王欣，劉碩，馬駿，王然，陳晶，周玉龍，朱戰(zhàn)波，崔玉東，

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動物科技學(xué)院，大慶 163319；2.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科技學(xué)院）

奶牛乳腺炎是危害奶牛健康和妨礙奶業(yè)發(fā)展最為嚴(yán)重的奶牛疾病，金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，S.aureus）是引起該病最為常見的病原菌。以往防治金黃色葡萄球菌性奶牛乳腺炎主要依賴抗生素，但隨著抗生素應(yīng)用，S.aureus 菌耐藥性不斷增強(qiáng)，已產(chǎn)生了耐受青霉素類、大環(huán)內(nèi)酯類以及萬古霉素等多種類藥物的耐藥菌株[1-2]。目前，使用疫苗注射防治S.aureus 感染以及奶牛乳腺炎已成為公認(rèn)的最為有效手段之一[3]。

S.aureus 在感染宿主過程中需要不斷獲取營養(yǎng)物質(zhì)，微量元素鐵便是所要獲取的重要營養(yǎng)物質(zhì)之一，鐵也是在新陳代謝活動中的電子轉(zhuǎn)移載體[4]。在S.aureus 表面存在著由多蛋白構(gòu)成的鐵攝入系統(tǒng)，鐵調(diào)節(jié)的表面決定簇B（iron-regulated surface determinant B，IsdB）便是該系統(tǒng)成員之一。IsdB 是帶有細(xì)胞壁錨定基序LPXTG 的蛋白[5]，在S.aureus 感染部位，隨著氧化還原電位改變和pH 變化，鐵離子就會變成氧化態(tài)，從而有利于鐵的轉(zhuǎn)化利用，為入侵的葡萄球菌提供營養(yǎng)物質(zhì)[6]。Kuklin 等[7]最先用小鼠模型和恒河猴研究證明了重組IsdB 能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生良好的免疫應(yīng)答和明顯的抗感染免疫保護(hù)作用。王寧等[8]將IsdB 蛋白分成3 段，通過小鼠免疫接種研究證明，其中的IsdB137-361片段所誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答能力和免疫保護(hù)作用等同于IsdB 全蛋白，并將其與S.aureus 的RNAⅢ活化蛋白的靶蛋白（TRAP）串聯(lián)，增強(qiáng)了串聯(lián)蛋白的免疫原性。此后又進(jìn)一步與鏈球菌GapC 的免疫優(yōu)勢片段構(gòu)建成融合蛋白并命名為GIT，通過小鼠試驗(yàn)研究證實(shí)，GIT 可有效預(yù)防S.aureus 和鏈球菌感染[9]，已成為預(yù)防奶牛乳腺炎有效的候選疫苗抗原。目前，正在開展GIT 牛體免疫接種試驗(yàn)，但缺少免疫接種后實(shí)驗(yàn)牛血清抗體檢測和評價方法。

酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）是臨床血清抗體檢測常用手段，具有特異、靈敏、簡便、快速、適于定量和大規(guī)模檢測等優(yōu)點(diǎn)。研究擬以IsdB137-361作為抗原，建立IsdB137-361相關(guān)抗原免疫牛血清抗體間接ELISA 檢測方法，為GIT候選疫苗的奶牛臨床試驗(yàn)抗體檢測提供技術(shù)支持。

1 材料方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、血清及質(zhì)粒

S.aureus Wood46 菌株、大腸桿菌工程菌株BL21（DE3）、攜帶重組IsdB 質(zhì)粒的BL21（DE3）菌株、pET32a 質(zhì)粒、pGEX-6p-1 質(zhì)粒、無乳鏈球菌HLJ57免疫血清、S.aureus 重組IsdB 及Trap 免疫血清、含IsdB137-361的GIT 融合蛋白免疫血清由實(shí)驗(yàn)室制備保存；牛布氏桿菌病陽性血清、大腸桿菌腹瀉牛血清以及選取來自雞西、北安、林甸、內(nèi)蒙古、虎林的成年奶牛的待檢牛血清樣本均由我校獸醫(yī)傳染病實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.2 試劑

蛋白分子量標(biāo)記物購自于Thermo 公司；His 蛋白純化樹脂柱、GST 蛋白純化樹脂柱從PointBio 公司購入；硝酸纖維膜、TMB 顯色液、牛血清白蛋白（BSA）從索萊寶科技公司購入；鼠源抗GST 抗體從Proteintech 公司購入、鼠源抗His 抗體、HRP 羊抗鼠IgG、HRP 兔抗牛IgG 從Bioss 生物公司購入。

1.2 方法

1.2.1 重組IsdB137-361表達(dá)與純化

從攜帶重組IsdB 質(zhì)粒的BL21（DE3）菌株中提取質(zhì)粒作為PCR 模板，按照王寧[8]設(shè)計(jì)的上、下游引物PCR 擴(kuò)增S.aureus IsdB137-361的基因片段，并將擴(kuò)增產(chǎn)物分別連接到pET32a 和pGEX-6P-1 上（分別記作pET32a-IsdB137-361和pGEX-6P-1-IsdB137-361），轉(zhuǎn)入BL21（DE3）中，經(jīng)鑒定正確后，于37 ℃條件下以0.1 mM 的IPTG 誘導(dǎo)表達(dá)3~4 h 后收集菌體，用SDS聚丙烯凝膠電泳分析表達(dá)情況。同時，對電泳后凝膠進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，分別以抗His 抗體和抗GST 抗體作一抗進(jìn)行蛋白質(zhì)印記實(shí)驗(yàn)鑒定。將pET32a 表達(dá)IsdB137-361（簡稱eIsdB137-361）及其pET32a 標(biāo)簽蛋白的菌體裂解物用His 樹脂柱純化，將pGEX-6p-1 表達(dá)IsdB137-361（簡稱gIsdB137-361）的菌體裂解物用GST 樹脂柱純化。eIsdB137-361和pET32a 標(biāo)簽蛋白用于制備牛免血清；gIsdB137-361和GST 標(biāo)簽蛋白用作試驗(yàn)檢測抗原。

1.2.2 免疫血清制取

將純化的eIsdB137-361、pET32a 標(biāo)簽蛋白和培養(yǎng)3~4 h、經(jīng)福爾馬林滅活的S.aureus Wood46 菌體分別以1∶1 體積比與弗氏佐劑乳化，選取健康的12 月齡左右的Holstein 牛進(jìn)行頸部肌肉接種，第一次免疫蛋白抗原與全菌體分別于弗氏完全佐劑進(jìn)行混合，蛋白抗原接種劑量為1.5 mg·頭-1、全菌體抗原接種劑量為3×1010cfu·頭-1。3 周后以同樣劑量與弗氏不完全佐劑進(jìn)行第二次免疫接種。同時以PBS 與佐劑乳化作為對照。第二次免疫接種后10~14 d 采血制取血清。

1.2.3 間接ELISA 工作條件優(yōu)化

按照參考文獻(xiàn)[10]介紹的方法進(jìn)行間接ELISA操作和工作條件優(yōu)化，即對包被抗原濃度、血清稀釋度、包被液選擇、包被時間和溫度、封閉液種類、封閉時間和溫度以及血清（一抗）孵育時間等條件進(jìn)行優(yōu)化。最初試驗(yàn)操作程序?yàn)?，用pH 9.6 的碳酸鹽緩沖液作包被液稀釋抗原后，在4 ℃條件下包被12 h；用PBST（含體積比0.05% Tween-20 的pH7.2 的PBS）溶液洗滌5 次后，用5%脫脂奶于37 ℃封閉2 h，再用PBST 洗滌后加入血清，于37 ℃孵育1 h，用PBST 洗滌后加入1∶8 000 稀釋的二抗，于37 ℃孵育1 h 后，用PBST 溶液洗滌，加入TMB 顯色液，置黑暗條件下10 min 后，加入2M H2SO4將反應(yīng)終止，立即檢測OD450 數(shù)值。將OD450 陽性值與陰性值比（P/N）大于2.1 以上且比值最大者判定為ELISA 最佳反應(yīng)條件。

（1）包被液及包被條件優(yōu)化

選取pH 8.6 的Tris 鹽緩沖液、pH 9.6 的碳酸鹽緩沖液、pH 6.0 的檸檬酸鹽緩沖液、pH 7.4 的磷酸鹽緩沖液（PBS）、pH 7.2 的PBS 和pH 7.0 的水作為抗原包被液進(jìn)行優(yōu)化，然后用優(yōu)化后的被液包被抗原，分 別 于37 ℃2 h、37 ℃1 h、37 ℃45 min、37 ℃30 min、4 ℃過夜、4 ℃過夜加37 ℃1 h 的反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化。

（2）封閉液及封閉條件優(yōu)化

使用優(yōu)化后的包被液和包被條件完成抗原包被后，再選取5%脫脂奶、1%牛血清白蛋白（BSA）、5%胎牛血清（FCS）、1%BSA+5%蔗糖和1%明膠作為封閉液進(jìn)行優(yōu)化，再使用優(yōu)化后的封閉液封閉，分別于37 ℃3 h、37 ℃2 h、37 ℃1 h、37 ℃30 min、37 ℃15 min 的封閉條件進(jìn)行優(yōu)化。

（3）血清孵育條件優(yōu)化

按照優(yōu)化后的包被液和包被條件包被抗原，再以優(yōu)化后的封閉液和封閉條件進(jìn)行封閉，然后加入血清，分別以37 ℃溫度下2、1 h、30、15、5 min 為血清孵育時間進(jìn)行孵育條件優(yōu)化。

1.2.4 Cut-off 值確定

用26 頭陰性對照牛血清和20 頭GIT 免疫牛血清，采用優(yōu)化的間接ELISA 條件進(jìn)行檢測，以測得的OD450 值求出平均值、標(biāo)準(zhǔn)差（SD）。用SPSS 軟件對血清OD450 值正態(tài)分布和做ROC 曲線分析，根據(jù)分析結(jié)果和約登指數(shù)合理確定cut-off 值[11]。

1.2.5 特異性與敏感性確定

用優(yōu)化后的反應(yīng)條件分別對eIsdB137-361、GIT、pET32a 標(biāo)簽蛋白、Trap 和鏈球菌GapC 蛋白免疫牛血清，滅活的金葡菌Wood46 株、無乳鏈球菌HLJ57株免疫牛血清以及臨床采集的大腸桿菌腹瀉牛血清、牛布氏桿菌陽性血清等進(jìn)行間接ELISA 檢測，根據(jù)確定的cut-off 值判和評價其特異性。

分別將陰、陽性血清進(jìn)行倍比稀釋，并以PBS 為空白對照組。以P/N>2.1 的最大稀釋倍數(shù)來判定方法的敏感性[12]；以O(shè)D450 值小于cut-off 值的稀釋倍數(shù)為最低檢測水平[13]。

1.2.6 穩(wěn)定性檢測

用同一批gIsdB137-361抗原在不同的3 個時間測定6 份不同血清OD450 值。每個血清樣本重復(fù)不少于8 次，根據(jù)變異系數(shù)來確定該方法的批內(nèi)穩(wěn)定性；用不同批次的gIsdB137-361抗原包被不同批次酶標(biāo)板，檢測6 份不同血清的OD450 值，每個血清樣本重復(fù)不少于8 次，根據(jù)變異系數(shù)確定方法的批間穩(wěn)定性。

1.2.7 臨床樣品檢測

用該間接ELISA 方法對來自于5 個不同牛場的84 份待檢牛血清樣本進(jìn)行檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組IsdB137-361 表達(dá)及純化結(jié)果

含pET32a-IsdB137-361和pGEX-6P-1-IsdB137-361質(zhì)粒的BL21（DE3）分別誘導(dǎo)表達(dá)后，經(jīng)SDS-PAGE電泳后可見，重組蛋白eIsdB137-361和gIsdB137-361分別在47 KD、52 KD 處出現(xiàn)蛋白質(zhì)條帶，用抗His 或GST 標(biāo)簽蛋白抗體進(jìn)行western-blot 驗(yàn)證，兩個重組蛋白均與相應(yīng)抗體發(fā)生特異性反應(yīng)，說明均正確表達(dá)，并能獲得理想純化（詳見圖1）。

圖1 重組蛋白IsdB137-361 表達(dá)及純化Fig.1 Expression and purification of the recombinant IsdB137-361

2.2 包被抗原濃度及血清稀釋度優(yōu)化結(jié)果

為確定最適抗原包被濃度和血清稀釋倍數(shù)，將抗原gIsdB137-361稀釋成5、2.5、1.25、0.625 μg·mL-1，陰性、陽性血清分別稀釋成1∶500、1∶1 000、1∶2 000、1∶4 000后，采用方陣法進(jìn)行間接ELISA 檢測。結(jié)果顯示，抗原濃度為2.5 μg·mL-1、血清做1∶1 000 稀釋時，P/N值最大（見表1）。

表1 包被抗原濃度與血清稀釋度優(yōu)化（P/N 值）Table 1 Optimization of coated antigen concentration and serum dilution（P/N）

2.3 反應(yīng)條件優(yōu)化結(jié)果

2.3.1 包被液及包被條件優(yōu)化

經(jīng)間接ELISA 對6 種包被液進(jìn)行優(yōu)化后，結(jié)果以pH 9.6 的碳酸鹽緩沖液的P/N 值最大（見圖2）；對包被條件優(yōu)化后，以4 ℃條件下12 h 的P/N 值最大（見圖3）。

圖2 包被液優(yōu)化結(jié)果Fig.2 Optimization results of coating solution

圖3 包被條件優(yōu)化結(jié)果Fig.3 Optimization results of coating condition

2.3.2 封閉液及封閉條件優(yōu)化

在確定好包被液和包被條件后，繼續(xù)通過間接ELISA 對5 種封閉液和封閉條件進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果顯示，封閉液以5% 脫脂乳（PBST）的P/N 值最大（見圖4）；封閉條件以37 ℃條件下30 min 的P/N 值最大（見圖5）。

圖4 封閉液優(yōu)化結(jié)果Fig.4 Optimization results of blocking solution

圖5 封閉條件優(yōu)化結(jié)果Fig.5 Optimization results of blocking condition

2.3.3 血清孵育條件的優(yōu)化

在確定好包被液和包被條件、封閉液和封閉條件后，繼續(xù)對血清孵育條件進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果顯示，血清孵育條件以37 ℃孵育15 min 時P/N 值最大，結(jié)果如圖6。

圖6 血清孵育條件優(yōu)化結(jié)果Fig.6 Optimization result of serum incubation condition

2.4 Cut-off 值

通過對20 份免疫牛血清和26 份陰性對照牛血清做間接ELISA 檢測，并根據(jù)測得的OD450 值求出平均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差。用SPSS 軟件對血清OD450 值進(jìn)行

正態(tài)分布分析和ROC 曲線分析，陽性血清與陰性血清檢測OD450 值分布無重疊（見圖7），進(jìn)一步計(jì)算

圖7 GIT 免疫牛血清的間接ELISA 反應(yīng)性Fig.7 Reactivity of sera from GIT-immunized bovine in the indirect ELISA

“約登指數(shù)”顯示，cut-off 值的取值范圍在0.329~0.629 之間時，特異性96.2%~100%，敏感性均為100%。而陰性血清OD450 值的平均值為0.15，取3

倍陰性血清的平均值作為cut-off 值，此時cut-off 值

為0.45。

2.5 間接ELISA 的特異性與敏感性

用該間接ELISA 檢測方法對不同抗原蛋白或滅活全菌體免疫血清以及臨床采集的病牛陽性血清進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示，使用的抗原除了與eIsdB137-361蛋白免疫牛血清和GIT 免疫牛血清呈陽性反應(yīng)外，其他血清均呈陰性反應(yīng)，抗原未見交叉反應(yīng)性（詳見圖8）。

圖8 抗原與其它牛血清的交叉反應(yīng)性Fig.8 Cross reactivity of the antigen with other bovine serum by ELISA

分別對陽性和陰性血清做倍比稀釋后進(jìn)行間接ELISA 檢測，陽性血清稀釋至1∶8 000 時，其OD450值的P/N>2.1，敏感度為1∶8 000；最低可檢測血清稀釋度1∶16 000。而當(dāng)陰性血清稀釋至1∶500 時，OD450 值已經(jīng)低于cut-off 值，也說明了cut-off 值比較合理（見圖9）。

圖9 間接ELISA 的最低檢測限度確定Fig.9 The minimum detection limit determination of the indirect ELISA

2.6 間接ELISA 的穩(wěn)定性結(jié)果

同一批制備的抗原和試劑在不同時間重復(fù)檢測，所得到的OD450 值變化范圍在4.3%~9.7%之間。用不同批次制備的抗原和試劑進(jìn)行重復(fù)性檢測，所得到的OD450 值變化范圍在3.3%~9.2%之間。即批內(nèi)和批間變異系數(shù)均小于10%，說明該ELISA 法穩(wěn)定。

2.7 牛臨床血清樣本檢測結(jié)果

對臨床收集的84 份待檢牛血清用該間接ELISA方法檢測，陽性檢出率為28.74%。5 個不同牛場的具體結(jié)果詳見表2。

表2 臨床樣本檢測結(jié)果Table 2 The results of detection for clinical bovine serum samples by the indirect ELISA

3 討論

ELISA 被廣泛地用于醫(yī)學(xué)診斷工具和生物醫(yī)學(xué)研究的分析工具，檢測和定量特異性抗原或樣本中的抗體，也被用作各種工業(yè)質(zhì)量控制[14]。間接ELISA是將特異性抗原粘附到微量酶標(biāo)板孔壁上，然后用非反應(yīng)性蛋白封閉沒有被抗原包被上部分，然后有特異性的一抗與抗原發(fā)生特異性反應(yīng)，再由酶標(biāo)記的二抗反應(yīng)，以酶底物顯色，顯色程度與抗體濃度相關(guān)，方法可用于大批量定量檢測。在前期的奶牛乳房炎主要病原菌疫苗研究中，已經(jīng)將含有S.aureus IsdB137-361的融合蛋白GIT 制備成候選疫苗，目前正在開展奶牛臨床免疫接種試驗(yàn)，為了滿足對疫苗免疫后的IsdB137-361抗體檢測，開展了研究工作。研究結(jié)果初步顯示，所建立的間接ELISA 方法檢測IsdB137-361相關(guān)抗原免疫牛血清抗體表現(xiàn)出了較好的特異性和敏感性。但由于目前缺少可照的商業(yè)化或成型的該抗原檢測方法[15-16]，研究所建立的間接ELISA 方法還需在后續(xù)的研究和應(yīng)用過程中進(jìn)一步完善。

前期候選疫苗構(gòu)建時使用了pET32a 表達(dá)GIT，在建立該間接ELISA 檢測方法時又用pET32a 表達(dá)的IsdB137-361作為抗原免疫接種牛制備了陽性血清。為了避免檢測抗原與pET32a 的標(biāo)簽蛋白發(fā)生交叉反應(yīng)，選用了pGEX-6p-1 載體表達(dá)的IsdB137-361，即gIsdB137-361作為檢測抗原。試驗(yàn)研究顯示，gIsdB137-361作為抗原檢測pET32a 標(biāo)簽蛋白免疫血清為陰性，而檢測eIsdB137-361免疫血清和GIT 免疫血清均呈陽性，說明較好地避免了與表達(dá)載體的標(biāo)簽蛋白發(fā)生交叉反應(yīng)；但檢測滅活金黃色葡萄球菌Wood46 免疫血清的結(jié)果也是陰性，這可能與IsdB 在細(xì)菌中的表達(dá)量占菌體全蛋白量過低而沒有誘導(dǎo)明顯抗體產(chǎn)生的原故。由于試驗(yàn)中缺少確切的金黃色葡萄球菌感染牛血清，未能證實(shí)該方法是否可用于金黃色葡萄球菌感染牛血清檢測，但可在后續(xù)GIT 免疫攻毒試驗(yàn)中獲得金黃色葡萄球菌感染牛血清后加以驗(yàn)證。

用建立的間接ELISA 方法對臨床收集的84 份待檢牛血清樣本進(jìn)行了檢測，有25 份血清呈陽性。但對于這些血清樣本來源的奶牛情況如年齡、是否懷孕、是否有過感染等無法了解，進(jìn)而也無法查清這些陽性結(jié)果的原因[16-17]。在今后開展研究過程中，應(yīng)該對待檢血清來源的牛進(jìn)行嚴(yán)格健康調(diào)查、在實(shí)驗(yàn)各個環(huán)節(jié)都做到確實(shí)可靠，或者建立探討其他檢測方法進(jìn)行比較檢測，確保所建立的間接ELISA 檢測方法在實(shí)踐應(yīng)用中達(dá)到理想效果。