陳 敏，鄭 潔，黃才歡，邱瑞霞，劉 洋，楊 楠，歐仕益，周康寧，2*

（1 暨南大學(xué)食品科學(xué)與工程系 廣州 510632 2 中南大學(xué)粉末冶金研究院 長沙 410083）

5-羥甲基糠醛（5-Hydroxymethylfurfural，5-HMF）是具有活潑醛基的呋喃類化合物，在食品中主要來源于熱處理、發(fā)酵等加工過程[1]，因而廣泛存在于蜂蜜、咖啡、干果、面包、果脯等食品中，在速溶咖啡粉和含焦糖類的食品中含量最高，達110～9 500 mg/kg[2]。在食品熱加工過程中，5-HMF的形成途徑主要有兩種：己糖在酸性環(huán)境下裂解的焦糖化反應(yīng)[3]和與氨基酸作用發(fā)生的美拉德反應(yīng)[4]。碳水化合物是形成5-HMF 的主要反應(yīng)底物。此外，一些多不飽和脂肪酸類、維生素等物質(zhì)在食品熱加工過程中也能發(fā)生化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生5-HMF[5-6]。

5-HMF 可以發(fā)生加氫、氧化脫氫、酯化、聚合、水解等反應(yīng)，化學(xué)性質(zhì)活潑，對人體具有毒副作用。Svendsen 等[7]發(fā)現(xiàn)，5-HMF 在細菌和人類細胞中引起遺傳毒性和誘變作用，并對大鼠結(jié)腸癌有促進作用；5-HMF 在人體內(nèi)可借助酶的催化作用發(fā)生磺化和氯化反應(yīng)[8]，進一步轉(zhuǎn)化為5-亞磺酰甲基糠醛（Sulfoxymethylfurfural，SMF）、5-氯甲基糠醛（Chloromethylfurfural，CMF）等強毒性物質(zhì)[9]，造成DNA 損傷，誘導(dǎo)染色體斷裂和畸變。Pastoriza 等[10]給大鼠灌喂5-HMF 后發(fā)現(xiàn)，在大鼠的白細胞、肝腎組織中均檢測到SMF-DNA 加合物，且其響應(yīng)值與灌喂5-HMF 的濃度呈正相關(guān)。5-HMF 被認為是一種食品內(nèi)源性有害物，具有遺傳、神經(jīng)毒性，影響人體的肝腎臟功能，在眼、呼吸道黏膜上也容易產(chǎn)生不良刺激[11]。聯(lián)合國食品添加劑專家委員會 （Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives，JECFA）通過急性和亞急性動物毒理實驗，建議每人每天攝入5-HMF 劑量不宜超過540 μg[12]。

富含糖、淀粉的食品在熱加工過程中極易產(chǎn)生5-HMF?；?-HMF 對人體的潛在毒害作用，控制食品中5-HMF 的形成和含量一直是食品從業(yè)者和科學(xué)研究者關(guān)注的熱點。食品中5-HMF 的形成受多種因素影響，如Pereira 等[13]和Fels-Klerx 等[14]的研究發(fā)現(xiàn)，糖和氨基酸的種類與添加量、熱加工溫度與時間以及pH 值等因素，均會影響5-HMF 的生成量。Vural 等[15]設(shè)計曲奇模擬體系，發(fā)現(xiàn)在pH 值較低的條件下，葡萄糖比果糖更易促進5-HMF 產(chǎn)生。李華等[16]研究發(fā)現(xiàn)迷迭香酸在中性和堿性條件下對5-HMF 有較強的抑制作用，而槲皮素和表兒茶素在中性條件下才能表現(xiàn)出抑制活性。工業(yè)上常采用代糖替換還原糖，調(diào)高pH 值，添加膨松劑、抗氧化劑等外源添加物，以及應(yīng)用真空加熱、紫外線照射等新型工藝技術(shù)措施抑制5-HMF 的產(chǎn)生[17-18]。

目前對焙烤食品中5-HMF 形成規(guī)律及影響因素的研究都基于面包、餅干等配方和工藝相對簡單的西式焙烤食品，而對中式焙烤食品的研究極少。中式焙烤點心在配料和制作工藝上與西式焙烤點心存在較大區(qū)別，工藝和配方往往更為復(fù)雜，如餡料需經(jīng)高溫炒制包餡再進行烘烤，然而這些復(fù)雜因素對產(chǎn)品中5-HMF 形成的影響尚缺乏研究，限制了我國特色熱加工食品中有害物控制技術(shù)的開發(fā)。

藍莓酥和鳳梨酥屬于我國傳統(tǒng)中式酥點，酸甜可口、風(fēng)味極佳，廣受民眾喜愛，是極具代表性的中式焙烤食品。近年來，由于藍莓抗氧化、抗衰老、抗癌、保護視網(wǎng)膜、預(yù)防非酒精性脂肪肝等各種生理功能的發(fā)現(xiàn)，以藍莓為主的新興小漿果成為消費熱點。藍莓富含花青素、黃酮、酚酸等多酚物質(zhì)，以及多糖和氨基酸等[19]，被聯(lián)合國糧農(nóng)組織列為“人類五大健康食品之一”，并且成為世界衛(wèi)生組織公布的十大健康食品中唯一的水果，以藍莓為原料或配料的各類食品，包括焙烤類食品的消費量增長快速。鳳梨中含有葡萄糖、果糖、有機酸和各種氨基酸，且富含維生素C、β-胡蘿卜素、蛋白酶等成分，也極具營養(yǎng)價值[20]。研究熱銷果酥中5-HMF 的含量水平和其在加工過程中的形成規(guī)律和影響因素，可為評估我國消費量巨大的傳統(tǒng)中式點心的有害物暴露水平，控制有害物風(fēng)險提供參考。基于此，本研究檢測了不同品牌的市售水果酥，分析藍莓酥與鳳梨酥餡料中5-HMF 的含量水平和兩種餡料的成分差異，探討水果餡料在高溫炒制和焙烤過程中5-HMF 的形成規(guī)律及影響因素，為中式糕點中內(nèi)源性有害物的控制方法及技術(shù)提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

藍莓，Camposol 農(nóng)業(yè)公司；鳳梨，都樂食品公司；5-羥甲基糠醛（98%），北京百靈威科技有限公司；甲醇、甲酸、乙腈（色譜純級），美國Mallinckrodt Baker 公司。

1.2 儀器與設(shè)備

精密電子天平，廣州市艾安得儀器有限公司；KDC-12 型低速離心機，安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；N-1100 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海愛朗儀器有限公司；STARTER300 型穿刺式pH 計，美國奧豪斯有限公司；LC-20AT 型效液相色譜分析系統(tǒng)，日本島津儀器公司；L-8900 型氨基酸分析儀，日本HITACHI 公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 水果酥樣品的制作

1.3.1.1 酥皮的制作 取黃油200 g，于料理盆軟化20 min 后加入60 g 糖粉，用電動打蛋器打發(fā)3 min，取4 個蛋黃逐個加入，每次打發(fā)30 s，混合完畢后打發(fā)2 min。將干料（低筋面粉260 g、奶粉40 g、杏仁粉40 g、鹽2 g）過篩加入盆中，混合后切分成18 g 的小面團，用保鮮膜包裹后冷藏備用。

1.3.1.2 餡料的制作 將550 g 去除35%水分的冬瓜碎與550 g 藍莓或鳳梨、160 g 糖、110 g 玉米糖漿、20 g 檸檬汁混合放入多功能料理機[21]中進行炒制：110 ℃下攪拌加熱20 min 后加入15 g 黃油，繼續(xù)攪拌加熱15 min，再加入10 g 玉米淀粉，最后加熱10 min，取出炒制后的餡料稱重記錄。餡料放置冷卻后，部分留樣（-20 ℃），其余餡料分成每份14 g 備用。

1.3.1.3 水果酥的制作 取18 g 酥皮包裹14 g 餡料，置模具中壓制成型，放入190 ℃預(yù)熱好的烤箱中，烤制20 min。取出水果酥，冷卻后，將酥皮和餡料剝離，分別留樣（-20 ℃）。

1.3.2 餡料中水分含量和pH 值測定 分別取藍莓酥餡料的原料混合物、炒制后餡料、烤制后餡料樣品約3 g，精確稱量后，放置在表面皿中，于110℃烘箱中烘干至恒重，測定樣品含水量。

分別取兩種餡料的原料混合物、炒制后餡料、烤制后餡料樣品，待穩(wěn)定至室溫后，用穿刺式pH計檢測餡料在制作過程中不同階段的pH 值。

1.3.3 餡料中5-HMF 的提取及測定 精確稱取餡料樣品約3 g 或原料混合物約6 g，加入15 mL 80%甲醇水溶液，渦旋提取5 min 后，于25 ℃下，10 000 r/min 離心10 min，取上清液，重復(fù)操作提取3 次；將收集的上清液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在40 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，濃縮至剩余1 mL 左右；將濃縮物用水溶解，移入5 mL 容量瓶，定容至5 mL。經(jīng)0.45 μm 微孔濾膜過濾后，參照Zou 等[22]的方法，采用HPLC對餡料中的5-HMF 進行定量測定：色譜柱為ZorbaxRSB-Aq C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），檢測器為SPD-M20A 光電二極管陣列檢測器；洗脫條件：流動相為5%甲醇，流速為0.6 mL/min，柱溫為40 ℃，檢測波長為284 nm。采用不同濃度的5-HMF 標準溶液繪制標準曲線。

1.3.4 餡料中糖的提取及測定 取0.5 g 水果酥餡料樣品或2 g 原料混合物，放入玻璃研缽中，加入2 mL 水，研磨均勻。將研磨液倒入10 mL 離心管中，重復(fù)3 次，將收集的研磨液超聲波提取20 min。在10 000 r/min、常溫下離心20 min，取上清液至10 mL 容量瓶中，定容至10 mL，得到糖的提取液。

糖測定：取提取液50 μL，用純水稀釋至最終濃度在標準曲線檢測范圍內(nèi)，經(jīng)0.45 μm 微孔濾膜過濾后，采用離子色譜法測定餡料水提液中的蔗糖、葡萄糖和果糖含量：色譜柱為Dionex CarboPacTMPA-10（4 mm×250 mm，5 μm）；檢測器為IntAmp 積分安培檢測器；洗脫條件：18 mmol/L NaOH 作為流動相，流速為0.8 mL/min，柱溫為30℃。分別用不同濃度的蔗糖、葡萄糖和果糖標準溶液，采用同樣方法測定繪制標準曲線。

1.3.5 餡料中氨基酸的提取及測定 氨基酸提取方法同1.3.4 節(jié)餡料中糖的提取方法。

氨基酸測定：取提取液1 mL，經(jīng)0.45 μm 微孔濾膜過濾后，參照游離氨基酸國標檢測標準[23]，用L-8900 氨基酸分析儀對餡料中16 種氨基酸含量進行分析。分析條件：進樣量20 μL；離子交換柱為磺酸型陽離子樹脂 （4.6 mm×60 mm，3 μm）；柱溫57 ℃；流動相流速0.35 mL/min；反應(yīng)柱溫度135 ℃；茚三酮反應(yīng)液流速0.3 mL/min；檢測波長分別為570 nm 和440 nm。采用不同梯度濃度的混合氨基酸標準溶液繪制標準曲線。

1.4 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)使用Microsoft Excel 軟件處理，采用SPSS 22.0 軟件進行方差分析，以平均數(shù)±標準差（±s）的形式表示，并在P=0.05 水平下進行Duncan's 顯著性差異分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 市售藍莓酥和鳳梨酥中5-HMF 的含量

本文分析了18 個市售品牌藍莓酥和鳳梨酥中5-HMF 的含量，結(jié)果如表1所示，藍莓酥（品牌1～14）餡料中5-HMF 的含量總體高于鳳梨酥（品牌15～18）中5-HMF 的含量。根據(jù)GB 7718-2011《食品安全國家標準 預(yù)包裝食品標簽通則》規(guī)定，各種配料應(yīng)按制造或加工食品時加入量的遞減順序排列。由表1可見，藍莓酥品牌1～6 餡料中的5-HMF 含量與鳳梨酥中5-HMF 的含量存在顯著差異（P<0.05），以純藍莓為餡料的藍莓酥品牌1中5-HMF 的含量高達（323.11±28.74 ）mg/100 g，約是鳳梨酥的12～19 倍（P ＜0.05）。藍莓酥品牌1和2 是藍莓添加量最多的兩個產(chǎn)品，相應(yīng)餡料中5-HMF 的生成量也最多。而隨著冬瓜配料的加入，5-HMF 的形成量顯著減少，未添加藍莓或添加量少的品牌9～14 藍莓酥中未檢出5-HMF。冬瓜是常用于制作水果酥的填充餡料，用以降低成本，提供果酥餡料良好的口感。由此推測，藍莓的物質(zhì)組成對5-HMF 的形成可能有較大影響。添加不同量的藍莓可能會造成餡料中糖類、氨基酸、多酚物質(zhì)品種與含量的差異，以及pH 值等條件的差異，從而影響5-HMF 的產(chǎn)生。

表1 市售藍莓酥與鳳梨酥餡料中5-HMF 的含量Table 1 The content of 5-HMF in fillings of commercial blueberry-filled pastries and pineapple-filled pastries

2.2 不同果酥餡料制作過程中5-HMF 的形成規(guī)律

基于藍莓某些成分引起果酥餡料中5-HMF含量升高現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)，本研究進一步以藍莓和鳳梨為材料，控制其它配料變量及制作工藝條件一致，驗證藍莓作為制作配料是否會導(dǎo)致果酥餡料中5-HMF 含量的升高。結(jié)果如表2所示，與市售藍莓酥和鳳梨酥餡料5-HMF 檢測結(jié)果一致，藍莓酥經(jīng)加工后，餡料中5-HMF 含量為14.34 mg/100 g，高于鳳梨酥餡料近4 倍（P<0.05）。冬瓜是市售果酥、月餅等中式糕點的常用餡料填充物。本試驗采用純冬瓜取代藍莓或鳳梨，檢測餡料經(jīng)炒制和焙烤后5-HMF 的含量，發(fā)現(xiàn)冬瓜酥餡料中的5-HMF 含量在制作不同階段均低于檢測限，因此鳳梨酥與藍莓酥餡料中5-HMF 的形成應(yīng)與鳳梨和藍莓的成分密切相關(guān)。本文也對酥皮進行了5-HMF 含量測定，發(fā)現(xiàn)其含量低于檢測限，說明酥皮在熱加工過程中5-HMF 的產(chǎn)生量極少。

為了解果酥餡料在制作過程中5-HMF 的形成規(guī)律，在餡料炒制后和烤制后分別取樣，分析引起5-HMF 形成的主要工藝階段。如表2所示，5-HMF 在原料混合物中均未檢出，藍莓餡料在炒制后5-HMF 的生成量達到12.81 mg/100 g，含量是鳳梨餡料的3.6 倍。兩種餡料的5-HMF 含量在后續(xù)的焙烤階段均變化不顯著（P ＞0.05），因此餡料中5-HMF 的形成主要發(fā)生在炒制階段，焙烤對其形成影響不大。所以在控制果酥中5-HMF 水平時，應(yīng)針對炒制工藝過程進行控制措施的研究和改良。

表2 藍莓酥與鳳梨酥餡料加工過程中5-HMF 的形成量Table 2 The generation of 5-HMF in blueberry and pineapple fillings during pastry preparation

2.3 加工過程中餡料的水分含量及pH 值變化

2.3.1 加工過程中餡料的水分含量變化 兩種果酥餡料在加工過程中水分含量變化趨勢一致。如圖1所示，在藍莓酥餡料整個制作過程中，含水量減少44.0%，主要發(fā)生在炒制階段，而在烤制過程中，含水量損失較小，與炒后餡料相比，損失18.9%（P ＞0.05），而與餡料的原料混合物相比，烤制過程中水分損失僅占9.5%。研究指出低水分活度可促進5-HMF 的產(chǎn)生[24]。

圖1 藍莓酥制作過程中餡料的含水量Fig.1 Moisture content of blueberry filling during pastry preparation

2.3.2 餡料的pH 值 如表3所示，藍莓酥和鳳梨酥餡料的pH 值相近，均偏酸性，且餡料的pH值在加工過程的各個階段變化不大，整體上鳳梨酥餡料的pH 值比藍莓酥略高。藍莓酥pH 值約為3，低于普通面包的pH 值，研究發(fā)現(xiàn)pH＜5 的體系環(huán)境會促進5-HMF 生成[24]，可以推測較低的pH值在一定程度上促進了藍莓酥中5-HMF 的產(chǎn)生。有研究顯示，向餅干中添加檸檬酸使pH 由4 降低至3 后，5-HMF 含量從10 mg/kg 迅速增長至220 mg/kg[17]，仍略低于藍莓餡料中測出的5-HMF水平。

表3 藍莓酥與鳳梨酥制作過程中餡料的pH 值Table 3 The pH values of the blueberry and pineapple fillings during pastry preparation

2.4 不同果酥餡料中糖含量的變化

由于藍莓酥餡料在制作過程中產(chǎn)生的內(nèi)源性有害物5-HMF 水平顯著高于鳳梨酥，本文通過分析比較兩種水果酥餡料中的成分區(qū)別及其在加工過程中的變化，以期分析導(dǎo)致兩種餡料內(nèi)源性有害物形成量差異的因素。表4為兩種水果酥在3個不同制作階段下，餡料中糖組成（果糖、葡萄糖和蔗糖）的含量變化。由表4可知，兩種水果餡料中所含糖的種類和含量差異較大：鳳梨餡料中蔗糖含量最高，比藍莓酥餡料蔗糖含量高71.1%；藍莓餡料中己糖含量顯著高于鳳梨餡料（P<0.05），其中葡萄糖含量是鳳梨酥的2.2 倍，果糖含量是其3.3 倍。由于己糖在酸性環(huán)境下加熱易發(fā)生焦糖化反應(yīng)產(chǎn)生5-HMF，推測藍莓中的高己糖含量是導(dǎo)致其餡料中5-HMF 含量高于鳳梨餡料的主要原因之一。

表4 加工過程藍莓酥與鳳梨酥餡料中糖的含量（mg/g）Table 4 Sugar content in blueberry and pineapple fillings during pastry preparation （mg/g）

兩種餡料在炒制過程中，蔗糖含量明顯降低（P<0.05）。餡料在料理機炒制過程中中心溫度高，受熱時間長，推測蔗糖在熱加工條件下分解產(chǎn)生果糖和葡萄糖[25]，而烤制過程餡料受熱時間短，中心溫度較低[26]，蔗糖降解幅度較小，鳳梨餡料中蔗糖含量在焙烤前后沒有顯著差別（P>0.05）。隨著蔗糖降解，鳳梨餡料在炒制過程中己糖含量增加，其中果糖含量增加61.4%，葡萄糖含量增加36.4%。然而，在藍莓餡料的炒制過程中，果糖和葡萄糖的含量并沒有隨蔗糖降解發(fā)生顯著性變化（P> 0.05），葡萄糖增加了8.3%，而果糖含量則降低了2.9%，推測原因是餡料的低pH 值促進蔗糖水解產(chǎn)物果糖和葡萄糖進一步轉(zhuǎn)化成了其它物質(zhì)，如5-HMF[27]。

2.5 水果酥餡料中氨基酸的含量

從表5可知，兩種餡料原料混合物中的氨基酸在種類上差別不大，鳳梨餡料中含有全部16 種氨基酸，藍莓餡料中含有除脯氨酸外其它15 種氨基酸，然而兩種餡料在各種氨基酸的含量組成上有所差異。兩種餡料中含量較高的氨基酸都是絲氨酸和谷氨酸，其它氨基酸含量相對較少，藍莓酥中絲氨酸含量是鳳梨餡料中的1.9 倍，谷氨酸的含量是鳳梨餡料中的1.2 倍，除絲氨酸、谷氨酸、天冬氨酸和精氨酸外，在藍莓餡料中的含量均低于鳳梨餡料。藍莓餡料的氨基酸總量為38.1 μg/g，略高于鳳梨餡料，但差異不顯著（P>0.05）。

表5 烘焙過程藍莓酥與鳳梨酥餡料中氨基酸的含量（μg/g）Table 5 Amino acid content in blueberry and pineapple fillings during baking （μg/g）

在制作過程中，兩種餡料中的氨基酸都有不同程度的減少。其中絲氨酸在熱加工時損失最多：藍莓餡料在炒制時幾乎損失了全部的絲氨酸，僅剩余6.6%，烤制后僅剩1.3%；鳳梨餡料中的絲氨酸相比藍莓餡料損失較少，在炒制后僅損失了30.5%，烤制結(jié)束后還剩余43.2%。Kavousi 等[28]報道絲氨酸可促進5-HMF 的形成，在模擬體系中添加絲氨酸，5-HMF 的形成量比單獨加熱果糖和葡萄糖分別增加了77.0%和23.0%，而在蔗糖體系中，添加絲氨酸使5-HMF 含量增加了近30 倍。此外，谷氨酸也被報道可顯著促進5-HMF 生成[29]。Zhang 等[27]的研究顯示，單獨加熱（105 ℃，4 h）蔗糖溶液，5-HMF 的生成量為0.3 mg/kg；而在蔗糖體系中添加谷氨酸后，5-HMF 生成量劇增至1 440.0 mg/kg。鳳梨餡料中的谷氨酸在炒制和烤制過程中變化不大，而藍莓餡料中的谷氨酸在炒制過程中損失了20.0%，烤制后剩余50.9%，其損失可能與這些氨基酸參與美拉德反應(yīng)有關(guān)。因此，藍莓餡料中的主要氨基酸絲氨酸和谷氨酸含量高于鳳梨酥餡料也可能是藍莓酥中5-HMF 形成量高的原因之一。

此外，烤制后鳳梨餡料中除了含量最高的絲氨酸減少超50%以外，其它氨基酸在熱加工過程中變化不大。而烤制后藍莓餡料中絲氨酸和谷氨酸分別降低98.7%和49.1%，除了這兩種氨基酸降低非常明顯外，亮氨酸、異亮氨酸、精氨酸等也有一定程度的減少，推測藍莓餡料的體系環(huán)境更有利于糖與氨基酸發(fā)生美拉德反應(yīng)[30]。

3 結(jié)論

本文通過比較鳳梨酥和藍莓酥的成分差異和變化，分析果酥餡料在熱加工過程中5-HMF 的形成規(guī)律及影響因素。結(jié)果表明：相比焙烤，開放體系下的高溫炒制是導(dǎo)致果酥餡料中產(chǎn)生5-HMF的關(guān)鍵工藝過程；在相同的制作條件下，藍莓酥餡料中5-HMF 的生成量顯著高于鳳梨酥，其含量是鳳梨餡料的3.6 倍，與市售藍莓酥與鳳梨酥的比較結(jié)果基本一致，這應(yīng)與藍莓餡料的成分組成及低pH 值環(huán)境有關(guān)；分析發(fā)現(xiàn)藍莓酥和鳳梨酥餡料的糖組成差異較大：鳳梨餡料中蔗糖比藍莓餡料高約70%，而藍莓餡料中還原糖含量明顯高于鳳梨酥，藍莓餡料中的還原糖易發(fā)生焦糖化反應(yīng)從而促進5-HMF 的形成；此外，藍莓酥餡料中氨基酸含量較鳳梨酥高，兩種餡料中主要的氨基酸絲氨酸和谷氨酸均具有促進5-HMF 的作用，在熱加工過程中均有減少，且在藍莓餡料中顯著減少，而在鳳梨餡料變化不大，說明藍莓餡料的體系環(huán)境更利于氨基酸與糖發(fā)生Maillard 反應(yīng)形成5-HMF。藍莓餡料相較于鳳梨餡料多酚類物質(zhì)含量高，且藍莓相較于鳳梨中獨有的花色苷類物質(zhì)對熱加工過程中5-HMF 形成的影響及機理尚不明確，還有待未來做進一步的研究。