王婷，牛蔓，張奕

在世界范圍內(nèi)，肺癌是病死率最高的腫瘤。2020年全球癌癥數(shù)據(jù)顯示，肺癌在全球185個(gè)國家共造成180萬死亡病例，位居36種癌癥之首［1］。按照病理類型，肺癌可分為小細(xì)胞肺癌（small cell lung cancer，SCLC）和非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC），NSCLC又進(jìn)一步分為腺癌（38.5%）、鱗癌（30.0%）、大細(xì)胞癌（2.9%）及其他［2］。因大多數(shù)肺癌患者就診時(shí)處于疾病的中晚期，故含鉑雙藥化療成為治療肺癌的主要手段。然而，即使接受標(biāo)準(zhǔn)化療方案，中晚期肺癌患者預(yù)后仍較差，其中SCLC患者平均總生存期不足1年［3］。近些年，因突變位點(diǎn)被發(fā)現(xiàn)，部分肺腺癌患者預(yù)后得到極大改善，靶向藥物也逐步在早期有位點(diǎn)突變肺癌患者的術(shù)后輔助治療及晚期有位點(diǎn)突變肺癌患者一線治療中被廣泛使用［4］。積極探索肺癌發(fā)生及發(fā)展的分子機(jī)制也成為眾多科研工作者的首要任務(wù)。

S100蛋白為小分子鈣結(jié)合蛋白，家族中共包含25個(gè)成員，其中至少有16個(gè)成員基因位于易發(fā)生重排的1號(hào)染色體長臂2區(qū)1帶（1q21）［5］。S100A6作為該家族中的重要一員，被證實(shí)與包括肺癌在內(nèi)的多種腫瘤生物學(xué)功能相關(guān)［6］。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，S100A6可抑制肺癌細(xì)胞株Calu-6增殖、侵襲和遷移，在裸鼠肺癌模型中可促進(jìn)細(xì)胞凋亡，在細(xì)胞水平上有抑癌作用［7］。本研究進(jìn)一步證實(shí)S100A6可抑制腫瘤的增殖，同時(shí)比較常見NSCLC標(biāo)志物表達(dá)的差異，探討S100A6對人肺癌細(xì)胞株Calu-6分化的影響，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)時(shí)間 本實(shí)驗(yàn)時(shí)間為2021年6月至2022年2月。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 8～10周齡BALB/c裸鼠15只，購于武漢優(yōu)爾生生命科學(xué)裝備有限公司。飼養(yǎng)條件為：室溫26～28 ℃，相對濕度50%左右，保持通風(fēng)，適當(dāng)光照，所供飼料經(jīng)滅菌處理。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞 肺癌細(xì)胞株Calu-6（人肺退行性肺癌可傳代細(xì)胞系，未分化）購于中國科學(xué)院，293T細(xì)胞（人胚腎細(xì)胞）購于武漢優(yōu)爾生生命科學(xué)裝備有限公司，保存于CO2培養(yǎng)箱，2 h后開始實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器 DMEM培養(yǎng)基（賽默飛世爾科技有限公司，貨號(hào)：121000061），MTT檢測試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，貨號(hào)：M1020），細(xì)胞周期檢測試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，貨號(hào)：CA1510），細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，貨號(hào)：CA1040），T25細(xì)胞培養(yǎng)板（廣州碩譜生物科技有限公司，貨號(hào)：T25-011-050），6孔細(xì)胞培養(yǎng)板（廣州碩譜生物科技有限公司，貨號(hào)：T25-010-006），CO2培養(yǎng)箱（賽默飛世爾科技有限公司），CX33顯微鏡〔奧林巴斯（中國）有限公司〕。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)及pLVX-AcGFP1-N1-S100A6的構(gòu)建 將肺癌細(xì)胞株Calu-6保存于37 ℃、5% CO2條件下，于高糖DMEM培養(yǎng)基（含15%熱滅活胎牛血清、100 U/ml鏈霉素、100 U/ml青霉素）中培養(yǎng)擴(kuò)增。2周后，采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）制備PLVX-AcGFP1-N1-S100A6，引物信息為：正向引物5'-CCCAAGCTTA CCATGGCATGCCCCCTGGTCA-3'，反向引物5'-C GGAATTCCGGTCAGCCCTTGAGGGCTTCATT-3'。PCR的具體步驟和條件為：孵育（95 ℃、5 min）、變性（94 ℃、30 s，共44周）、退火（55 ℃、30 s）、延伸（72 ℃、30 s）。

1.3.2 病毒載體構(gòu)建 以2∶1∶1的比例將pLVXAcGFP1-N1-S100A6、pMD2.G和psPAX2共同轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，構(gòu)建S100A6過表達(dá)慢病毒；以2∶1∶1的比例將pLVX-AcGFP1-N1、pMD2.G和psPAX2共同轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，構(gòu)建空載體慢病毒。

1.4 動(dòng)物模型制備 BALB/c裸鼠采用簡單隨機(jī)法分為S100A6實(shí)驗(yàn)組7只、空載體組4只、空白對照組4只，將S100A6過表達(dá)慢病毒、空載體慢病毒及空細(xì)胞分別注射到S100A6實(shí)驗(yàn)組、空載體組、空白對照組BALB/c裸鼠右前背部。第2周開始每周測量BALB/c裸鼠的腫瘤體積，5周后處死裸鼠，取出腫瘤組織。

1.5 免疫組化印記法檢測經(jīng)典NSCLC標(biāo)志物 采用免疫組化印記法檢測5個(gè)經(jīng)典NSCLC標(biāo)志物在腫瘤組織中的表達(dá)情況，包括腺癌標(biāo)志物〔甲狀腺轉(zhuǎn)移因子（thyroid transcription factor，TTF）-1、天冬氨酸蛋白酶A（NapsinA）〕及鱗癌標(biāo)志物（P40、CK5/6、P63）。具體過程：使用3%過氧化氫去除腫瘤組織內(nèi)源性過氧化物酶活性，后使用標(biāo)志物一抗（TTF-1兔單抗，Abcam ab76013；NapsinA兔單抗，Abcam ab248340；P40兔單抗，Abcam ab76158；CK5/6鼠單抗，Abcam ab17133；P63兔單抗，Abcam ab124762）孵育，250倍稀釋，4 ℃過夜。加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗（室溫，30 min）后使用二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）處理、蘇木素染色。使用200倍顯微鏡隨機(jī)選擇10個(gè)視野觀察上述標(biāo)志物表達(dá)情況。表達(dá)程度評分標(biāo)準(zhǔn)為：25%細(xì)胞表達(dá)陽性為1分，26%～50%細(xì)胞表達(dá)陽性為2分，51%～75%細(xì)胞表達(dá)陽性為3分，＞75%細(xì)胞表達(dá)陽性為4分。強(qiáng)度評分標(biāo)準(zhǔn)為：無染色為0分，弱染色為1分，中等程度染色為2分，強(qiáng)染色為3分。表達(dá)程度評分加強(qiáng)度評分為最終評分結(jié)果，根據(jù)最終評分結(jié)果，判定＜4分為陰性，≥4分為陽性。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 26.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腫瘤體積 第2、3、4、5周三組裸鼠腫瘤體積比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；其中S100A6實(shí)驗(yàn)組裸鼠腫瘤體積小于空載體組和空白對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

表1 三組裸鼠腫瘤體積比較（±s，mm3）Table 1 Comparison of tumor volume in three groups of nude mice

表1 三組裸鼠腫瘤體積比較（±s，mm3）Table 1 Comparison of tumor volume in three groups of nude mice

注：a表示與空白對照組比較，P＜0.05；b表示與空載體組比較，P＜0.05

組別 只數(shù) 第2周 第3周 第4周 第5周空白對照組 4 13.1±4.4 31.7±3.9 153.8±16.9 332.5±53.0空載體組 4 12.4±0.8 32.9±1.9 147.4±17.5 318.2±53.3 S100A6實(shí)驗(yàn)組 7 1.4±1.4ab 7.0±3.5ab 54.2±8.6ab 107.4±14.2ab F值 9.12 19.55 20.52 14.01 P值 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01

2.2 經(jīng)典NSCLC標(biāo)志物 三組腫瘤組織中TTF-1、NapsinA、P40、CK5/6均表達(dá)陽性，S100A6實(shí)驗(yàn)組、空載體組、空白對照組腫瘤組織中P63表達(dá)陽性率分別為7/7、3/4、3/4，見圖1。

圖1 經(jīng)典NSCLC標(biāo)志物在三組腫瘤組織中的表達(dá)（蘇木素染色，×200）Figure 1 Expression of classic NSCLC markers in three groups of tumor tissues

3 討論

本課題組前期研究成功構(gòu)建了S100A6過表達(dá)肺癌細(xì)胞株Calu-6系，通過比較Calu-6、Calu-6/neo、Calu-6/S100A6細(xì)胞生物學(xué)行為證實(shí)，S100A6可抑制肺癌細(xì)胞株Calu-6增殖、侵襲和遷移，將細(xì)胞注射裸鼠體內(nèi)后，S100A6實(shí)驗(yàn)組裸鼠腫瘤體積明顯小于其他兩組［7］。本研究在前期研究的基礎(chǔ)上，采用免疫組化印跡法進(jìn)一步分析三組腫瘤組織中經(jīng)典NSCLC標(biāo)志物的表達(dá)。免疫組化印跡法是惡性腫瘤病理診斷極其重要的輔助手段，其中輔助診斷肺癌的標(biāo)志物已被納入中國臨床腫瘤學(xué)會(huì)肺癌診療指南［8］。常用的腺癌標(biāo)志物包括TTF-1、NapsinA，鱗癌標(biāo)志物包括P40、CK5/6和P63，而SCLC標(biāo)志物包括CD56、Syn、CgA、TTF-1、CK、Ki-67。本研究納入指南推薦的NSCLC標(biāo)志物［9］，證實(shí)三組腫瘤組織中TTF-1、NapsinA、P40、CK5/6均表達(dá)陽性，S100A6實(shí)驗(yàn)組、空載體組、空白對照組腫瘤組織中P63表達(dá)陽性率分別為7/7、3/4、3/4，提示S100A6對未分化型肺癌細(xì)胞株Calu-6的分化方向（向鱗癌或腺癌方向）可能無明顯影響。

S100蛋白家族與包括肺癌在內(nèi)多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。S100A2被證實(shí)在進(jìn)展期NSCLC患者的血清、組織中表達(dá)升高，其有促進(jìn)腫瘤生長的功能［10］。S100A4高表達(dá)與NSCLC細(xì)胞株的低分化和病程進(jìn)展有關(guān)［11］。作為S100蛋白家族中的一個(gè)重要成員，S100A6（Calcylin蛋白）第一個(gè)被證實(shí)與腫瘤細(xì)胞的分化程度有關(guān)，同時(shí)，該蛋白還被證實(shí)與腫瘤細(xì)胞侵襲和遷移能力有關(guān)［12］。研究發(fā)現(xiàn)，S100A6與骨肉瘤和結(jié)腸癌腫瘤高侵襲性相關(guān)［12］。在急性白血病和肝癌中，S100A6也呈高表達(dá)［13］。在NSCLC細(xì)胞系A(chǔ)549、NSCLC患者血漿及胸腔積液中，S100A6表達(dá)升高［14］。研究顯示，S100A6可能在不同病理類型肺癌中存在差異表達(dá)：與純細(xì)支氣管肺泡癌組織（bronchioloalveolar carcinoma，BAC）相比，其他類型肺腺癌+BAC混合組織中S100A6表達(dá)升高［15］。ISHII等［16］使用免疫組化法分析了92例肺腺癌患者腫瘤組織中S100A6表達(dá)情況，結(jié)果證實(shí)與癌旁組織相比，S100A6在所有腺癌組織中表達(dá)升高，而這種表達(dá)升高趨勢在含有BAC成分的肺腺癌組織中更明顯。另一項(xiàng)關(guān)于S100A6在177例肺鱗癌患者組織中表達(dá)情況的分析發(fā)現(xiàn)，S100A6在肺鱗癌組織中存在差異表達(dá)，即在部分肺鱗癌組織中存在高表達(dá)，而在部分肺鱗癌組織中無高表達(dá)，且S100A6表達(dá)升高提示患者預(yù)后不佳［17］。本研究結(jié)果提示，S100A6可起到抑癌作用，而此結(jié)論與先前學(xué)者在A549中的結(jié)論相反［18］。推測S100A6矛盾研究結(jié)論的出現(xiàn)與研究選擇的細(xì)胞株不同有關(guān)，即本研究選用的是未分化人肺癌細(xì)胞株，而后者選用的是腺癌細(xì)胞株。目前，尚未見S100A6對肺癌細(xì)胞株分化方向影響的研究報(bào)道，在骨肉瘤中，過表達(dá)S100A6被證實(shí)可抑制間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞方向分化，從而促進(jìn)腫瘤發(fā)生［19］。

綜上所述，S100A6可抑制人肺癌細(xì)胞株Calu-6增殖，但對未分化型肺癌細(xì)胞株的分化可能無明顯影響。雖然本研究未出現(xiàn)陽性數(shù)據(jù)，但本研究首次探討了S100A6對肺癌細(xì)胞株分化的影響，仍期待后續(xù)研究納入多種細(xì)胞株進(jìn)一步探索S100A6對肺癌細(xì)胞株分化方向的影響。

作者貢獻(xiàn)：王婷進(jìn)行文章的構(gòu)思與設(shè)計(jì)，論文撰寫；牛蔓進(jìn)行研究的實(shí)施與可行性分析，資料收集、整理；張奕進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理、論文的修訂，負(fù)責(zé)文章的質(zhì)量控制及審校，對文章整體負(fù)責(zé)、監(jiān)督管理。

本文無利益沖突。