解雨飛 周培茹 華紅 劉曉松
(北京大學口腔醫(yī)學院·口腔醫(yī)院口腔黏膜科,國家口腔醫(yī)學中心,國家口腔疾病臨床醫(yī)學研究中心,口腔數(shù)字化醫(yī)療技術(shù)和材料國家工程實驗室,北京 100081)
念珠菌感染是臨床最常見的機會性真菌感染之一,好發(fā)于老年人群、癌癥化療、移植術(shù)后、HIV感染等免疫低下人群。研究顯示,患有惡性腫瘤及接受過手術(shù)的老年患者中,侵襲性念珠菌病的患病率分別可達73.7%及74.1%[1]。而HIV感染患者中口咽念珠菌病的患病率可高達79.4%[2]。此外,隨著體內(nèi)置管及心臟瓣膜等植入性生物材料的廣泛應用,由生物膜引起的深部真菌感染發(fā)病率也日趨增多,并可導致40%~60%的高死亡率[3]。
由于唑類、多烯類、棘白菌素類等傳統(tǒng)抗真菌劑的廣泛使用、天然耐藥性念珠菌株的出現(xiàn)以及非白念珠菌感染比例增加,臨床念珠菌耐藥現(xiàn)象日漸嚴重。研究顯示,熱帶念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌的臨床氟康唑耐藥率分別可達11.6%、11.9%及13%[4-5]。此外,臨床常用傳統(tǒng)抗真菌劑還具有肝腎毒性等較為嚴重的不良反應。FAERS藥物警戒數(shù)據(jù)庫顯示,藥物性肝損傷病例中有2.9%與使用抗真菌劑有關(guān),而酮康唑使用者中發(fā)生肝衰竭的比值比可高達4.22[6]。因此,研發(fā)新型抗念珠菌劑是臨床亟待解決的問題。
植物活性成分是指從植物組織中提取出的化學結(jié)構(gòu)明確的生物活性分子及其衍生物,可分為生物堿類、黃酮類、苯丙烷類、萜類、醌類、有機酸等[7-8]。近年來研究顯示:植物活性成分對多種念珠菌具有顯著抑制作用,且具有來源廣泛、不良反應小、適合長期或預防性使用等多方面優(yōu)勢,成為新型抗真菌劑的重要來源,有待未來在臨床應用中發(fā)揮重要作用。國內(nèi)外已有體外研究表明,小檗堿[9]、厚樸酚[10]、丁香酚[11]、土荊皮乙酸[12]等多種植物活性成分可對白念珠菌敏感株、耐藥株及非白念珠菌均有較好的抑制作用。此外,大蒜素[13]、百里香酚[14]、網(wǎng)脊衣酸B[15]等多種植物活性成分與傳統(tǒng)抗真菌劑聯(lián)合應用時,還可起到協(xié)同增效的作用。本文對近年來(2009—2020年)植物活性成分抗念珠菌研究的作用及機制進行綜述,以期為抗念珠菌臨床治療及新藥研發(fā)提供理論基礎(chǔ)和新策略、新思路。
念珠菌毒力因子包括黏附與侵襲、酵母態(tài)—菌絲態(tài)形態(tài)轉(zhuǎn)換、生物膜形成、水解酶合成與分泌等。念珠菌在宿主體內(nèi)發(fā)揮致病性作用,均有賴于這些毒力因子的參與。
白念珠菌的黏附是其發(fā)揮侵襲作用及形成生物膜的關(guān)鍵性第一步,植物活性成分抗念珠菌黏附作用可主要通過細胞實驗進行證實。即通過將念珠菌與口腔黏膜上皮細胞共培養(yǎng),觀察在植物活性成分作用下,念珠菌在口腔黏膜上皮細胞表面的黏附情況。馬妍等[16]研究發(fā)現(xiàn),400 μg/mL丹皮酚和1 μg/mL氟康唑單獨應用時,白念珠菌對人口腔黏膜上皮細胞的黏附率分別為(93.33±4.84)%與(91.67±3.45)%,而聯(lián)合應用時其黏附率僅為(38.33±1.51)%,因此丹皮酚可與氟康唑協(xié)同抑制白念珠菌對人口腔黏膜上皮細胞的黏附。此外,譚心等[17]研究表明,肉桂醛、小檗堿單獨使用及其與氟康唑聯(lián)用時,既可抑制白念珠菌芽管形成,還可顯著抑制其對人口腔黏膜上皮細胞的黏附。其機制可能為肉桂醛、小檗堿與氟康唑協(xié)同干擾了白念珠菌芽管胞壁蛋白的合成及其相關(guān)基因的調(diào)控,從而抑制了白念珠菌芽管的形成,并降低了其對宿主細胞的黏附能力。
而在評估植物活性成分抗念珠菌的侵襲作用時,除常規(guī)通過PCR檢測侵襲素Als3p和Ssalp基因的表達,也可通過細胞實驗進行研究。Chang等[15]通過選取人克隆結(jié)直腸腺癌細胞系(Caco-2)與白念珠菌共培養(yǎng),并采用細胞膜探針(DiI)染色法,評估了網(wǎng)脊衣酸B對白念珠菌侵襲宿主細胞能力的影響。其研究結(jié)果表明,網(wǎng)脊衣酸B與氟康唑單獨應用時,細胞內(nèi)菌絲侵襲率分別為(68±34)%及(57±16)%,而當兩種藥物聯(lián)用后,細胞內(nèi)菌絲侵襲率可顯著減少至(25±16)%,因此證實了植物活性成分的抗念珠菌侵襲作用。
酵母態(tài)—菌絲態(tài)形態(tài)轉(zhuǎn)換是白念珠菌發(fā)揮致病性的基礎(chǔ)。白念珠菌可通過由酵母態(tài)轉(zhuǎn)化為菌絲態(tài),對宿主細胞產(chǎn)生黏附、穿刺和侵襲作用,進而發(fā)揮其致病性。涉及到的相關(guān)信號通路主要包括:cAMP/PKA信號通路、MAPK信號通路、Rim101介導的pH信號通路、及Tup1介導的負調(diào)通路等[18]。Zhong等[19]研究顯示,當血根堿濃度為0.8 μg/mL時,Spider培養(yǎng)基中的白念珠菌全部保持酵母態(tài),未見菌絲生成;而當血根堿濃度達1.6 μg/mL時,白念珠菌cAMP信號通路相關(guān)基因ALS3、HWP1、ECE1、HGC1、CYR1的表達水平均顯著下調(diào)。Sun等[20]研究發(fā)現(xiàn),4 μg/mL的厚樸酚與和厚樸酚可顯著抑制白念珠菌菌絲形成,當其濃度達到16 μg/mL時,Spider培養(yǎng)基中的白念珠菌未見菌絲生成,其可能機制為厚樸酚與和厚樸酚抑制了Ras1-cAMP-Efg1信號通路相關(guān)基因RAS1、EFG1、TEC1和CDC35的表達。
此外,群體感應分子也與念珠菌的致病性有著十分密切的關(guān)聯(lián)。群體感應分子法尼醇可通過抑制腺苷酸環(huán)化酶活性,作用于Ras1-Cyr1-cAMP-Efg1信號通路,進而抑制念珠菌酵母態(tài)—菌絲態(tài)形態(tài)轉(zhuǎn)換及生物膜形成;而酪醇則可以促進其菌絲及生物膜形成[21]。嚴圓圓等[22]研究發(fā)現(xiàn),穿心蓮內(nèi)酯可影響白念珠菌群體感應分子法尼醇與酪醇的分泌量,并且對法尼醇呈負調(diào)作用,對酪醇呈正調(diào)作用,且該成分可使群體感應分子編碼基因CHK1和PBS2明顯下調(diào),最終對白念珠菌酵母態(tài)—菌絲態(tài)形態(tài)轉(zhuǎn)換及生物膜形成產(chǎn)生顯著抑制作用。
念珠菌生物膜的形成過程可大致分為4個階段:宿主表面黏附;念珠菌細胞的增殖;菌絲形成及細胞外基質(zhì)的產(chǎn)生;生物膜成熟后菌體的擴散及其他部位的定植[23]?,F(xiàn)有研究顯示:植物活性成分的抗念珠菌作用機制包括抑制念珠菌生物膜形成過程、破壞念珠菌生物膜空間結(jié)構(gòu)、影響念珠菌生物膜細胞擴散等。Xie等[9]研究發(fā)現(xiàn),小檗堿對白念珠菌、克柔念珠菌、都柏林念珠菌、光滑念珠菌生物膜的初始形成期至成熟期(6 h、12 h、24 h、48 h)均有抑制作用,其對上述五種念珠菌的最低起效濃度分別為40 μg/mL、40 μg/mL、1280 μg/mL及320 μg/mL,且對48 h生物膜抑制作用最強。激光共聚焦顯微鏡及3D重建后發(fā)現(xiàn),小檗堿可顯著破壞生物膜的空間結(jié)構(gòu),使細胞排列松散,密度降低,生物膜厚度變薄 [減少率為(15.49±8.45)%~(30.30 ± 15.48)%]。此外,施高翔等[24]研究發(fā)現(xiàn),穿心蓮內(nèi)酯可導致念珠菌生物膜促分散基因HSP90表達上調(diào)和抗分散基因UME6表達下調(diào),并在250、500、1 000 mg/L濃度時呈劑量依賴性誘導白念珠菌生物膜播散。該特性可使生物膜中的白念珠菌分散為浮游菌,有利于抗真菌劑將其進一步殺滅。
白念珠菌毒力相關(guān)水解酶主要包括分泌性天冬氨酸蛋白酶(secreted aspartylproteinase, Sap)、磷脂酶(phospholipase, PL)和脂肪酶(lipase, Lip)等。水解酶可介導白念珠菌黏附、侵襲宿主細胞,同時還可裂解宿主免疫應答相關(guān)分子,協(xié)助白念珠菌逃避宿主的免疫防御機制[25]。多種植物活性成分可通過下調(diào)水解酶相關(guān)編碼基因,抑制水解酶合成,進而減少其分泌。王楊等[26]研究發(fā)現(xiàn)紫草素可呈濃度依賴性抑制白念珠菌磷脂酶分泌,8 μg/mL的紫草素可使PLB1和PLB2基因的相對表達量降低56.4%和61.4%,且16 μg/mL的紫草素可使白念珠菌磷脂酶分泌量下降56.3%。許穎等[27]研究發(fā)現(xiàn),當魚腥草素鈉濃度達240 mg/L時,可顯著抑制磷脂酶編碼基因PLB1和PLB2的表達。與此相反,一些植物活性成分還可通過上調(diào)水解酶相關(guān)基因表達而發(fā)揮作用。王梅竹等[28]研究發(fā)現(xiàn),松油烯-4-醇可抑制浮游態(tài)白念珠菌生長(MIC = 2.048 g/L),但在其作用12 h后,白念珠菌PLB1和SAP2基因表達量均高于對照組。作者推測松油烯-4-醇可能阻止了白念珠菌水解酶PLB、Sap的進一步分泌,使其蓄積于念珠菌體內(nèi),進而發(fā)揮其抑菌作用,但具體機制還有待在后續(xù)研究中確證。
環(huán)境壓力可誘導念珠菌產(chǎn)生并積累大量內(nèi)源性活性氧(reactive oxygen species, ROS),導致胞內(nèi)發(fā)生進行性氧化損傷,破壞DNA、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等成分[29]。植物活性成分亦可通過誘導念珠菌產(chǎn)生內(nèi)源性ROS,損傷其細胞器及細胞膜完整性,進而誘導念珠菌發(fā)生凋亡。姜璐璐等[30]研究發(fā)現(xiàn):16 μg/mL的和厚樸酚作用2 h或4 h時,白念珠菌胞內(nèi)ROS含量可顯著增加。而32 μg/mL的和厚樸酚作用4 h后,白念珠菌胞內(nèi)熒光強度可增加至741%。因此在低劑量時,厚樸酚即可誘導白念珠菌迅速產(chǎn)生大量ROS,促進其胞內(nèi)氧化應激反應,從而誘導白念珠菌凋亡。此外,Choi等[31]研究表明,5 μg/mL番茄紅素作用4 h后,白念珠菌胞內(nèi)羅丹明-123染色熒光強度和HPF染色熒光強度分別增加30.13%和10.01%。因此,番茄紅素可通過誘導白念珠菌胞內(nèi)ROS積累,特別是·OH的積累,從而誘導白念珠菌凋亡。
植物活性成分可通過激活Caspase依賴性信號通路,導致線粒體膜通透性發(fā)生改變,進而誘導念珠菌細胞凋亡。胡丹丹等[32]研究發(fā)現(xiàn),4 μg/mL和8~16 μg/mL的紫檀茋可分別誘導14%及17%的白念珠菌發(fā)生凋亡。紫檀茋作用3 h后,白念珠菌Caspase酶活性升高,線粒體膜通透性改變,膜電位降低,細胞內(nèi)ROS積累亦增多,協(xié)同誘導了細胞凋亡。此外,馮鑫等[33]研究發(fā)現(xiàn),100 μmol/L和1 000 μmol/L的黃芩苷可誘導白念珠菌細胞核固縮與碎裂,并降低線粒體膜電位,進而導致念珠菌細胞凋亡。
藥物靶酶與藥物主動外排泵的高表達,是念珠菌耐藥的重要機制。藥物靶酶相關(guān)編碼基因主要有ERG5、ERG11。念珠菌耐藥相關(guān)主動外排泵包括ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運蛋白家族(ATP-binding cassette transporters, ABCT)和主要易化超家族(major facilitator superfamily, MFS),其相關(guān)編碼基因分別包括CDR1、CDR2、MDR1、MDR2及FLU1等[34]。曹園等[35]研究表明,當白念珠菌長期暴露于氟康唑后,其ERG5、ERG11、CDR1、CDR2、MDR1與FLU1基因表達均上調(diào),進而誘發(fā)其耐藥。但當與卷柏素聯(lián)用后,其可顯著逆轉(zhuǎn)上述基因表達水平,使其分別下調(diào)86%、71%、62%、67%、56%和36%。另外,董懷懷等[36]研究表明,芒果苷與氟康唑聯(lián)用時,白念珠菌耐藥株CDR1下調(diào)最為明顯,CDR2、MDR2較氟康唑單用組亦顯著下調(diào)。Xu等[37]及Shao等[38]研究還發(fā)現(xiàn),當小檗堿與氟康唑聯(lián)用時,其可對氟康唑耐藥型白念珠菌和熱帶念珠菌有良好的抑菌效果。其機制可能與促進念珠菌胞內(nèi)額ROS的積累、抑制細胞膜麥角固醇生物合成、及抑制外排泵編碼基因CDR1、CDR2、MDR1的表達等有關(guān)。
現(xiàn)有研究表明,植物活性成分可通過抑制念珠菌毒力因子、誘導念珠菌細胞凋亡、抑制藥物靶酶與外排泵基因表達等相關(guān)機制發(fā)揮其抗念珠菌作用。近年來,植物活性成分在抗念珠菌研究領(lǐng)域的深度、廣度不斷拓展,顯示出良好的應用前景。但目前其研究仍存在一定的不足之處,如研究菌株的數(shù)量、種類不足;對非白念珠菌、混合念珠菌感染相關(guān)研究缺乏;細胞毒性實驗、體內(nèi)研究及臨床研究涉及尚少等。因此,植物活性成分抗念珠菌的有效性及安全性仍有待于進一步明確,未來尚需大量深入的機制研究、體內(nèi)、外研究以及規(guī)范的臨床研究等,以進一步確證其療效及安全性。