齊程田，張亮，劉云國

(1.新疆大學 生命科學與技術學院，烏魯木齊 830002；2.臨沂大學 生命科學學院，山東 臨沂 276000；3.臨沂小魯生物科技有限公司，山東 臨沂 276000)

在近些年的食物中毒患者中，食源性致病微生物引發(fā)的食物中毒人數(shù)占總體的70%。因食品微生物污染比其他類型的食品污染更嚴重、致死率更高[1]，食源性致病微生物給人類帶來的生命財產(chǎn)安全損失已然成為一個全球化的公共衛(wèi)生問題。在食品生產(chǎn)加工的各個環(huán)節(jié)都有致病微生物侵染的風險,Nascimento等[2]分別以采摘后、二次加工和流入市場的花生及花生加工制品作為樣本進行跟蹤檢測。結果顯示：采后樣品中腸桿菌科(Enterobacteriaceae)數(shù)量較高；二次加工結束后，16%的樣品仍含有該菌。此外，該團隊還檢測到花生在供應鏈的不同階段會受到沙門氏菌的污染。Forero等[3]選取哥倫比亞食源性疾病通報最多和最少的學校餐廳進行抽樣,主要以餐廳的大米、即食谷物、面粉和淀粉中的蠟樣芽孢桿菌含量為檢測指標。結果表明，在學校餐廳收集到的479份樣本中9%對蠟樣芽孢桿菌呈陽性反應,糾察原因是原料處理和食品熱處理不當導致的。此外，葉丹等[4]研究發(fā)現(xiàn)致病微生物在香辛料的種植、收獲、加工、存儲過程等多個環(huán)節(jié)都會存在污染，如黑胡椒中的沙門氏菌、辣椒中的黃曲霉菌、赭曲霉菌等。因此，對于食品微生物的檢測要貫穿各個方面，對食源性致病菌的檢測與防控需要嚴格把控。

我國食品標準對于微生物指標貫穿于食品加工生產(chǎn)的各個環(huán)節(jié)，判斷食品企業(yè)在生產(chǎn)經(jīng)營上能否達到標準，食品企業(yè)或檢驗機構具有對致病微生物檢得出和檢得準一直受到各界關注[5]。質(zhì)控品作為給被測樣本賦值的標尺，是檢測數(shù)據(jù)準確性的決定因素。本文通過介紹當前質(zhì)控品在食源性致病菌檢測中的研究現(xiàn)狀、關鍵步驟和應用場景，以期加強各界對于食品質(zhì)控品的深入理解，從而提高食源性致病微生物檢測技術，為微生物檢測的精度提供參考。當前食品微生物質(zhì)控品主要包擴標準菌株、定量質(zhì)控樣品、核酸水平質(zhì)控品三大類。

1 標準菌株

GB/T 27405-2008《實驗室質(zhì)量控制規(guī)范 食品微生物檢測》[6]中規(guī)定，標準菌株是一類具有溯源性的菌株，通常由專業(yè)的菌種保藏機構或權威機構保存下發(fā)。標準菌株是微生物檢測過程的關鍵指示劑，作為內(nèi)部質(zhì)量控制的一部分，貫穿了食品微生物檢測的各個環(huán)節(jié)。因其具有良好的穩(wěn)定性和溯源性，在食源性致病微生物檢測新方法確認、實驗室新進培養(yǎng)基和試劑的測試、儀器設備功能檢測、人員及實驗室能力驗證等方面可起到內(nèi)部質(zhì)量控制作用，為保證檢測結果的準確性和提高微生物檢測技術起到了關鍵作用。

在國標4789系列中明確規(guī)定，在檢測食源性致病微生物過程中應將標準菌株作為陰性和陽性對照物。如：一些常見的食源性致病菌如金黃色葡萄球菌、天然礦泉水中糞鏈球菌等微生物的檢驗。需要同時培養(yǎng)標準菌株作為陽性對照，目的是控制相同的檢測條件和檢驗過程，得出實驗偏差，驗證檢驗結果的準確性，從而有效引導微生物報告的分析和判斷[7]。除了作為陽性對照，標準菌株在食品生產(chǎn)過程中還可以起到指示劑的作用。以嗜熱脂肪芽孢桿菌為例，該菌可以檢驗壓力滅菌裝置的滅菌效果，Elanda Fikri等[8]以嗜熱脂肪芽孢桿菌數(shù)量差異為指標，可以確定醫(yī)療廢物回收過程中氯消毒劑劑量。李雅麗等[9]研究發(fā)現(xiàn)，該菌在同等溫度、同等基質(zhì)中有穩(wěn)定的耐熱性、重現(xiàn)性好的D值，因此可作為低酸性飲料殺菌指示菌。類似的菌還有很多，例如：紫外線表面滅菌效果通常用大腸桿菌[10]、枯草芽孢桿菌作為指示菌株。在培養(yǎng)一些嚴格厭氧的菌株時，對于厭氧培養(yǎng)箱的性能要求較高。通過觀察一些嚴格厭氧的標準菌株(如生孢梭菌、黑色擬桿菌等)的生長情況，可用于驗證厭氧培養(yǎng)箱的性能。

2 質(zhì)控樣品

2.1 質(zhì)控樣品研究進展

質(zhì)控樣品是一種具有標準值和不確定度的標準樣品。當前我國對于質(zhì)控樣品的研制分為兩個方面：一種是不加入基質(zhì)的質(zhì)控樣品。該質(zhì)控樣品可以直接用于實驗室內(nèi)部質(zhì)量控制、實驗方法可行性的確認等。張彬彬等[11]所制備的阪崎腸桿菌質(zhì)控樣品在4 ℃冷藏條件下可保存28 d，且均勻性好、穩(wěn)定性高；隨著對質(zhì)控樣品研究技術的深入，薛蕾等[12]將大腸桿菌與奶粉、海藻糖等多種保護劑混合后經(jīng)冷凍干燥制備成可穩(wěn)定保存半年的質(zhì)控樣品。孫曉霞等[13]研制的單核細胞增生李斯特氏菌質(zhì)控樣品與凍干保護劑混合后凍干存活率達到77.78%，制備后210 d仍具有穩(wěn)定性。另一種質(zhì)控樣品是含有基質(zhì)的質(zhì)控樣品，根據(jù)GB/T 27405-2008《實驗室質(zhì)量控制規(guī)范 食品微生物檢測》中規(guī)定，為反映在檢測過程中的實際檢測狀況，可以通過使用自然污染產(chǎn)品或人工污染的微生物樣品來實現(xiàn)。向基質(zhì)中添加預定微生物作為當前最佳的方法，研究人員將確定濃度的菌液和冷凍干燥保護劑加入到了不同的基質(zhì)中。陳彬等[14]在奶液中添加已知濃度的阪崎腸桿菌，將混合液真空冷凍干燥后制備成基質(zhì)為凍干奶粉的定量質(zhì)控樣品。林杰等[15]以魚肉粉作為基質(zhì)，按一定的比例添加混合保護劑，同時添加一定濃度的菌液，制備成均勻性良好的定量質(zhì)控品。曹文博等[16]以凍干的綠豆粉為基質(zhì)，脫脂奶粉為凍干保護劑，將菌懸液與保護劑混勻，通過真空冷凍干燥分別制備出沙門氏菌能力驗證陽性質(zhì)控樣品與陰性質(zhì)控樣品，建立有效的沙門氏菌能力驗證質(zhì)控品。

2.2 質(zhì)控樣品的制備關鍵步驟

質(zhì)控樣品的基本制備流程為：將食源性致病菌標準菌株劃線接種于最適細菌培養(yǎng)基上，根據(jù)菌株特性培養(yǎng)相應的時間，挑取單菌落進行理化檢測確定純度。驗證純度后配制一定濃度的菌懸液，選取該菌合適的凍干保護劑與基質(zhì)，進行冷凍干燥得到成品，并對其均勻性、穩(wěn)定性[17]進行驗證。然而根據(jù)文獻得知定量質(zhì)控樣品的關鍵步驟在于冷凍干燥環(huán)節(jié)保護劑的選擇。一種好的保護劑不僅可以提高微生物的存活率，而且可以提高質(zhì)控樣品的均勻性、穩(wěn)定性。

在質(zhì)控樣品的制備過程中，菌體的存活率作為關鍵指標。冷凍干燥是最常用的物質(zhì)保存方法之一，然而，在冷凍干燥過程中會對所凍干的物質(zhì)的細胞組織結構造成損傷[18]。在此過程中，低溫保護劑可以大大減少細胞損傷，所采取的凍干保護劑的差異對不同菌株的存活率是不同的。一般情況下，較為容易保存的菌種對保護劑的要求不是很高。在冷凍干燥過程中，往往根據(jù)菌株的種類對保護劑加以選擇。

Wang等[19]探討了大分子冷凍干燥保護劑及其組合凍干保護劑維持細菌活性的可能性。單獨加入大豆多糖對乳酸菌AR113冷凍干燥后的存活率比海藻糖高19%。此外，添加大豆多糖和海藻糖復合冷凍保護劑的植物乳桿菌WCFS1凍干后存活率為90.52%，較單獨添加海藻糖和大豆多糖的存活率分別提高了31.48%和36.47%。研究表明，復合低溫保護劑是通過改善細胞膜完整性和乳酸脫氫酶活性來提高乳酸菌的存活率。Chen等[20]采用響應面法(RSM)和中心組合設計(CCD)優(yōu)化了雙歧桿菌BB01的凍干保護劑。該研究對雙歧桿菌BB01在不同保護劑條件下的凍干存活率和凍干粉單位重量活菌數(shù)進行了研究。優(yōu)化后的冷凍保護劑為:甘氨酸5.5%，碳酸氫鈉0.8%，低聚木糖7%，精氨酸4.5%，脫脂牛奶25%。存活率與預測值(88.58%)接近。研究表明，RSM可以成功地優(yōu)化雙歧桿菌凍干粉的復合冷凍保護劑，原因是保護劑對益生菌細胞起到了保護作用。陳勝杰等[21]采用真空冷凍干燥法，分別以植物乳桿菌SC1、凝結芽孢桿菌XP2、釀酒酵母菌SA1為實驗菌株，研究凍干保護劑脫脂乳粉、低聚木糖、可溶性淀粉和VC鈉鹽對3種益生菌凍干存活率的影響，確定添加最優(yōu)保護劑組合，3株菌的凍干存活率分別為83.2%、83.7%和86.7%，活菌數(shù)均高于1.0×108CFU/g，具有較好的應用價值。

2.3 質(zhì)控樣品的應用

當前質(zhì)控樣品應用于多種場景：如實驗室和科研院所的培養(yǎng)基和試劑的驗收、實驗室檢測能力認證、檢測方法確認與驗證、檢測過程中的陽對照、陰對照、新員工培訓考核和能力評價等，因以標準菌株為制備質(zhì)控樣品的原料，檢測結果具有可追溯性。制備質(zhì)控樣品是將已知量的待測食源性致病微生物加入到各種生物介質(zhì)中配制而成，通過多種檢驗定值，因而具有可溯源性[22]?！稒z測和校準實驗室能力認可準則在微生物檢測領域的應用說明》中規(guī)定，對于微生物定量檢測項目，應該定期使用有證標準物質(zhì)或標準樣品(如菌落總數(shù)標準物質(zhì)等)進行監(jiān)控，或使用質(zhì)控樣品開展內(nèi)部質(zhì)量控制活動，因此質(zhì)控樣品對于微生物檢測意義重大。

3 分子水平質(zhì)控品

3.1 分子水平質(zhì)控品的研究進展

分子水平質(zhì)控品包含很多種[23]，如基因組DNA、含目標基因DNA片段的質(zhì)粒、RNA全病毒。在食品分子水平檢測過程中，含有目標基因DNA片段的質(zhì)粒應用范圍廣、適用場景多。快速識別和診斷食源性致病菌對食品工業(yè)的發(fā)展以及食品安全具有很大的意義。但當前食源性致病菌的檢驗大多數(shù)為傳統(tǒng)檢測，耗時較長、檢測限低、操作復雜，不能快速鑒別致病菌。當暴發(fā)食物中毒事件時，若不能準確、快速確定病原菌，必然會造成無法估量的損失。

質(zhì)粒 DNA質(zhì)控品是一種被導入食源性致病微生物特異性片段的質(zhì)粒，在PCR定性檢測中可作為陽性參考物質(zhì)，在 PCR 定量分析中又可作為標準物，可構建出定量分析的標準曲線。當前，質(zhì)粒 DNA質(zhì)控品作為基因檢測的標準物質(zhì)受到了廣泛關注，這是因為聚合酶鏈式反應(PCR)等核酸檢測技術的應用在一定程度上規(guī)避了傳統(tǒng)檢測方法的弊端[24]。通過構建含有致病菌毒力基因的重組質(zhì)粒，從而快速檢測食源性致病菌。許麗等[25]利用了阪崎腸桿菌PCR檢測的特異性片段(MMS、ITS、16S rDNA、ompA)，其研制的質(zhì)粒DNA標準物質(zhì)可以替代基因組DNA 對阪崎腸桿菌進行檢測,大大提高了檢測效率和準確性。Vallejo等[26]制備了兩種DNA濃度，并根據(jù)PCR反應和腸炎沙門氏菌基因靶標invA、ttr和hilA進行的表達、測定均勻性和穩(wěn)定性研究的結果作為其不確定度的參考值，該質(zhì)控品可在4 ℃下穩(wěn)定保存9個月。夏丹丹等[27]以大腸桿菌的毒力基因escV、stx2和hlyA為靶標序列構建DNA質(zhì)粒質(zhì)控品，通過菌落PCR和序列測定對所構建的重組質(zhì)粒進行驗證，證明了質(zhì)控樣品可用于快速檢測食物中的大腸桿菌。隨著分子生物學技術的發(fā)展，定量聚合酶鏈反應[28](qPCR)方法現(xiàn)在廣泛用于RNA和DNA目標序列拷貝的絕對定量，廣泛應用于各種檢測場景。獲得這些定量目標序列拷貝估計數(shù)的最常見方法之一是使用核酸標準物質(zhì)(如DNA標準品)的qPCR周期閾值(Ct)測量生成的標準曲線。Mano等[29]對糞便指示菌(FIB)快速qPCR方法進行了研究，并開發(fā)了標準參考物質(zhì)，以便將分析結果與EPA水質(zhì)標準值進行比較，同時促進了實驗室內(nèi)部和實驗室之間的比較。努色熱提·阿布都沙拉木等[30]將沙門氏菌檢測和分型常用的se、st、aceA等作為目標序列，將其DNA片段克隆到PUC57質(zhì)粒中，構建pDNA沙門氏菌質(zhì)粒對照物質(zhì)，并對該質(zhì)粒質(zhì)控品進行了定量檢測，以及對其穩(wěn)定性和均勻性進行了評價，實現(xiàn)了利用實時定量PCR技術檢驗沙門氏菌從而代替基因組DNA的檢測。該質(zhì)粒質(zhì)控品具有序列準確和可追溯等特點，該研究證明了快速合成的質(zhì)?？梢宰鳛殍b定傷寒沙門氏菌 qPCR 質(zhì)控品。

3.2 分子水平質(zhì)控品的制備關鍵步驟

提取食源性微生物標準菌株的全基因組DNA，以此作為模板用合成的引物(內(nèi)含特異性基因片段或毒力基因)進行擴增，擴增后將目的片段進行回收；將回收的各個基因片段克隆至載體上，以此構建出含有基因的重組質(zhì)粒；應用PCR和測序?qū)χ亟M質(zhì)粒進行驗證，將轉化成功的重組質(zhì)粒進行質(zhì)粒提取并保存，將提取的質(zhì)粒制成凍干粉，即初步得到用于檢測的食源性菌的DNA質(zhì)控品。對含有毒力基因的質(zhì)粒標準物質(zhì)的純度、濃度以及準確性進行檢驗，并按照《ISO導則35標準樣品定值的一般原則和統(tǒng)計方法》的要求檢測DNA質(zhì)控品的均勻性、穩(wěn)定性(短期穩(wěn)定性、長期穩(wěn)定性)以及與多家實驗室合作對其進行定值。定值后通過均勻性、穩(wěn)定性等性質(zhì)確定質(zhì)控品的不確定度。

在分子水平質(zhì)控品的制備過程中，確定食源性致病菌的特異性基因片段或毒力基因是技術的關鍵。這是因為一些基因雖然具有特異性，但不適合作為質(zhì)粒標準物質(zhì)的基因。以食品中的腸出血性大腸桿菌(EHEC)為例，檢測該細菌的方法一直具有挑戰(zhàn)性。以往對腸出血性大腸桿菌以主要毒力基因stx1、stx2、eae和o血清群特異性基因進行PCR檢測，但不能特異性地鑒定出腸出血性大腸桿菌株。Delannoy等[31]從OI-57基因組中鑒定出兩個基因(Z2098和Z2099)，該基因與腸出血性大腸桿菌及其stx陰性衍生株密切相關(Z2098相關率為87%，Z2099相關率為91%)。因此Z2098和Z2099是更有針對性地診斷典型腸出血性大腸桿菌和新型腸出血性大腸桿菌的有效基因標記物。又如志賀氏菌，以往用來快速檢測志賀氏菌的基因一般為ipaH基因、ial基因、vir基因等，由于后兩種基因的毒力質(zhì)粒較大，在傳代過程中穩(wěn)定性不佳。李金磊等[32]發(fā)現(xiàn)ipaH基因同時多拷貝存在于染色體和侵襲性大質(zhì)粒上，能夠在遺傳中保持穩(wěn)定性，不會因傳代而缺失。因此，在制備志賀氏菌DNA質(zhì)控品時應首選ipaH基因。

3.3 分子水平質(zhì)控品的應用

在分子生物學檢驗過程中，質(zhì)粒 DNA 標準物質(zhì)，即含有待檢測目的基因特異性片段的重組質(zhì)粒分子，常用來作為陽性對照物和質(zhì)控物，現(xiàn)已被普遍使用。在食源性致病微生物分子生物學檢測及鑒定方面，例如，ISO相關標準中，利用PCR快速檢測技術以及食品微生物免疫學檢測方法來實現(xiàn)致病微生物的確認，其原理是通過利用目標微生物的反應結果來對檢驗方法的適用性進行評估。同時，在分子生物學檢驗活動中，把含有目標生物的DNA 片段作為陽性質(zhì)控樣品，來進行監(jiān)控整個實驗流程中的各個操作環(huán)節(jié)。如核酸提取、PCR體系配置、基因擴增等環(huán)節(jié)，可通過該方法監(jiān)控以及驗證其是否存在誤差與污染，實驗方案是否具有可行性等作用，進而實現(xiàn)食品檢測過程中的高準確性。

4 總結

與其他類型的食品檢驗相比，微生物體積微小、繁殖速度快，使得食品微生物檢驗更具難度，而食品質(zhì)控品在微生物檢測工作中保障檢驗結果精確性的同時，可以提升我國食品衛(wèi)生檢測水平。但當前對于質(zhì)控樣品的研發(fā)僅僅停留在一些生活中常見的食源性致病微生物，而且各個實驗室對于同種微生物質(zhì)控品重復開發(fā)，導致食品微生物質(zhì)控樣品的研制仍存在大量空白。

當前的分子水平質(zhì)控品仍不能滿足市場的實際需求，應加強對一些有潛在暴發(fā)性的食源性致病微生物質(zhì)控品的研制，應對突如其來的食源性致病微生物導致的疾病，對其進行檢測。核酸質(zhì)控樣品具有多種優(yōu)點，如在制備方面，以微生物為載體進行傳代培養(yǎng)并無限獲得，方便提取，節(jié)省資源；在儲存方面，其可在冷凍條件下長期儲藏，提高了微生物檢測結果的準確性，在經(jīng)濟價值方面，同一個質(zhì)?？稍O計并插入多個外源基因，節(jié)省成本。

需要注意的是，對于標準菌株、質(zhì)控樣品等的使用以及制備過程應當提前了解好微生物的特性，保證其處于最佳生長狀態(tài)。在使用過程中應詳細閱讀操作說明，用后應按照規(guī)范進行徹底銷毀，避免造成環(huán)境污染。