郭雅璇，李蓉蓉，秦雪梅，李震宇*

1.山西大學 中醫(yī)藥現(xiàn)代研究中心，山西 太原 030006；2.山西大學 化學生物學與分子工程教育部重點實驗室，山西 太原 030006

黃芪是一種常用的傳統(tǒng)中藥，有補氣升陽、固表止汗、利水消腫、生津養(yǎng)血的功效，用于氣虛乏力、食少便溏、中氣下陷、久潰不斂[1]?！吨腥A人民共和國藥典》（以下簡稱《中國藥典》）2020年版收載的黃芪為豆科植物蒙古黃芪Astragalus membranaceus（Fisch.）Bge.var.mongholicus（Bge.）Hsiao或膜莢黃芪A.membranaceus（Fisch.）Bge.的干燥根。

目前，蒙古黃芪是商品黃芪藥材的主流品種。其中產(chǎn)于北岳恒山山脈毗鄰地區(qū)的蒙古黃芪俗稱恒山黃芪，生長年限多在5 年以上，是藥用黃芪中的優(yōu)質(zhì)品種，以“條直長、綿性大、粉性和甜味足”為特點[2-3]。隨著黃芪用量和需求的增加，主產(chǎn)于內(nèi)蒙古、甘肅等地，生長期為2 年的育苗移栽蒙古黃芪成為藥用黃芪的主流商品。由于種植模式不同，雖然兩者都是蒙古黃芪，但外觀性狀表現(xiàn)出明顯的差異[4]。在藥材交易市場中，恒山黃芪的價格遠高于2年生移栽黃芪。

針對這2 種不同生長方式蒙古黃芪的質(zhì)量差異，已有文獻對其化學組成進行系統(tǒng)比較[5-8]。本課題組前期研究表明，恒山黃芪的特征成分可能為黃酮類成分[9]。毛蕊異黃酮葡萄糖苷是《中國藥典》2020年版中黃芪項下的含量測定指標，僅測定這1 個成分難以全面評價黃芪中黃酮類成分的含量特征。芒柄花苷、黃芪紫檀烷苷、黃芪異黃烷苷和黃芪異黃烷這幾個黃酮類成分在黃芪中的含量也較高[9]，并且具有增強免疫、抗腫瘤、抗菌、抗氧化、抗輻射損傷、神經(jīng)保護、骨骼保護、降血糖及血管內(nèi)皮細胞保護等多種藥理作用[10-13]。因此，這些黃酮類成分也應(yīng)納入評價指標。雖然已有文獻建立了同時測定黃芪中多種指標成分的高效液相色譜法（HPLC）[14-16]，但這些方法中色譜條件較為復雜，大多采用梯度洗脫，存在檢測時間較長、液相梯度變化復雜進而影響方法的重現(xiàn)性等問題。

本研究在《中國藥典》2020 年版中黃芪項下毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量測定方法的基礎(chǔ)上，建立一種同時測定5 個黃酮類成分含量的方法，測定指標除了毛蕊異黃酮葡萄糖苷外，還選擇了芒柄花苷、黃芪紫檀烷苷、黃芪異黃烷苷和黃芪異黃烷；同時收集12 批恒山黃芪，并以9 批甘肅、內(nèi)蒙古產(chǎn)區(qū)的2 年生栽培蒙古黃芪為參照樣本（以下簡稱參照黃芪），通過黃芪5 個黃酮成分結(jié)合黃芪甲苷的多指標含量測定，進一步分析恒山黃芪的特征化學成分。

1 材料

1.1 儀器

1260 型高效液相色譜儀（Agilent 公司），包括G7111A 型四元泵、G7117C 型二極管陣列檢測器（DAD）；2695 型高效液相色譜儀（Waters 公司）；HH-ZK4型水浴鍋（鞏義市予華儀器有限責任公司）；Venusil MP C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm，Agela Technologies公司）。

1.2 試藥

黃芪樣品共21 批，其中1～12 批為恒山黃芪，13～21 批為參照黃芪，經(jīng)山西大學中醫(yī)藥現(xiàn)代研究中心秦雪梅教授鑒定均為蒙古黃芪Astragalus membranaceus（Fisch.）Bge.var.mongholicus（Bge.）Hsiao的干燥根，其詳細信息見表1。

表1 黃芪樣品信息

甲醇（純度≥99%）、甲酸（色譜純）均購于天津大茂有限公司；乙腈（色譜純，F(xiàn)isher 公司）；對照品毛蕊異黃酮葡萄糖苷（純度≥99%，批號：102944）、芒柄花苷（純度≥99%，批號：102715）、黃芪紫檀烷苷（純度≥98%，批號：100760）、黃芪異黃烷苷（純度≥98%，批號：100762）、黃芪異黃烷（純度≥98%，批號：100466）均購自江蘇永健醫(yī)藥科技有限公司；對照品黃芪甲苷（純度≥98%，批號：HA012079198，寶雞市辰光生物科技有限公司）。

2 方法

2.1 對照品溶液的制備

分別取對照品毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷、黃芪紫檀烷苷、黃芪異黃烷苷、黃芪異黃烷適量，精密稱定。加甲醇溶解，制成質(zhì)量濃度分別為0.997 0、0.204 0、0.611 4、0.312 9、0.458 5 mg·mL-1的混合對照品溶液。

2.2 供試品溶液的制備

取樣品粉末（過四號篩）約1 g，精密稱定，置圓底燒瓶中，精密加入甲醇50 mL，稱定質(zhì)量，加熱回流4 h，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液25 mL，回收溶劑至干，殘渣加甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至5 mL 量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，過微孔濾膜，即得[1]。

2.3 色譜條件

Venusil MP C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；0.2%甲酸水（A）-乙腈（B）梯度洗脫（0～20 min，20%～40%B；20～40 min，40%B）；柱溫為30 ℃；紫外檢測波長為230、260 nm；流速為1 mL·min-1；分別精密吸取對照品溶液和供試品溶液各10 μL，進樣測定。

2.4 方法學考察

2.4.1 專屬性考察 分別精密吸取空白溶液、對照品溶液和供試品溶液各10 μL，在2.3項下色譜條件下進樣測定。

2.4.2 系統(tǒng)適用性試驗 在2.3 項下色譜條件下對黃芪樣品進行測定，分別計算5 個黃酮類化合物的理論板數(shù)（N）及分離度（R）。

2.4.3 線性關(guān)系考察 精密吸取2.1 項下混合對照品儲備液0.1、0.2、0.5、1.0、1.5、2.0 mL，置于10 mL 量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，配制成系列對照品溶液，按照建立的色譜條件進行分析。以質(zhì)量濃度為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y）進行線性回歸。

2.4.4 精密度試驗 取黃芪樣品粉末制備供試品溶液，按2.3項下色譜條件，當天連續(xù)進樣6次和連續(xù)3 d進樣測定，記錄各成分峰面積。

2.4.5 重復性試驗 精密稱取黃芪樣品粉末制備供試品溶液，共制備6份，按2.3項下色譜條件進樣測定，計算各成分含量的RSD。

2.4.6 穩(wěn)定性試驗 精密稱取黃芪藥材粉末制備供試品溶液，室溫放置，分別于0、2、4、6、8、12、24 h按2.3項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。

2.4.7 加樣回收率試驗 取已知含量的黃芪樣品約0.5 g，按黃芪藥材中5個黃酮類化合物含量的50%、100%、150%分別加入對照品儲備液，每個質(zhì)量濃度下平行備樣3 份，按2.2 項下方法制備供試品溶液，測定5 個黃酮類化合物的含量，并計算回收率及RSD。

2.5 黃芪甲苷的含量測定

對照品溶液的制備、供試品溶液的制備及HPLC 條件參照《中國藥典》2020 年版黃芪項下黃芪甲苷的含量測定[1]，并對21批樣品進行測定。

2.6 水分測定

按照《中國藥典》2020 年版（四部）中水分測定法[17]（通則0832第二法）測定黃芪樣品中的水分。

2.7 數(shù)據(jù)處理

采用統(tǒng)SPSS 21.0 軟件分析黃芪中化合物的含量均值，并對數(shù)據(jù)是否服從正態(tài)分布進行檢驗。采用軟件GraphPad Prime 6 對恒山黃芪和參照黃芪中的化合物的含量進行t檢驗分析，繪制其含量柱狀圖，并對各化合物的含量進行受試者工作特征（ROC）曲線分析。采用Pearson 相關(guān)分析法分析化合物之間的相關(guān)性。將21 批恒山黃芪和參照黃芪中6 個成分的含量導入SIMCA-P 13.0 軟件進行多元統(tǒng)計分析。

3 結(jié)果

3.1 5個黃芪黃酮測定方法的建立

3.1.1 色譜條件的確立 在《中國藥典》2020 年版規(guī)定的毛蕊異黃酮葡萄糖苷的測定條件基礎(chǔ)上，洗脫時間延長至40 min，同時增加檢測波長230 nm，即可同時測定5 個黃芪黃酮成分，且分離良好。其中，毛蕊異黃酮葡萄糖苷和芒柄花苷在260 nm 下測定，黃芪紫檀烷苷、黃芪異黃烷苷和黃芪異黃烷在230 nm下測定（圖1）。

圖1 黃芪中5個黃酮類化合物的HPLC圖

3.1.2 方法學考察 專屬性考察結(jié)果表明，供試品溶液中其他成分對待測成分無干擾，分析方法專屬性良好，色譜圖見圖2。

圖2 空白溶劑、混合對照品及黃芪供試品溶液的HPLC圖

系統(tǒng)適用性試驗結(jié)果表明，5 個黃酮類化合物的N及R均符合《中國藥典》2020 年版要求。線性關(guān)系考察結(jié)果表明，5 個黃酮類化合物在各自質(zhì)量濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系（表2）。

表2 黃芪中5個黃酮類化合物含量測定方法的系統(tǒng)適用性試驗和線性關(guān)系考察結(jié)果

精密度試驗結(jié)果顯示，5 個黃酮類化合物日內(nèi)精密度的RSD 為0.15%～0.59%，日間精密度RSD為0.32%～1.75%，表明方法精密度良好。重復性試驗結(jié)果顯示，5 個黃酮類化合物含量的RSD 為0.62%～1.94%，表明方法重復性良好。穩(wěn)定性試驗結(jié)果表明，5 個黃酮類化合物峰面積的RSD 為0.49%～1.58%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

加樣回收試驗結(jié)果見表3。5個黃酮類化合物質(zhì)量分數(shù)為0.004%～0.125%，測定方法的加樣回收率為96%～107%，均符合《中國藥典》2020年版的規(guī)定。

表3 黃芪中5個黃酮類化合物加樣回收試驗結(jié)果

3.2 不同產(chǎn)地黃芪中黃酮類化合物含量分析

采用上述方法對21 批黃芪樣品進行分析，扣除水分后5 個黃酮類化合物的含量測定結(jié)果見表4?！吨袊幍洹?020 年版規(guī)定毛蕊異黃酮葡萄糖苷的質(zhì)量分數(shù)的限度為不低于0.02%，所有黃芪樣品均符合規(guī)定。21 批黃芪樣品中毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷、黃芪紫檀烷苷、黃芪異黃烷苷、黃芪異黃烷的質(zhì)量分數(shù)均值分別為0.064%、0.022%、0.021%、0.012%、0.012%。在21 批黃芪樣品中，除芒柄花苷外，其余黃酮類成分的含量波動均較大。此外，恒山黃芪中含量最高的黃酮為毛蕊異黃酮葡萄糖苷，除個別批次外，芒柄花苷、黃芪紫檀烷苷、黃芪異黃烷苷、黃芪異黃烷質(zhì)量分數(shù)也均在0.01%以上。

表4 黃芪中水分及6個化合物質(zhì)量分數(shù)測定結(jié)果 %

進一步采用統(tǒng)計學軟件SPSS 21.0 對兩組黃芪中5 個黃酮類化學成分的含量是否服從正態(tài)分布進行檢驗。由于樣本數(shù)（3≤n≤50）較小，選用W檢驗判斷是否服從正態(tài)分布。結(jié)果顯示，恒山黃芪、參照黃芪中5 個黃酮類成分的含量均符合正態(tài)分布（P＞0.05）。進一步對恒山黃芪與參照黃芪進行t檢驗分析，結(jié)果顯示恒山黃芪中毛蕊異黃酮葡萄糖苷、黃芪紫檀烷苷、黃芪異黃烷苷、黃芪異黃烷的含量顯著高于參照黃芪（P＜0.05），恒山黃芪中的芒柄花苷含量均值高于參照黃芪，但差異無統(tǒng)計學意義（圖3A～E）。

3.3 黃芪甲苷的含量分析

參照《中國藥典》2020 年版，對21 批黃芪樣品中的黃芪甲苷進行測定，扣除水分后其結(jié)果見表4?！吨袊幍洹?020 年版規(guī)定黃芪甲苷的質(zhì)量分數(shù)的限度為不低于0.08%，除了編號4 的恒山黃芪低于規(guī)定限度外，其余樣本均符合規(guī)定。21 批黃芪樣品中黃芪甲苷的質(zhì)量分數(shù)均值為0.16%。此外，恒山黃芪（P＞0.05）、參照黃芪（P＞0.05）中黃芪甲苷的含量均符合正態(tài)分布，t檢驗結(jié)果顯示，黃芪甲苷的含量在兩組中差異無統(tǒng)計學意義，但恒山黃芪中的黃芪甲苷含量均值高于參照黃芪（圖3F）。

圖3 恒山黃芪與參照黃芪中5個黃酮類成分及黃芪甲苷質(zhì)量分數(shù)比較（± s）

3.4 相關(guān)性分析

按照《中國藥典》2020 年版規(guī)定，黃芪項下只測定毛蕊黃酮葡萄糖苷、黃芪甲苷這2 個指標成分，因此通過Pearson相關(guān)分析現(xiàn)行含量測定指標與其他4 個黃酮類化合物之間的相關(guān)性（圖4）。相關(guān)系數(shù)的絕對值在0.8～1.0表示極強相關(guān)，0.6～0.8表示強相關(guān)，0.4～0.6 表示中等程度相關(guān)，0.2～0.4 表示弱相關(guān)，0～0.2 表示極弱相關(guān)或無相關(guān)。毛蕊異黃酮葡萄糖苷與黃芪紫檀烷苷（r=0.93）、黃芪異黃烷苷（r=0.86）之間呈極強相關(guān)，與芒柄花苷（r=0.47）、黃芪異黃烷（r=0.56）之間呈中等程度相關(guān)。黃芪甲苷與芒柄花苷（r=-0.56）呈中等程度相關(guān)，與黃芪異黃烷（r=0.27）之間呈弱相關(guān)，與黃芪紫檀烷苷（r=0.02）、黃芪異黃烷苷（r=0.05）無相關(guān)。此外，《中國藥典》2020年版的2個含量測定指標黃芪甲苷與毛蕊異黃酮葡萄糖苷（r=-0.19）呈極弱相關(guān)。因此，按照《中國藥典》2020 年版方法，單獨測定毛蕊異黃酮葡萄糖苷也可以間接反映黃芪紫檀烷苷和黃芪異黃烷苷這2 個成分的含量高低，但不能反映芒柄花苷、黃芪異黃烷的含量高低。

圖4 黃芪中毛蕊異黃酮葡萄糖苷和黃芪甲苷與其他4個黃酮類化合物的相關(guān)性分析

3.5 多元統(tǒng)計分析

為了進一步分析恒山黃芪和參照黃芪之間的質(zhì)量差異，以6 個成分的量為變量進行主成分分析（PCA）和偏最小二乘法-判別分析（PLS-DA）。在由主成分1（PC1，56.4%）和PC2（27.9%）構(gòu)建的散點圖（圖5A）中可以看出，恒山黃芪大多位于散點圖右半部分，而參照黃芪大多位于散點圖左半部分，說明恒山黃芪和參照黃芪的化學組成可能存在差異。進一步進行有監(jiān)督的PLS-DA（圖5B），模型驗證結(jié)果顯示（圖5C），2條回歸線斜率較大，左端任何一次隨機排列產(chǎn)生的矩陣解釋率參數(shù)（R2）、模型預測參數(shù)（Q2）均小于右端，說明原始模型的預測能力大于任何一次隨機排列Y變量的預測能力，證明模型有效，即恒山黃芪與參照黃芪之間的差異有統(tǒng)計學意義。

圖5 恒山黃芪和參照黃芪指標成分含量的PCA和PLS-DA

3.6 ROC曲線分析

將恒山黃芪和參照黃芪5 個黃酮類化合物和黃芪甲苷的含量數(shù)據(jù)導入GraphPad Prism 6 進行ROC曲線分析。ROC 曲線下面積反映判斷結(jié)果的準確性，曲線下面積越大說明結(jié)果越準確。毛蕊異黃酮葡萄糖苷、黃芪紫檀烷苷和黃芪異黃烷苷的曲線下面積分別為0.953 7、0.976 9、0.981 5，均大于0.9，說明可用于判別恒山黃芪和參照黃芪，其中黃芪異黃烷苷判別的可信度最高（表5）。

表5 黃芪中5個黃酮類化合物和黃芪甲苷含量的ROC曲線參數(shù)

4 討論

本研究首先通過5 個黃芪黃酮類成分的混合對照品溶液選擇最佳吸收波長，結(jié)果顯示，203、210、230 nm 下黃芪紫檀烷苷、黃芪異黃烷苷、黃芪異黃烷的響應(yīng)均較高，但203、210 nm 下基線不穩(wěn)定，因此選擇在230 nm 下檢測；而毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷在260 nm 下響應(yīng)較高，因此選擇在260 nm 下檢測。在《中國藥典》2020 年版黃芪中毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量測定方法的基礎(chǔ)上，不改變備樣方法和色譜洗脫條件，僅通過延長洗脫時間并增加1 個檢測波長，即可在毛蕊異黃酮葡萄糖苷準確測定基礎(chǔ)上增加其他4 個黃酮類成分的含量測定。與現(xiàn)有的黃芪黃酮多指標含量測定方法相比檢測時間短、液相梯度變化簡單，5 個黃酮類成分均在最大吸收波長下進行測定，可推廣用于黃芪藥材的質(zhì)量評價。對21 批黃芪的含量測定結(jié)果表明，恒山黃芪中毛蕊異黃酮葡萄糖苷、黃芪紫檀烷苷、黃芪異黃烷苷、黃芪異黃烷4 個黃酮類化合物的含量顯著高于參照黃芪，而芒柄花苷、黃芪甲苷含量略高于參照黃芪，但差異無統(tǒng)計學意義。ROC 曲線分析表明，毛蕊異黃酮葡萄糖苷、黃芪紫檀烷苷和黃芪異黃烷苷判別的可信度較高，可作為恒山黃芪的特征判別成分。在今后的研究中筆者將進一步增加黃芪樣品批次，確證恒山黃芪的化學特征。