時(shí)，在5%C 組反彈，出現(xiàn)升高現(xiàn)象，這可能是當(dāng)機(jī)體內(nèi)單一成分降低時(shí)，機(jī)體為了維持正常的生理功能所作出的改變，引起的反彈現(xiàn)象。

結(jié)果表明在冷應(yīng)激情況下，小鼠的脂肪代謝被動(dòng)員，冷暴露大大加速了血液中甘油三酯的清除，這是由于棕色脂肪組織攝取增加的結(jié)果。棕色脂肪受神經(jīng)支配，高度血管化，新陳代謝活躍，位于嚙齒動(dòng)物的肩胛處[16-20]。白色脂肪組織（Wat）是哺乳動(dòng)物的主要脂肪儲(chǔ)存器官，在細(xì)胞脂質(zhì)滴中儲(chǔ)存有大量的甘油三脂，通常每個(gè)細(xì)胞有一個(gè)大的（單眼）脂滴，與白色脂肪組織不一樣的是，棕色脂肪雖然也含有脂滴，但是，這些脂滴更小，每個(gè)細(xì)胞都有許多的脂滴[21]。棕色脂肪組織在適應(yīng)性產(chǎn)熱中起著關(guān)鍵作用，這是一種生理過程，在此過程中能量被耗散以響應(yīng)環(huán)境的變化。

接下來檢測(cè)肩胛脂肪組織的變化。脂肪細(xì)胞中儲(chǔ)存有大量甘油三酯，當(dāng)受到寒冷環(huán)境刺激時(shí)，脂滴中貯存的甘油三脂將被分解為甘油和脂肪酸，脂肪細(xì)胞會(huì)變小[22]。HE 結(jié)果顯示，補(bǔ)充酪氨酸和半胱氨酸組小鼠肩胛處脂肪脂滴相比對(duì)照組氣泡減小，隨著濃度的升高，氣泡也逐漸縮小。與血脂結(jié)果相一致，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明合適劑量范圍內(nèi)酪氨酸聯(lián)合半胱氨酸有利于脂肪的分解，增強(qiáng)基礎(chǔ)代謝。

UCP1 是棕色脂肪產(chǎn)熱的關(guān)鍵蛋白，位于線粒體內(nèi)膜，負(fù)責(zé)將氧化磷酸化與ATP 的產(chǎn)生解偶聯(lián)，從而釋放能量產(chǎn)生熱量。在冷環(huán)境下，下丘腦受到刺激，交感神經(jīng)興奮會(huì)導(dǎo)致兒茶酚胺神經(jīng)遞質(zhì)去甲腎上腺素的釋放，去甲腎上腺素與棕色脂肪組織的腎上腺能受體結(jié)合，啟動(dòng)包括環(huán)磷酸腺苷（cAMP）和蛋白激酶A（PKA）在內(nèi)的信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，然后磷酸化并激活酶激素敏感脂肪酶（HSL），然后將甘油三酯（TG）分解為游離脂肪酸（FFA）。然后脂肪酸通過肉堿穿梭進(jìn)入線粒體，氧化代謝后生成乙酰輔酶A，激活UCP1的活性。如圖4 所示。酪氨酸是合成去甲腎上腺素的前體物質(zhì)，有研究表明，補(bǔ)充酪氨酸可以提高酪氨酸比[3]，從而增加酪氨酸的水平，加快去甲腎上腺素的生物合成。實(shí)驗(yàn)開展了western blot 試驗(yàn)，對(duì)棕色脂肪關(guān)鍵產(chǎn)熱性蛋白UCP1 進(jìn)行檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，相比于對(duì)照組，冷應(yīng)激組肩胛脂肪組織UCP1 蛋白表達(dá)水平數(shù)值有所升高，雖然差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，仍能提示冷應(yīng)激對(duì)UCP1 蛋白表達(dá)有一定的促進(jìn)作用，此結(jié)果與前人結(jié)果相一致[5，14，23]。與冷刺激組相比，補(bǔ)充酪氨酸和半胱氨酸劑量組均表達(dá)升高，隨著濃度的增加，UCP1 蛋白的表達(dá)量也增加。呈現(xiàn)出濃度依賴性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)遭遇冷環(huán)境，機(jī)體大量產(chǎn)生并消耗去甲腎上腺素時(shí)，補(bǔ)充酪氨酸有利于機(jī)體促進(jìn)去甲腎上腺素生成，從而提高棕色脂肪組織中解偶聯(lián)蛋白UCP1 的表達(dá)，消耗更多的能量，以熱量的形式散發(fā)出去，抵抗寒冷環(huán)境對(duì)機(jī)體造成的損傷。

UCP1 的產(chǎn)熱機(jī)制與線粒體氧化磷酸化有關(guān)，呼吸電子傳遞鏈產(chǎn)生H+跨線粒體內(nèi)膜的勢(shì)能，在偶聯(lián)狀態(tài)下，勢(shì)能驅(qū)使H+通過ATP 合成酶而重新回到線粒體基質(zhì)中，同時(shí)將勢(shì)能轉(zhuǎn)化為ATP 的化學(xué)能。由于UCP1 在線粒體內(nèi)膜上有特殊的通道，由電子傳遞鏈泵出的氫離子直接通過這種通道流回線粒體內(nèi)，使跨線粒體內(nèi)膜的質(zhì)子電化學(xué)梯度消失，ADP 不能進(jìn)行磷酸化形成ATP，物質(zhì)氧化與ATP 生成脫偶聯(lián)，即質(zhì)子滲漏，而成為產(chǎn)熱過程，能量以熱能形式釋放。隨著熱量產(chǎn)生的增加，呼吸對(duì)氧氣的消耗，體內(nèi)不可避免的會(huì)產(chǎn)生活性氧（ROS），ROS 可誘導(dǎo)不同形式的細(xì)胞氧化損傷，擾亂氧化還原狀態(tài)，并可改變多種代謝酶的活性，產(chǎn)生氧化應(yīng)激。研究人員們發(fā)現(xiàn)[24-26]，在冬眠狀態(tài)中，發(fā)現(xiàn)抗氧化酶包括SOD，GSH-PX 和谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶的轉(zhuǎn)錄水平增加。Dusko P[27]通過比較不同動(dòng)物的反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)最為常見的是抗氧化防御能力的增加，以及谷胱甘肽水平的提高，推測(cè)機(jī)體為可能因?yàn)槿毖跻鸬难趸瘧?yīng)激而提取準(zhǔn)備，是進(jìn)化的首選。半胱氨酸作為谷胱甘肽的前體物，通過增加飼料中的半胱氨酸比，來提高谷胱甘肽的生成，增強(qiáng)抗氧化能力，對(duì)于動(dòng)物養(yǎng)殖業(yè)來說。似乎是一種簡(jiǎn)單低價(jià)而又有效的方法。

4 結(jié)論

研究表明，日糧中補(bǔ)充氨基酸可以提高棕色脂肪產(chǎn)熱的能力，促進(jìn)脂肪分解，對(duì)機(jī)體起到保護(hù)作用。隨著酪胺酸聯(lián)合半胱氨酸濃度的升高，對(duì)脂質(zhì)分解的影響也逐漸增長(zhǎng)，日糧中補(bǔ)充3%酪氨酸聯(lián)合半胱氨酸效果最好，為動(dòng)物添加氨基酸最適濃度提供一定的參考。