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S100A6對人肺癌細(xì)胞株Calu-6分化的影響研究

2022-08-31 06:39:26王婷牛蔓張奕
實(shí)用心腦肺血管病雜志 2022年9期
關(guān)鍵詞:細(xì)胞株鱗癌空白對照

王婷,牛蔓,張奕

在世界范圍內(nèi),肺癌是病死率最高的腫瘤。2020年全球癌癥數(shù)據(jù)顯示,肺癌在全球185個(gè)國家共造成180萬死亡病例,位居36種癌癥之首[1]。按照病理類型,肺癌可分為小細(xì)胞肺癌(small cell lung cancer,SCLC)和非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC),NSCLC又進(jìn)一步分為腺癌(38.5%)、鱗癌(30.0%)、大細(xì)胞癌(2.9%)及其他[2]。因大多數(shù)肺癌患者就診時(shí)處于疾病的中晚期,故含鉑雙藥化療成為治療肺癌的主要手段。然而,即使接受標(biāo)準(zhǔn)化療方案,中晚期肺癌患者預(yù)后仍較差,其中SCLC患者平均總生存期不足1年[3]。近些年,因突變位點(diǎn)被發(fā)現(xiàn),部分肺腺癌患者預(yù)后得到極大改善,靶向藥物也逐步在早期有位點(diǎn)突變肺癌患者的術(shù)后輔助治療及晚期有位點(diǎn)突變肺癌患者一線治療中被廣泛使用[4]。積極探索肺癌發(fā)生及發(fā)展的分子機(jī)制也成為眾多科研工作者的首要任務(wù)。

S100蛋白為小分子鈣結(jié)合蛋白,家族中共包含25個(gè)成員,其中至少有16個(gè)成員基因位于易發(fā)生重排的1號(hào)染色體長臂2區(qū)1帶(1q21)[5]。S100A6作為該家族中的重要一員,被證實(shí)與包括肺癌在內(nèi)的多種腫瘤生物學(xué)功能相關(guān)[6]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn),S100A6可抑制肺癌細(xì)胞株Calu-6增殖、侵襲和遷移,在裸鼠肺癌模型中可促進(jìn)細(xì)胞凋亡,在細(xì)胞水平上有抑癌作用[7]。本研究進(jìn)一步證實(shí)S100A6可抑制腫瘤的增殖,同時(shí)比較常見NSCLC標(biāo)志物表達(dá)的差異,探討S100A6對人肺癌細(xì)胞株Calu-6分化的影響,現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)時(shí)間 本實(shí)驗(yàn)時(shí)間為2021年6月至2022年2月。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 8~10周齡BALB/c裸鼠15只,購于武漢優(yōu)爾生生命科學(xué)裝備有限公司。飼養(yǎng)條件為:室溫26~28 ℃,相對濕度50%左右,保持通風(fēng),適當(dāng)光照,所供飼料經(jīng)滅菌處理。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞 肺癌細(xì)胞株Calu-6(人肺退行性肺癌可傳代細(xì)胞系,未分化)購于中國科學(xué)院,293T細(xì)胞(人胚腎細(xì)胞)購于武漢優(yōu)爾生生命科學(xué)裝備有限公司,保存于CO2培養(yǎng)箱,2 h后開始實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器 DMEM培養(yǎng)基(賽默飛世爾科技有限公司,貨號(hào):121000061),MTT檢測試劑盒(北京索萊寶科技有限公司,貨號(hào):M1020),細(xì)胞周期檢測試劑盒(北京索萊寶科技有限公司,貨號(hào):CA1510),細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(北京索萊寶科技有限公司,貨號(hào):CA1040),T25細(xì)胞培養(yǎng)板(廣州碩譜生物科技有限公司,貨號(hào):T25-011-050),6孔細(xì)胞培養(yǎng)板(廣州碩譜生物科技有限公司,貨號(hào):T25-010-006),CO2培養(yǎng)箱(賽默飛世爾科技有限公司),CX33顯微鏡〔奧林巴斯(中國)有限公司〕。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)及pLVX-AcGFP1-N1-S100A6的構(gòu)建 將肺癌細(xì)胞株Calu-6保存于37 ℃、5% CO2條件下,于高糖DMEM培養(yǎng)基(含15%熱滅活胎牛血清、100 U/ml鏈霉素、100 U/ml青霉素)中培養(yǎng)擴(kuò)增。2周后,采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)制備PLVX-AcGFP1-N1-S100A6,引物信息為:正向引物5'-CCCAAGCTTA CCATGGCATGCCCCCTGGTCA-3',反向引物5'-C GGAATTCCGGTCAGCCCTTGAGGGCTTCATT-3'。PCR的具體步驟和條件為:孵育(95 ℃、5 min)、變性(94 ℃、30 s,共44周)、退火(55 ℃、30 s)、延伸(72 ℃、30 s)。

1.3.2 病毒載體構(gòu)建 以2∶1∶1的比例將pLVXAcGFP1-N1-S100A6、pMD2.G和psPAX2共同轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,構(gòu)建S100A6過表達(dá)慢病毒;以2∶1∶1的比例將pLVX-AcGFP1-N1、pMD2.G和psPAX2共同轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,構(gòu)建空載體慢病毒。

1.4 動(dòng)物模型制備 BALB/c裸鼠采用簡單隨機(jī)法分為S100A6實(shí)驗(yàn)組7只、空載體組4只、空白對照組4只,將S100A6過表達(dá)慢病毒、空載體慢病毒及空細(xì)胞分別注射到S100A6實(shí)驗(yàn)組、空載體組、空白對照組BALB/c裸鼠右前背部。第2周開始每周測量BALB/c裸鼠的腫瘤體積,5周后處死裸鼠,取出腫瘤組織。

1.5 免疫組化印記法檢測經(jīng)典NSCLC標(biāo)志物 采用免疫組化印記法檢測5個(gè)經(jīng)典NSCLC標(biāo)志物在腫瘤組織中的表達(dá)情況,包括腺癌標(biāo)志物〔甲狀腺轉(zhuǎn)移因子(thyroid transcription factor,TTF)-1、天冬氨酸蛋白酶A(NapsinA)〕及鱗癌標(biāo)志物(P40、CK5/6、P63)。具體過程:使用3%過氧化氫去除腫瘤組織內(nèi)源性過氧化物酶活性,后使用標(biāo)志物一抗(TTF-1兔單抗,Abcam ab76013;NapsinA兔單抗,Abcam ab248340;P40兔單抗,Abcam ab76158;CK5/6鼠單抗,Abcam ab17133;P63兔單抗,Abcam ab124762)孵育,250倍稀釋,4 ℃過夜。加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(室溫,30 min)后使用二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine,DAB)處理、蘇木素染色。使用200倍顯微鏡隨機(jī)選擇10個(gè)視野觀察上述標(biāo)志物表達(dá)情況。表達(dá)程度評分標(biāo)準(zhǔn)為:25%細(xì)胞表達(dá)陽性為1分,26%~50%細(xì)胞表達(dá)陽性為2分,51%~75%細(xì)胞表達(dá)陽性為3分,>75%細(xì)胞表達(dá)陽性為4分。強(qiáng)度評分標(biāo)準(zhǔn)為:無染色為0分,弱染色為1分,中等程度染色為2分,強(qiáng)染色為3分。表達(dá)程度評分加強(qiáng)度評分為最終評分結(jié)果,根據(jù)最終評分結(jié)果,判定<4分為陰性,≥4分為陽性。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 26.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以(±s)表示,多組間比較采用單因素方差分析,組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腫瘤體積 第2、3、4、5周三組裸鼠腫瘤體積比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);其中S100A6實(shí)驗(yàn)組裸鼠腫瘤體積小于空載體組和空白對照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見表1。

表1 三組裸鼠腫瘤體積比較(±s,mm3)Table 1 Comparison of tumor volume in three groups of nude mice

表1 三組裸鼠腫瘤體積比較(±s,mm3)Table 1 Comparison of tumor volume in three groups of nude mice

注:a表示與空白對照組比較,P<0.05;b表示與空載體組比較,P<0.05

組別 只數(shù) 第2周 第3周 第4周 第5周空白對照組 4 13.1±4.4 31.7±3.9 153.8±16.9 332.5±53.0空載體組 4 12.4±0.8 32.9±1.9 147.4±17.5 318.2±53.3 S100A6實(shí)驗(yàn)組 7 1.4±1.4ab 7.0±3.5ab 54.2±8.6ab 107.4±14.2ab F值 9.12 19.55 20.52 14.01 P值 <0.01 <0.01 <0.01 <0.01

2.2 經(jīng)典NSCLC標(biāo)志物 三組腫瘤組織中TTF-1、NapsinA、P40、CK5/6均表達(dá)陽性,S100A6實(shí)驗(yàn)組、空載體組、空白對照組腫瘤組織中P63表達(dá)陽性率分別為7/7、3/4、3/4,見圖1。

圖1 經(jīng)典NSCLC標(biāo)志物在三組腫瘤組織中的表達(dá)(蘇木素染色,×200)Figure 1 Expression of classic NSCLC markers in three groups of tumor tissues

3 討論

本課題組前期研究成功構(gòu)建了S100A6過表達(dá)肺癌細(xì)胞株Calu-6系,通過比較Calu-6、Calu-6/neo、Calu-6/S100A6細(xì)胞生物學(xué)行為證實(shí),S100A6可抑制肺癌細(xì)胞株Calu-6增殖、侵襲和遷移,將細(xì)胞注射裸鼠體內(nèi)后,S100A6實(shí)驗(yàn)組裸鼠腫瘤體積明顯小于其他兩組[7]。本研究在前期研究的基礎(chǔ)上,采用免疫組化印跡法進(jìn)一步分析三組腫瘤組織中經(jīng)典NSCLC標(biāo)志物的表達(dá)。免疫組化印跡法是惡性腫瘤病理診斷極其重要的輔助手段,其中輔助診斷肺癌的標(biāo)志物已被納入中國臨床腫瘤學(xué)會(huì)肺癌診療指南[8]。常用的腺癌標(biāo)志物包括TTF-1、NapsinA,鱗癌標(biāo)志物包括P40、CK5/6和P63,而SCLC標(biāo)志物包括CD56、Syn、CgA、TTF-1、CK、Ki-67。本研究納入指南推薦的NSCLC標(biāo)志物[9],證實(shí)三組腫瘤組織中TTF-1、NapsinA、P40、CK5/6均表達(dá)陽性,S100A6實(shí)驗(yàn)組、空載體組、空白對照組腫瘤組織中P63表達(dá)陽性率分別為7/7、3/4、3/4,提示S100A6對未分化型肺癌細(xì)胞株Calu-6的分化方向(向鱗癌或腺癌方向)可能無明顯影響。

S100蛋白家族與包括肺癌在內(nèi)多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。S100A2被證實(shí)在進(jìn)展期NSCLC患者的血清、組織中表達(dá)升高,其有促進(jìn)腫瘤生長的功能[10]。S100A4高表達(dá)與NSCLC細(xì)胞株的低分化和病程進(jìn)展有關(guān)[11]。作為S100蛋白家族中的一個(gè)重要成員,S100A6(Calcylin蛋白)第一個(gè)被證實(shí)與腫瘤細(xì)胞的分化程度有關(guān),同時(shí),該蛋白還被證實(shí)與腫瘤細(xì)胞侵襲和遷移能力有關(guān)[12]。研究發(fā)現(xiàn),S100A6與骨肉瘤和結(jié)腸癌腫瘤高侵襲性相關(guān)[12]。在急性白血病和肝癌中,S100A6也呈高表達(dá)[13]。在NSCLC細(xì)胞系A(chǔ)549、NSCLC患者血漿及胸腔積液中,S100A6表達(dá)升高[14]。研究顯示,S100A6可能在不同病理類型肺癌中存在差異表達(dá):與純細(xì)支氣管肺泡癌組織(bronchioloalveolar carcinoma,BAC)相比,其他類型肺腺癌+BAC混合組織中S100A6表達(dá)升高[15]。ISHII等[16]使用免疫組化法分析了92例肺腺癌患者腫瘤組織中S100A6表達(dá)情況,結(jié)果證實(shí)與癌旁組織相比,S100A6在所有腺癌組織中表達(dá)升高,而這種表達(dá)升高趨勢在含有BAC成分的肺腺癌組織中更明顯。另一項(xiàng)關(guān)于S100A6在177例肺鱗癌患者組織中表達(dá)情況的分析發(fā)現(xiàn),S100A6在肺鱗癌組織中存在差異表達(dá),即在部分肺鱗癌組織中存在高表達(dá),而在部分肺鱗癌組織中無高表達(dá),且S100A6表達(dá)升高提示患者預(yù)后不佳[17]。本研究結(jié)果提示,S100A6可起到抑癌作用,而此結(jié)論與先前學(xué)者在A549中的結(jié)論相反[18]。推測S100A6矛盾研究結(jié)論的出現(xiàn)與研究選擇的細(xì)胞株不同有關(guān),即本研究選用的是未分化人肺癌細(xì)胞株,而后者選用的是腺癌細(xì)胞株。目前,尚未見S100A6對肺癌細(xì)胞株分化方向影響的研究報(bào)道,在骨肉瘤中,過表達(dá)S100A6被證實(shí)可抑制間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞方向分化,從而促進(jìn)腫瘤發(fā)生[19]。

綜上所述,S100A6可抑制人肺癌細(xì)胞株Calu-6增殖,但對未分化型肺癌細(xì)胞株的分化可能無明顯影響。雖然本研究未出現(xiàn)陽性數(shù)據(jù),但本研究首次探討了S100A6對肺癌細(xì)胞株分化的影響,仍期待后續(xù)研究納入多種細(xì)胞株進(jìn)一步探索S100A6對肺癌細(xì)胞株分化方向的影響。

作者貢獻(xiàn):王婷進(jìn)行文章的構(gòu)思與設(shè)計(jì),論文撰寫;牛蔓進(jìn)行研究的實(shí)施與可行性分析,資料收集、整理;張奕進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理、論文的修訂,負(fù)責(zé)文章的質(zhì)量控制及審校,對文章整體負(fù)責(zé)、監(jiān)督管理。

本文無利益沖突。

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