陳宏哲，孫長松，孫雅梅，徐丹丹，薛 華，陳 曉

肺癌是我國死亡率最高的惡性腫瘤，肺腺癌是 非小細胞肺癌中常見的病理類型， 發(fā)病年齡較小，在 發(fā) 病 早 期 即 可 發(fā) 生 血 行 轉(zhuǎn) 移［1］。 環(huán) 狀RNA（circRNAs） 是通過共價鍵形成的閉合環(huán)狀非編碼RNA［2］。 隨著高通量測序技術(shù)及生物信息學(xué)技術(shù)的發(fā)展，越來越多的研究表明，circRNA 能夠在表觀遺傳、轉(zhuǎn)錄以及轉(zhuǎn)錄后等多種水平上調(diào)控人體生理病理活動，調(diào)控腫瘤細胞的增殖、凋亡、侵襲、遷移等生物學(xué)行為，影響腫瘤的生長、侵襲和轉(zhuǎn)移［3-4］。 目前，關(guān)于肺腺癌circRNA 表達的研究多集中在腫瘤組織，其在外周血中的表達研究較少［5-7］。 環(huán)狀閉合結(jié)構(gòu)使circRNA 不會被核酸外切酶R 的消化，與線性RNA 相比在血液中有更高的穩(wěn)定性， 在無創(chuàng)診斷領(lǐng)域具有很大應(yīng)用價值。 因此，本研究選取文獻報道較為集中的hsa_circ_0013958 和circHIPK3（hsa_circ_0000284），分析其在肺腺癌患者外周血中表達及表達水平與腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移的關(guān)系［8-9］。

1 對象與方法

1.1對象 選取2019 年1 月～2021 年6 月于黑龍江省醫(yī)院就診的肺腺癌患161 例（肺腺癌組）。 所有患者均經(jīng)病理確診為肺腺癌； 未行放化療等治療。 排除肺癌復(fù)發(fā)或合并其他惡性腫瘤患者。 簽署知情同意書后取樣。 另于體檢中心招募健康志愿者50 例（健康對照組），要求既往體健，無惡性腫瘤家族史。肺腺癌組男72 例、女89 例，年齡39 ～74 歲，健康對照組男22 例，女28 例，年齡40 ～69 歲。

1.2方法

1.2.1儀器與試劑 熒光定量PCR 儀為Thermo Fisher 生產(chǎn)，血液總RNA 提取試劑盒為天根生化科技（北京）有限公司生產(chǎn)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒和熒光定量PCR 試劑盒為寶日醫(yī)生物技術(shù) （北京） 有限公司（TaKaRa 中國）提供。

1.2.2檢測方法 肺腺癌患者于術(shù)前、健康對照組于知情同意后抗凝管采集外周靜脈全血5 ml，離心后儲存于－80 ℃冰箱待檢。 手術(shù)腫瘤組織標(biāo)本取出后放入RNA 固定劑中，-80 ℃冰箱保存。全血、腫瘤組織切片標(biāo)本總RNA 提取按照試劑盒說明書操作，分光光度計測定RNA 的濃度及純度，符合要求后進行反轉(zhuǎn)錄。 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件：37℃，15 min，85℃，5 s，反應(yīng)產(chǎn)物在擴增儀上擴增。定量PCR 內(nèi)參基因為human GAPDH，hsa_circ_0013958 上游引物為GTTTGCTGGCTGGGCTTTTCC，下游引物為GGG ACCTCTAATAGCTGGGGGTTC；hsa_circ_0000284上游引物為TAGACTTTGGGTCGGCCAGT、 下游引物為TGGAATACACAACTGCTTGGC。 95℃預(yù)變性5 min，95℃變性5 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，30 個循環(huán)。 根據(jù)定量PCR 所得Ct 值，按照2-△Ct計算各樣本的表達量。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 25.0 軟件包， 計量資料以（±s）表示，組間比較采用t檢驗，血液標(biāo)本與腫瘤組織標(biāo)本表達量的定量相關(guān)性分析采用Pearson 相關(guān)分析， 與分期等相關(guān)分析采用Spearman 秩相關(guān)，以ROC 曲線來評估兩種circRNA對腫瘤良惡性的診斷價值。 以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1肺腺癌與健康對照組外周血circRNA 表達量比較 肺腺癌患者血液樣本hsa_circ_0013958 表達量高于健康對照組，hsa_circ_0000284 表達量低于健康對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，表1）。

表1 兩組受檢者外周血circRNA 表達量比較（± s）

表1 兩組受檢者外周血circRNA 表達量比較（± s）

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2.2肺腺癌患者血液及組織circRNA 表達量相關(guān)性 對43 例患者肺癌組織中hsa_circ_0013958 和hsa_circ_0000284 的表達進行檢測， 與其血樣表達量進行相關(guān)性分析顯示，血液和腫瘤組織的表達量相關(guān)系數(shù)r 分別為0.823、0.785，均為高度正相關(guān)。

2.3外周血circRNA 表達與臨床、病理特征相關(guān)性外周血hsa_circ_0013958 表達與腫瘤TNM 分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)， 相關(guān)系數(shù)r 為0.031、0.328，與性別、 年齡及腫瘤最大徑無相關(guān)關(guān)系。hsa_circ_0000284 表達與腫瘤最大徑、TNM 分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈負相關(guān)，相關(guān)系數(shù)r 為-0.394、-0.362、-0.233，與性別、年齡不相關(guān)。

2.4外周血circRNA 診斷腫瘤良惡性價值 血液樣本hsa_circ_0013958 診斷肺腺癌的ROC 曲線下面積為0.812，hsa_circ_0000284 的ROC 曲線下 面積為0.756。hsa_circ_0013958 以1.417 為截斷值，診斷 敏 感 度 為 66.45% ， 特 異 度 為 96.00% 。hsa_circ_0000284 以-0.032 為截斷值， 診斷敏感度為61.49%，特異度為98.00%。

3 討論

circRNA 的發(fā)現(xiàn)豐富了人們對基因調(diào)控的認識，RNA 不僅是基因與蛋白之間的傳遞者， 也參與了基因轉(zhuǎn)錄后的調(diào)控。 circRNA 一個重要的功能就是通過內(nèi)源性競爭性RNA （competing endogenous RNA，ceRNA） 途徑發(fā)揮生物學(xué)作用， 不同蛋白的mRNA 通過競爭性結(jié)合同一種microRNA，調(diào)節(jié)相互的表達，互為ceRNA。 ceRNA 又稱microRNA 海綿，可以通過結(jié)合多個microRNA 來抑制microRNA 對靶基因的作用［10］。如miR-7 的海綿體CDR1as，能與miR-7 結(jié)合抑制miR-7 的表達而間接達到抑瘤作用［11］。 此外，circRNA 還能與RNA 結(jié)合蛋白結(jié)合參與調(diào)控細胞增殖、分化、運動、凋亡和衰老等多種生物活動［12］。

除表達量高、穩(wěn)定性強外，circRNA 通過外泌體廣泛存在于組織液、血液、痰液中，取樣簡便且無創(chuàng)， 多在200 堿基以上的長度， 也便于進行定量PCR 檢測，可突破傳統(tǒng)線性mRNA 的局限性，有望成為惡性腫瘤早期診斷的最佳分子標(biāo)志物之一［13］。在肺腺癌方面，circRNA 的研究尚在起步階段。高通量測序已經(jīng)在肺癌組織和細胞系中發(fā)現(xiàn)了大量cicrRNA， 但目前文獻報道的肺腺癌表達譜差異有很大不同，Zhao 等［14］發(fā)現(xiàn)肺腺癌組織中共有357 個circRNA 失 調(diào)， 其 中hsa_circ_0404833、0406483、0006411、0401977、0001640 差異顯著；Xiao 等［15］發(fā)現(xiàn)了148 個circRNA 顯著變化，肺腺癌組織差異表達最顯著的是hsa_circ_0007443、hsa_circ_0013093和hsa_circ_0003218。 本研究選擇了在多種腫瘤組織中存在差異表達且豐度很高的hsa_circ_0000284以及表達上調(diào)的hsa_circ_0013958， 分析其在外周血中的表達。

本研究肺腺癌患者血液中hsa_circ_0013958、0000284 表達量與組織標(biāo)本表達量呈高度正相關(guān)，說明檢測血漿中circRNA 具有同樣的意義。 進一步分析發(fā)現(xiàn)， 血液樣本hsa_circ_0013958 表達水平與患者TNM 分期和淋巴轉(zhuǎn)移均相關(guān)。 王西勇［16］報道，敲低hsa_circ_0013958 后， 裸鼠腫瘤組織免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示Ki67 的表達量明顯減少，TUNEL 實驗結(jié)果顯示細胞凋亡的比例明顯增加，證實了其具有抑制細胞凋亡的功能。 hsa_circ_0013958 促進腫瘤細胞增殖轉(zhuǎn)移、 抑制細胞凋亡機制的研究結(jié)果從另一個角度佐證了本研究中血液表達量與分期和淋巴轉(zhuǎn)移的相關(guān)性。 本研究中hsa_circ_0000284表達水平與腫瘤最大徑、TNM 分期和淋巴轉(zhuǎn)移負相關(guān)。 但是，通過查閱文獻發(fā)現(xiàn)在不同腫瘤組織中hsa_circ_0000284 表達存在差異，如劉縫春［17］報道，Circ HIPK3（hsa_circ_0000284）在前列腺癌患者全血及組織中均高表達。 其機制及生物學(xué)功能尚待更多更深層次的研究。

綜上， 肺腺癌患者外周血hsa_circ_0013958 和hsa_circ_0000284 的表達與健康者存在明顯差異，其表達水平與腫瘤細胞增殖侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)，可能成為肺腺癌的潛在生物標(biāo)記物。