王成強(qiáng) 曹體宏 李寶山 王際英 郝甜甜 宋志東 王曉艷 孫永智

混合微藻替代魚油對大菱鲆幼魚生長性能、體組成及腸道部分生化指標(biāo)的影響*

王成強(qiáng) 曹體宏 李寶山 王際英①郝甜甜 宋志東 王曉艷 孫永智

(山東省海洋資源與環(huán)境研究院 山東省海洋生態(tài)修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 山東 煙臺 264006)

本實(shí)驗(yàn)以大菱鲆()幼魚[(39.69±0.25) g]為研究對象，探究由裂壺藻(sp.)和擬微綠球藻(sp)組成的混合微藻替代魚油對幼魚生長性能、體組成、腸道消化水平及抗氧化能力的影響，以確定混合微藻替代魚油的適宜比例。通過在基礎(chǔ)飼料中添加不同比例的混合微藻，分別替代0、25%、50%和100%的魚油，制成4組等氮等脂的實(shí)驗(yàn)飼料(分別命名為D1、D2、D3和D4)，每組飼料設(shè)3個重復(fù)，實(shí)驗(yàn)周期為12周。結(jié)果顯示，隨替代比例的提高，大菱鲆幼魚的增重率(WGR)和飼料效率(FE)呈下降趨勢，D1、D2和D3組的特定生長率(SGR)和FE無顯著性差異，但均顯著高于D4組(<0.05)；肝體比(HSI)在D1組達(dá)到最大值，且顯著高于其他各組(<0.05)；存活率(SR)和肥滿度(CF)在各組之間無顯著差異(>0.05)。隨著混合微藻替代魚油比例的升高，全魚和肌肉粗脂肪含量呈先升高后降低的變化趨勢，且D4組顯著低于D1組(<0.05)；大菱鲆幼魚魚體中C20:4n-6和n-6 PUFA含量顯著升高，在D4組均達(dá)到最大值，且顯著高于對照組(<0.05)。而EPA、DHA和n-3 PUFA含量隨之顯著下降，對照組(D1)含量顯著高于其他各組(<0.05)；肌肉中C20:4n-6和DHA含量在不同實(shí)驗(yàn)組間無顯著性差異(>0.05)，EPA和n-3 PUFA含量呈顯著降低趨勢(<0.05)。腸道脂肪酶活力在D3組達(dá)到最大值，顯著高于對照組(<0.05)，腸道胰蛋白酶活力也是在D3組最高，但與對照組無顯著性差異(>0.05)。與D1組相比，D3組腸道中酸性磷酸酶(ACP)、堿性磷酸酶(AKP)、溶菌酶(LZM)活力和補(bǔ)體C3含量均顯著升高(<0.05)。腸道中超氧化物歧化酶(SOD)、總抗氧化能力(T-AOC)和過氧化氫酶(CAT)活力隨替代比例的提高呈先升高后降低的趨勢，均在D3組達(dá)到最大值，顯著高于D1組(<0.05)，而腸道中丙二醛(MDA)含量在不同實(shí)驗(yàn)組間并未表現(xiàn)出顯著性差異(>0.05)。綜上所述，混合微藻替代50%的魚油并不會對大菱鲆幼魚的生長性能產(chǎn)生負(fù)面影響，同時可以提高腸道的消化性能、抗氧化能力和非特異性免疫能力。

大菱鲆；裂壺藻；擬微綠球藻；生長性能；腸道生化指標(biāo)

近年來，受捕撈量等因素的影響，全球魚油總產(chǎn)量呈顯著下滑趨勢(FAO, 2019)，而水產(chǎn)飼料對魚油的需求量卻與日俱增，因此，探尋可以替代魚油的合適脂肪源顯得尤為重要。鑒于此，很多學(xué)者在魚油替代方面做了大量研究工作，如用豆油、玉米油、亞麻籽油、棕櫚油等植物油單一或混合替代魚油。但由于植物油中飽和脂肪酸較多，缺少n-3高不飽和脂肪酸(n-3 LC-PUFA：如EPA、DHA等)，難以滿足水生動物的營養(yǎng)需求，同時含有植物甾醇等抗?fàn)I養(yǎng)因子(Cruz-Garcia, 2011)，長期攝食會對機(jī)體的生長、抗病力、品質(zhì)等方面產(chǎn)生不利影響。另外，研究表明，n-3 LC-PUFA在對機(jī)體成長、抗炎癥、抗病力、繁殖性能及心腦血管健康等方面都表現(xiàn)出積極作用(Tibaldi, 2015; Shahidi, 2018)，而大部分海水魚，除籃子魚()、鮭魚()外，均不能合成n-3 LC-PUFA，或合成量難以滿足自身需求。

微藻作為海洋食物鏈的初級生產(chǎn)者，因其自身含有豐富脂類營養(yǎng)，特別是富含n-3 LC-PUFA，在當(dāng)前魚油替代資源的開發(fā)中備受關(guān)注。一方面，微藻脂類中的大部分碳鏈為中長鏈的直鏈分子，且部分微藻中EPA和DHA的含量較高，常見種類如擬微綠球藻(sp.)、新月菱形藻()、三角褐指藻()的EPA為30%左右，牟氏角毛藻()、紫球藻()的EPA為20%左右，裂壺藻(sp.)的DHA含量為30%～45%，金藻()的DHA含量為15%左右(吉紅等, 2020)；另一方面，同魚油相比，微藻產(chǎn)量受季節(jié)波動較小，穩(wěn)定性較高，同時，作為初級生產(chǎn)者具有更高的安全性(張繼紅等, 2016; Roy, 2015)。因擬微綠球藻和裂壺藻分別含有豐富的EPA和DHA，所以當(dāng)前許多有關(guān)微藻替代魚油的研究集中在這兩者上。在寶石鱸() (Hoestenberghe, 2016)、大西洋鮭() (Miller, 2007)和羅非魚() (Sarker, 2016)等的研究中表明，裂壺藻部分或是完全替代魚油不會對魚體的生長性能和存活率產(chǎn)生負(fù)面影響，還可以增加肌肉的DHA含量，提高肌肉品質(zhì)。另外，在歐洲鱸魚()和牙鲆()的研究中表明，用擬微綠球藻替代50%～100%的飼料魚油時，實(shí)驗(yàn)魚的生長和飼料利用率無明顯變化(Qiao, 2014; Haas, 2016)。在大菱鲆幼魚的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，添加5.0%～7.5%的擬微綠球藻粉替代16%～24%的魚油，可以提高魚體的抗氧化能力和免疫性能(胡冬雪, 2019)。

然而，在以往的報道中，主要集中在單一微藻對魚油替代的研究，而單一替代容易造成DHA/EPA比值的變化，難以平衡n-3 HUFA營養(yǎng)，并影響魚類生理功能(Eryalcin,2013)。另外，腸道作為魚體的主要消化吸收器官，其功能的變化也是決定微藻能否被利用的關(guān)鍵，而先前在這一方面鮮有研究。本實(shí)驗(yàn)以我國北方主要養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)魚類大菱鲆()為研究對象，在課題組前期實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，將擬微綠球藻和裂壺藻比例混合，評估在大菱鲆飼料中這種混合微藻替代魚油的可能性，并分析對生長、體組成、腸道抗氧化及免疫能力的影響，以期豐富微藻在魚油替代中的理論數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)飼料的配制

以魚粉、大豆?jié)饪s蛋白和酪蛋白為主要蛋白源，魚油和豆油為主要脂肪源，并補(bǔ)充礦物質(zhì)、維生素和誘食劑等配制基礎(chǔ)飼料。在此基礎(chǔ)上，分別用裂壺藻粉和擬微綠球藻的混合物(裂壺藻∶擬微綠球藻=1∶8.60)替代基礎(chǔ)飼料中的魚油，替代比例分別為0、25%、50%和100%，以豆油進(jìn)行調(diào)平，制成4組等氮等脂的實(shí)驗(yàn)飼料(表1)。4組實(shí)驗(yàn)飼料分別命名為D1、D2、D3和D4，其中D1組為對照組。實(shí)驗(yàn)原料及飼料脂肪酸組成情況見表2。所有飼料原料均粉碎過80目篩，依據(jù)實(shí)驗(yàn)配方，按照配比從小到大逐級均勻混合，隨后加入油脂與干粉充分混勻，再加入適量蒸餾水再次混合均勻，擠壓制成硬顆粒飼料，50℃左右烘干后，置于通風(fēng)干燥處備用。

1.2 實(shí)驗(yàn)用魚及實(shí)驗(yàn)管理

實(shí)驗(yàn)用魚購買于山東省萊州市海勝苗種有限公司，養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)在山東省海洋資源與環(huán)境研究院室內(nèi)循環(huán)水養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。將大菱鲆幼魚先放置于養(yǎng)殖桶中，用對照組飼料暫養(yǎng)10 d，使其適應(yīng)養(yǎng)殖環(huán)境。實(shí)驗(yàn)正式開始前，將其饑餓24 h，選取規(guī)格均勻、體色健康的大菱鲆幼魚[平均體重為(39.69±0.25) g]，隨機(jī)放置于12個養(yǎng)殖桶內(nèi)。每個桶內(nèi)放置30尾幼魚，每個實(shí)驗(yàn)組3個重復(fù)，養(yǎng)殖方式為循環(huán)水養(yǎng)殖，養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)周期為12周。實(shí)驗(yàn)期間每天在07:30和16:30飽食投喂2次，投喂30 min后排殘餌并記錄。水溫控制在(16.5±1.0)℃，溶解氧(DO)>6.2 mg/L，鹽度為24.6～27.5，pH為7.6～8.0，氨氮和亞硝酸氮含量均<0.1 mg/L。

1.3 實(shí)驗(yàn)樣品采集

養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，將魚禁食24 h，然后計(jì)數(shù)和稱總重。之后，從每個養(yǎng)殖桶中隨機(jī)取出8尾魚，測定每尾魚的體長和體重，其中3尾用于全魚體成分分析，放置于–20℃冰柜保存。另外5尾魚，先采用尾部靜脈取血法取血，取出血液4℃靜置4 h，經(jīng)離心得到血清，將血清轉(zhuǎn)移到離心管后迅速放入液氮中。之后，將采完血的大菱鲆進(jìn)行解剖取樣，分別分離出腸道和肌肉等組織，均放入離心管中后迅速轉(zhuǎn)移到液氮中，后轉(zhuǎn)移到–80℃超低溫冰箱中保存，用于后期實(shí)驗(yàn)分析。

表1 實(shí)驗(yàn)飼料配方及營養(yǎng)水平(干物質(zhì)%)

Tab.1 Formulation and proximate composition of experimental diets (dry matter %)

注：1：維生素混合料(mg/kg or IU/kg飼料)：維生素A，7500.0 IU；維生素D，1500.0 IU；維生素E，60.0 mg；維生素K3，18.0 mg；維生素B1，12.0 mg；維生素B2，12.0 mg；維生素B6，20.0mg；維生素B12，0.1 mg；泛酸，48.0 mg；煙酰胺，90.0 mg；葉酸，3.7mg；D-生物素，0.2 mg；肌醇，60.0 mg；維生素C，310.0 mg；2：礦物質(zhì)混合料(mg/kg飼料)：鋅，35.0 mg；錳，21.0 mg；銅，8.3 mg；鐵，23.0 mg；鈷，1.2 mg；碘，1.0 mg；硒，0.3 mg；3：擬微綠球藻：粗蛋白，9.55%；粗脂肪，25.46%；青島越洋進(jìn)出口有限公司，山東；4：裂壺藻：粗蛋白，44.50%；粗脂肪，18.25%；煙臺海榮生物科技有限公司，山東。

Note: 1: Vitamin premix (mg/kg or IU/kg diet): Vitamin A 7500.0 IU, vitamin D 1500.0 IU, vitamin E 60.0 mg, vitamin K318.0 mg, vitamin B112.0 mg; vitamin B212.0 mg, vitamin B620.0 mg, vitamin B120.1 mg, pantothenate acid 48.0 mg, niacin 90 mg, folic acid 3.7 mg, D-biotin 0.2 mg, inositol 60.0 mg, vitamin C 310.0 mg; 2: Mineral premix (mg/kg diet): Zn 35.0 mg, Mn 21.0 mg, Cu 8.3 mg, Fe 23.0 mg, Co 1.2 mg, I 1.0 mg, Se 0.3 mg; 3:sp. (% dry matter basis): Crude protein, 9.55%; Crude lipid, 25.46%; Qingdao Yueyang Import and Export Co. Ltd, Qingdao, China; 4:sp. (% dry matter basis): Crude protein, 44.50%; Crude lipid, 18.25%; Yantai Hairong Biotechnology Co. Ltd., Yantai, China.

1.4 測定指標(biāo)及方法

1.4.1 生長指標(biāo)

存活率(survival rate, SR, %)=100×N/0；

增重率(weight gain rate, WGR, %)=100×(W–0)/0；

飼料效率(feed efficiency, FE)=(W–0)/；

蛋白質(zhì)效率(protein efficiency ratio, PER, %)= 100×(W–0)/(×)；

脂肪效率(lipid efficiency ratio, LER, %)= 100×(W–0)/(×)；

肝體比(hepatosomatic index, HSI, %)=100×W/t；

肥滿度(condition factor, CF)=100×W/3；

式中，N為實(shí)驗(yàn)魚末數(shù)量，0為實(shí)驗(yàn)魚初數(shù)量，W為實(shí)驗(yàn)魚末重(g)，0為實(shí)驗(yàn)魚初重(g)，為實(shí)驗(yàn)魚養(yǎng)殖時間，為總投餌量(g)，為飼料中蛋白質(zhì)的含量(%)，為飼料中脂肪含量(%)，W為實(shí)驗(yàn)魚肝臟重量，為實(shí)驗(yàn)魚末體長(cm)。

表2 實(shí)驗(yàn)飼料及原料脂肪酸組成(%總脂肪酸)

Tab.2 Fatty acids composition of the experimental diets and raw materials (% total fatty acids)

注：1:SFA：飽和脂肪酸；2: MUFA：單不飽和脂肪酸；3:n-6 PUFA：n-6系列多不飽和脂肪酸；4: EPA：C20:5n-3；5: DHA：C22:6n-3；6:n-3 PUFA：n-3系列多不飽和脂肪酸；7: PUFA：多不飽和脂肪酸；下同。

Notes: 1:SFA: Saturated fatty acids;2:MUFA: Mono-unsaturated fatty acids;3:n-6 PUFA: n-6 poly-unsaturated fatty acids; 4:EPA: Eicosapentaenoic acid (C20:5n-3); 5:DHA: Docosapentaenoic acid (C22:6n-3); 6:n-3 PUFA: n-3 poly-unsaturated fatty acid; 7:PUFA: Polyunsaturated fatty acids; the same as below.

1.4.2 實(shí)驗(yàn)樣品及飼料常規(guī)營養(yǎng)指標(biāo)分析 實(shí)驗(yàn)樣品及飼料水分測定采用105℃烘干恒重法測定(GB/T 6435-2006)，粗蛋白采用凱氏定氮法測定(GB/T 6432-2006)，粗脂肪采用索氏抽提法測定(GB/T 6433-2006)，粗灰分采用馬弗爐550℃失重法測定(GB/T 6438-2007)，脂肪酸含量測定參考Mourente等(1999)的氣相色譜法并稍作修改，利用高效氣相色譜儀(SHIMADZU GC-2010, 日本)測得。

1.4.3 腸道生理生化指標(biāo)分析 腸道中胰蛋白酶(trypsin)、脂肪酶(lipase)、淀粉酶(amylase)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、總抗氧化能力(total antioxidant capacity, T-AOC)、過氧化氫酶(catalase, CAT)、丙二醛(malondialdehyde, MDA)、酸性磷酸酶(acid phosphatase, ACP)、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase, AKP)、溶菌酶(lysozyme, LZM)和補(bǔ)體C3 (complement component 3, C3)均利用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的相應(yīng)試劑盒測得。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(Mean±SE)來表示，用SPSS 19.0分析軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(one-Way ANOVA)，使用Duncan’s檢驗(yàn)方法對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多重比較，當(dāng)<0.05時，表示具有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 混合微藻替代魚油對大菱鲆幼魚生長性能及飼料利用的影響

由表3可知，大菱鲆幼魚的WGR和FE隨著替代比例的升高呈下降趨勢，在D1、D2和D3組間無顯著性差異(>0.05)，而當(dāng)混合微藻替代魚油的比例達(dá)到100% (D4組)時，實(shí)驗(yàn)魚的WGR和FE顯著低于其他各組(<0.05)。不同實(shí)驗(yàn)組間的PER和LER呈現(xiàn)與FE相同的變化趨勢(<0.05)。各實(shí)驗(yàn)組大菱鲆幼魚的SR均在91.99%～100%之間，不同實(shí)驗(yàn)組間無顯著性差異(>0.05)。

隨著替代比例的升高，大菱鲆幼魚的HSI呈下降趨勢(<0.05)，D4組幼魚的HSI顯著低于其他各實(shí)驗(yàn)組(<0.05)，而D1組幼魚的HSI顯著高于其他各實(shí)實(shí)驗(yàn)組(<0.05)。另外，各實(shí)驗(yàn)組幼魚的CF在不同處理組間無顯著性差異(>0.05)。

2.2 混合微藻替代魚油對大菱鲆幼魚魚體和肌肉化學(xué)組成的影響

由表4可知，當(dāng)混合微藻替代魚油的比例提高時，魚體粗脂肪含量呈先升高后降低的變化趨勢，當(dāng)替代比例為25% (D2組)時，魚體粗脂肪含量最高(9.43%)，顯著高于D1和D4組魚體粗脂肪含量(8.71%和8.43%)(<0.05)，而與D3組(8.90%)無顯著性差異(>0.05)。魚體粗蛋白含量呈現(xiàn)與粗脂肪含量相反的變化趨勢，但不同實(shí)驗(yàn)組間無顯著差異(>0.05)。同時，全魚的水分和粗灰分含量在不同實(shí)驗(yàn)組間均無顯著性差異(>0.05)。

表3 混合微藻替代魚油對大菱鲆幼魚生長性能及飼料利用的影響

Tab.3 Effects of fish oil replacement by mixed microalgae on growth performance and feed utilization of juvenile turbot

注：表格中同行肩標(biāo)相同小寫字母或無字母表示差異不顯著(>0.05)，不同小寫字母表示差異顯著(<0.05)。下同。

Note: In the same row, values with same small letter superscripts or no letter superscripts mean no significant differences (>0.05), different small letter superscripts mean significant differences (<0.05). The same as below.

表4 混合微藻替代魚油對大菱鲆幼魚魚體化學(xué)組成的影響(%干重)

Tab.4 Effects of fish oil replacement by mixed microalgae on body chemical composition of juvenile turbot (% dry weight)

肌肉粗脂肪含量呈現(xiàn)同全魚粗脂肪含量相同的變化趨勢，也是在替代比例為25% (D2組)時達(dá)到最大值(1.75%)，顯著高于D3和D4組(1.49%和1.38%)，與D1組(1.64%)無顯著性差異(>0.05)。隨著飼料中混合微藻比例的升高，大菱鲆幼魚肌肉中水分、粗蛋白和粗灰分含量均未發(fā)生顯著性變化(0.05)。

2.3 混合微藻替代魚油對大菱鲆幼魚魚體和肌肉脂肪酸組成的影響

表5、表6分別顯示了混合微藻替代魚油對大菱鲆幼魚魚體和肌肉脂肪酸組成的影響。研究表明，隨著混合微藻替代魚油比例的升高，大菱鲆幼魚魚體中SFA、MUFA、C20:4n-6和n-6 PUFA含量顯著升高，在D4組均達(dá)到最大值，且顯著高于對照組(<0.05)。而EPA、DHA和n-3PUFA含量隨之顯著下降，對照組(D1)含量顯著高于其他各組(<0.05)。但飽和脂肪酸(C14:0、C16:0)和C18:3n-3含量在不同處理組間無顯著性差異(>0.05)。

另外，肌肉脂肪酸組成同魚體有一些不同的變化，其肌肉中SFA、C20:4n-6和DHA含量在不同實(shí)驗(yàn)組間無顯著性差異(>0.05)。隨著混合微藻替代比例的提高，肌肉中單不飽和脂肪酸(C16:1n-7、C18:1n-9、C18:1n-7、C22:1n-9)、EPA和n-3 PUFA含量呈顯著降低趨勢(<0.05)，而n-6多不飽和脂肪酸(C18:2n-6、C20:3n-6和n-6PUFA)和PUFA含量呈顯著升高的趨勢(<0.05)。

2.4 混合微藻替代魚油對大菱鲆幼魚腸道消化酶活力的影響

由表7可知，隨著替代比例的升高，腸道脂肪酶活力呈先升高后降低的變化趨勢，在D3組達(dá)到最大值，顯著高于對照組(<0.05)，但與D2組、D4組無顯著性差異(>0.05)。腸道胰蛋白酶活力也是在D3組最高，顯著高于D2組(<0.05)，同D1、D4組無顯著性差異(>0.05)。同時，結(jié)果顯示，大菱鲆幼魚腸道淀粉酶活力在不同實(shí)驗(yàn)組無顯著性差異(>0.05)。

表5 混合微藻替代魚油對大菱鲆幼魚全魚脂肪酸組成的影響(%總脂肪酸)

Tab.5 Effects of fish oil replacement by mixed microalgae on whole fish body fatty acid composition of juvenile turbot (% total fatty acids)

表6 混合微藻替代魚油對大菱鲆幼魚肌肉脂肪酸組成的影響(%總脂肪酸)

Tab.6 Effects of fish oil replacement by mixed microalgae on muscle fatty acid composition of juvenile turbot (% total fatty acids)

表7 混合微藻替代魚油對大菱鲆幼魚腸道消化酶活力的影響

Tab.7 Effects of fish oil replacement by mixed microalgae on digestive enzyme activities in intestinal tract of juvenile turbot

2.5 混合微藻替代魚油對大菱鲆幼魚腸道抗氧化能力的影響

表8顯示，混合微藻替代魚油后，大菱鲆幼魚腸道的抗氧化能力發(fā)生了較為顯著的變化。腸道中SOD活力隨替代比例的提高呈先升高后降低的趨勢，在D3組達(dá)到最大值，顯著高于對照組(<0.05)，同D2組和D4組無顯著性差異(0.05)。同時，D3組腸道T-AOC和CAT活力顯著高于其他各組，D1組和D2組的T-AOC活力無顯著性差異，但均顯著高于D4組。另外，腸道中MDA含量在不同實(shí)驗(yàn)組間并未表現(xiàn)出顯著性差異(0.05)。

2.6 混合微藻替代魚油對大菱鲆幼魚腸道部分生化指標(biāo)的影響

由表9可知，混合微藻替代魚油對大菱鲆幼魚腸道中ACP、AKP、LZM活力和補(bǔ)體C3含量均產(chǎn)生顯著影響(<0.05)。ACP、LZM活力和補(bǔ)體C3含量均在D3組達(dá)到最大值，且均顯著高于對照組(<0.05)。其中，D3組ACP活力和補(bǔ)體C3含量也顯著高于D2組和D4組(<0.05)，而D3組LZM活力同D2組和D4組無顯著性差異(0.05)。當(dāng)替代比例達(dá)到100%時，腸道AKP活力出于最低值，顯著低于其他各實(shí)驗(yàn)組(<0.05)，而D1組和D3組AKP活力顯著高于其他實(shí)驗(yàn)組(<0.05)，且兩組間并無顯著性差異(0.05)。

表8 混合微藻替代魚油對大菱鲆幼魚腸道抗氧化能力的影響

Tab.8 Effects of fish oil replacement by mixed microalgae on antioxidant capacity in intestinal tract of juvenile turbot

表9 混合微藻替代魚油對大菱鲆幼魚腸道部分生化指標(biāo)的影響

Tab.9 Effects of fish oil replacement by mixed microalgae on activity of ACP, AKP, LZM and C3 in intestinal tract of juvenile turbot

3 討論

3.1 混合微藻替代魚油對大菱鲆幼魚生長性能的影響

裂壺藻和擬微綠球藻因含有較高的n-3 HUFA，且同魚油的脂肪酸組成大體相似(吉紅等, 2020)，成為近年來魚油替代的研究熱點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)在課題組前期工作的基礎(chǔ)上，將裂壺藻和擬微綠球藻進(jìn)行一定比例的混合，用于替代飼料中不同比例魚油。需要解釋的是，本實(shí)驗(yàn)配方中使用大豆?jié)饪s蛋白(5%～20%)進(jìn)行營養(yǎng)素調(diào)平，這一添加量的變化在先前的研究中表明并不會對魚體生長造成負(fù)面影響。如在海鱸()(向芳琴等, 2017)、珍珠龍膽石斑魚(♀ ×♂) (Wang, 2020)、大黃魚() (馮建等, 2017)的研究中均表明，飼料中添加不超過20%的大豆?jié)饪s蛋白對魚體生長性能無顯著性影響。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，替代比例在25%和50%時，大菱鲆幼魚的WGR和FE均與對照組無顯著性差異(0.05)，這也進(jìn)一步證實(shí)了利用微藻替代一定比例的魚油是可行的。這一結(jié)果與先前的不少研究結(jié)果類似，如Haas等(2016)在歐洲鱸魚中的研究表明，用擬微綠球藻和綠色巴夫藻(Pauloca )替代50%～100%的魚油時，對實(shí)驗(yàn)魚的生長性能并未產(chǎn)生不良影響。楊帆(2018)在凡納濱對蝦()的研究中發(fā)現(xiàn)，飼料中添加3%破壁裂壺藻可以顯著提高其SR、末均重和WGR，同時能顯著降低飼料系數(shù)(<0.05)。Patterson等(2013)用擬微綠球藻和舟形藻飼喂紅姑魚()的研究中也得到了類似的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。同時，劉宏超等(2016)進(jìn)一步證實(shí)了適宜水平裂壺藻(0.8%～1.2%)能夠?qū)蛐迈?var.)的生長產(chǎn)生明顯的促進(jìn)作用。這些結(jié)果均表明，微藻作為水產(chǎn)動物的油源，在一定程度上可產(chǎn)生同魚油一樣的效果，使動物體獲得較好的生長性能。

3.2 混合微藻替代魚油對大菱鲆幼魚魚體和組織化學(xué)組成的影響

值得注意的是，本研究中幼魚魚體和肌肉中粗脂肪含量在不同實(shí)驗(yàn)組間發(fā)生了顯著性變化，特別是肌肉中粗脂肪含量。與對照組相比，D3和D4組肌肉中粗脂肪含量較低，且D4組要顯著低于對照組(<0.05)，同時，全魚中粗脂肪含量也在D4組最低。先前的研究已表明，微藻在促進(jìn)水產(chǎn)動物脂質(zhì)代謝方面效果顯著。Van等(2016)在鱈魚()中的研究發(fā)現(xiàn)，用40%裂壺藻替代魚油可以顯著降低肌肉中脂肪含量。在大西洋鮭(Sprague, 2017)、星斑川鰈(張燕等, 2017)等研究中也得到了類似結(jié)論。產(chǎn)生這一結(jié)果的原因，可能是有以下兩方面：一方面，微藻中的n-3 HUFA，如裂壺藻中的DHA，相比于魚油中的n-3 HUFA可以更高效地在魚體中沉積，進(jìn)而促進(jìn)了魚體中脂質(zhì)水解，降低了脂肪沉積(Xing, 2020)；另一方面，由于D3和D4組中含有較高比例的擬微綠球藻，該藻中色素含量較高，約占干藻類生物量的5%左右，而色素在機(jī)體內(nèi)難以被消化吸收(Lubian, 2002)，同時也發(fā)現(xiàn)，D3和D4組的LER要顯著低于對照組，從而得知這2組中脂肪利用率較低，故脂肪沉積較少，這可能是造成這2組幼魚脂肪沉積較少的另一原因。

通過分析魚體和肌肉的脂肪酸組成發(fā)現(xiàn)，二者的脂肪酸組成在一定程度上反映飼料脂肪酸的組成特點(diǎn)與Peng等(2014)在關(guān)于大菱鲆脂肪酸營養(yǎng)方面的研究結(jié)論相似，也與以往微藻相關(guān)實(shí)驗(yàn)結(jié)論相一致，這也進(jìn)一步表明微藻中的脂肪酸營養(yǎng)可以很好地被大菱鲆幼魚所利用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，全魚中C18:1n-9、C18:1n-7和MUFA含量均呈現(xiàn)與飼料相反的變化趨勢，這可能是由單不飽和脂肪酸作為能量的主要供應(yīng)，在體內(nèi)更容易被氧化提供能量，從而被優(yōu)先利用(Karalazos, 2007)。而肌肉中的MUFA呈現(xiàn)與飼料組成相類似的變化趨勢，這也暗示，單不飽和脂肪酸在不同組織中被利用的程度不同，也就造成了不同的沉積量。同時，全魚和肌肉中的C18:2n-6、C20:4n-6以及n-6 PUFA含量變化趨勢均呈現(xiàn)同飼料相一致，可能是因?yàn)閷φ战M飼料中C18:2n-6含量已經(jīng)較高，可以滿足魚體的正常生長需求，從而過剩的沉積到組織中，這與在尖吻重牙鯛() (Piedecausa, 2007)的研究相一致。實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，隨替代比例的提高，全魚和肌肉中EPA含量均顯著降低，這是由EPA和C20:4n-6存在天然的競爭關(guān)系所造成的，ARA可以在一定程度上抑制EPA競爭融入機(jī)體組織的能力(王成強(qiáng)等, 2016)，從而出現(xiàn)了這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果。肌肉中DHA含量在一定程度上得到了提高，這與全魚DHA含量變化趨勢相反，這也說明大菱鲆具有將C18:3n-3轉(zhuǎn)化成DHA的能力，但不同部位合成能力不同，也就造成了不同組織對DHA沉積量有差異。同時，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，相比于全魚，大菱鲆肌肉的脂肪酸組成能夠更好地反映出飼料的脂肪酸組成。

3.3 混合微藻替代魚油對大菱鲆幼魚腸道消化酶指標(biāo)的影響

腸道中的一系列消化酶(胰蛋白酶、脂肪酶及淀粉酶等)可將攝入的食物進(jìn)行分解、消化和吸收，保障機(jī)體的營養(yǎng)攝取，其酶活力的高低直接反映了機(jī)體的消化能力。本研究中，腸道脂肪酶和胰蛋白酶在不同實(shí)驗(yàn)組間具有顯著的變化趨勢，且在替代量為50%和100%時均出現(xiàn)較高活力。這也表明，飼料中添加微藻可在一定程度上促進(jìn)魚體腸道消化功能。馬季等(2020)研究表明，用微藻和大豆油替代魚油后，大菱鲆幼魚的淀粉酶、脂肪酶以及胰蛋白酶均顯著高于對照組。而本研究中，當(dāng)替代量為100%時，雖然消化酶活力也處于較高水平，但與對照組無顯著性差異，可能是由于兩項(xiàng)實(shí)驗(yàn)中微藻的總添加量不同而造成的結(jié)果差異。楊帆等(2013)在凡納濱對蝦的研究中證實(shí)，3%的破壁裂壺藻或未破壁裂壺藻均會提高腸道胰蛋白酶的mRNA的表達(dá)水平，增強(qiáng)腸道的消化能力。微藻可以促進(jìn)腸道消化酶的活力，可能除了與含有較高比例的n-3 HUFA有關(guān)以外，還與本身含有一定比例的蛋白和總糖相關(guān)(陳秀麗等, 2016)

3.4 混合微藻替代魚油對大菱鲆幼魚腸道抗氧化及非特異性免疫指標(biāo)的影響

腸道作為水生動物的一種重要器官，不僅是營養(yǎng)物質(zhì)充分消化和吸收的保證，也在免疫調(diào)節(jié)、黏膜屏障、信號識別和內(nèi)源性活性分子產(chǎn)生中也扮演著重要的角色(NRC, 2011)，其抗氧化及免疫能力水平可以間接反映水生動物本身的免疫水平。SOD、T-AOC等是反映機(jī)體抗氧化系統(tǒng)功能綜合水平的主要指標(biāo)，是生物體內(nèi)廣泛存在的抗氧化酶，可以有效清除活性氧自由基以保護(hù)機(jī)體組織免受損傷(Pastor, 1988)。MDA是反映機(jī)體細(xì)胞受自由基攻擊的嚴(yán)重程度的主要指標(biāo)，是脂肪氧化的終產(chǎn)物之一。本研究中，當(dāng)混合微藻替代魚油為50%時，腸道SOD和T-AOC活力顯著高于對照組(<0.05)，這說明微藻可提高腸道的抗氧化能力。這可能主要是因?yàn)槲⒃逯泻胸S富的色素，特別是類胡蘿卜素和葉綠素，這些色素是一種天然的抗氧化劑，可在一定程度上保護(hù)細(xì)胞免受自由基的侵害，增強(qiáng)機(jī)體的抗氧化水平，保障機(jī)體健康(蘇怡等, 2016)。劉宏超等(2016)在津新鯉中的研究也表明，適量裂壺藻(0.8%～1.2%)在增強(qiáng)魚體抗氧化能力方面具有顯著的作用，還可以顯著降低血清中MDA含量，進(jìn)一步證實(shí)裂壺藻具有較強(qiáng)的清除機(jī)體自由基和減少脂質(zhì)過氧化的能力。

AKP及ACP是生物體內(nèi)重要的代謝調(diào)控酶，其本身不僅可以水解入侵的病原體，且可以促進(jìn)吞噬細(xì)胞的吞噬及降解作用，在機(jī)體非特異性免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用(Gisbert, 2018)。本研究中，替代比例為50%時，ACP活力顯著升高，AKP活力也處于較高水平，這也說明添加一定水平的微藻，可以增強(qiáng)大菱鲆幼魚的非特異性免疫能力。這在LZM和補(bǔ)體C3的結(jié)果中也得到了驗(yàn)證，LZM和補(bǔ)體C3均在機(jī)體非特異性免疫中發(fā)揮重要作用，補(bǔ)體C3是體內(nèi)重要的補(bǔ)體因子，當(dāng)機(jī)體免疫反應(yīng)被抑制時，其可以作為主要的補(bǔ)體來彌補(bǔ)；LZM是吞噬細(xì)胞殺菌的物質(zhì)基礎(chǔ)，能保護(hù)機(jī)體免受外源微生物的入侵(Saurabh, 2008)，從而對機(jī)體健康起到保護(hù)作用。本研究中，LZM和補(bǔ)體C3同ACP呈現(xiàn)一致的變化趨勢，在替代量為50%時達(dá)到較高值，這也進(jìn)一步說明，在此替代水平上，大菱鲆幼魚獲得了較高的非特異性免疫能力。在凡納濱對蝦(楊帆, 2018)、星斑川鰈(張燕等, 2017)的實(shí)驗(yàn)均表明，飼料中添加適量的裂壺藻等微藻可以提高體內(nèi)LZM活力，增強(qiáng)機(jī)體的抗病力。產(chǎn)生這一結(jié)果可能是因?yàn)槲⒃逋鈱蛹?xì)胞壁含有豐富的多糖，而微藻多糖中的活性物質(zhì)在抗氧化、抗病毒及提升免疫力方面具有顯著作用(李潔瓊等, 2016)。

4 結(jié)論

綜上所述，在本實(shí)驗(yàn)條件下，用混合微藻(11.18%擬微綠球藻+1.30%裂壺藻)替代50%魚油時，(39.69±0.25) g大菱鲆幼魚可以獲得較佳的生長性能，同時可以提高腸道消化酶活力、抗氧化及非特異性免疫能力，增強(qiáng)腸道健康水平。本研究為混合微藻替代魚油研究提供了一定的理論依據(jù)；與此同時，本研究也發(fā)現(xiàn)，當(dāng)單種微藻或混合微藻添加量過多時，會引起魚體生長、飼料利用以及免疫能力的降低。

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Effects of Fish Oil Replacement by Mixed Microalgae on Growth Performance, Body Chemical Composition and Intestinal Tract Biochemical Indices of Juvenile Turbot ()

WANG Chengqiang, CAO Tihong, LI Baoshan, WANG Jiying①, HAO Tiantian, SONG Zhidong, WANG Xiaoyan, SUN Yongzhi

(Shandong Marine Resource and Environment Research Institute, Shandong Key Laboratory of Marine Ecological Restoration, Yantai, Shandong 264006, China)

A 12-week feeding experiment was conducted to evaluate the effects of fish oil replacement by mixed microalgae on growth performance, body composition, digestive enzyme activities, and antioxidant indices in the intestinal tract of juvenile turbot () [mean initial weight (39.69±0.25) g]. Four isonitrogenous and isoenergetic diets were formulated with graded contents of dietary fish oil replacement by mixed microalgae, 0, 25%, 50%, and 100%, designated D1, D2, D3, and D4, respectively. The results showed that weight growth rate (WGR) and feed efficiency (FE) decreased with an increasing replacement ratio; no significant differences were found between D1, D2, and D3 groups (>0.05), but all three had significantly higher values than the D4 group (<0.05). The D1 group showed the highest value of the hepatosomatic index (HSI), which was significantly higher than that in other groups (<0.05). With an increasing replacement ratio, the body and muscle crude lipid contents increased at first, and then decreased, being significantly higher in the D4 group than in the D1 group (<0.05). The C20:4n-6 and n-6 PUFA in the whole fish body reached their peaks in the D4 group (<0.05), with significantly higher values than those in the D1 group (<0.05). However, EPA, DHA, and n-3 PUFA significantly decreased in D4 (<0.05). The activities of lipase and trypsin in the intestinal tract reached their peaks in the D3 group. The activities of superoxide dismutase (SOD), total antioxidant capacity (T-AOC), and catalase (CAT) in the intestinal tract of the D3 group were significantly higher than those in the D1 group (<0.05). Additionally, the activities of acid phosphatase (ACP), alkaline phosphatase (AKP) and lysozyme (LZM), as well as the complement component 3 (C3) contents in the intestinal tract, showed the same tendency as SOD. The malondialdehyde (MDA) contents in the intestinal tract were not significantly different across the groups (>0.05). These results indicate that 50% fish oil replacement by mixed microalgae does not influence the growth performance of juvenile turbot, and may increase the digestive enzyme activities and antioxidant ability in the intestinal tract.

;sp.;sp.; Growth performance; Intestinal tract biochemical indices

WANG Jiying, E-mail: ytwjy@126.com

10.19663/j.issn2095-9869.20210526001

S963

A

2095-9869(2022)04-0158-13

*山東省自然科學(xué)基金(ZR2019PC061; ZR2020QC205)和煙臺市科技計(jì)劃項(xiàng)目(2020MSGY067)共同資助[This work was supported by Natural Science Foundation of Shandong Province (ZR2019PC061; ZR2020QC205), and Science and Technology Development Plan of Yantai (2020MSGY067)]. 王成強(qiáng)，E-mail: chengqiangwang@126.com

王際英，研究員，E-mail: ytwjy@126.com

2021-05-26,

2021-06-18

http://www.yykxjz.cn/

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(編輯 陳 輝)