劉祎璠 趙鑫鈺 欒惠雯 劉曉麗 李尊嶺

濱州醫(yī)學院基礎醫(yī)學院生物化學與分子生物學教研室，山東省腫瘤免疫治療研究創(chuàng)新團隊 山東 煙臺 264003

腫瘤免疫治療是重新啟動機體免疫系統(tǒng)識別并清除異常細胞，恢復機體正常免疫反應，進而控制腫瘤的一種治療手段[1]。目前，腫瘤免疫治療已經(jīng)成為晚期腫瘤患者的首選治療方式，其中靶向CTLA-4、PD-1和PD-L1的免疫檢查點抑制劑是臨床應用最多、適應癥最廣的腫瘤免疫治療藥物。只有20%的腫瘤患者能夠從腫瘤免疫檢查點抑制劑治療中受益，這表明，大多數(shù)腫瘤患者有非依賴于PD-1/PD-L1的免疫逃避機制[2]。

迄今為止，從人類蛋白組中鑒定出109個跨膜蛋白的胞內區(qū)域含有免疫受體酪氨酸抑制基序(immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif，ITIM)[3]，與配體結合后，ITIMs基序募集磷酸酶SHP-1、SHP-2或者SHIP-1，抑制免疫細胞的活性，因此將這109個膜蛋白統(tǒng)稱為免疫抑制受體[4]。本課題組前期應用生物信息學工具，篩選這109個免疫抑制受體在腫瘤組織中的表達，發(fā)現(xiàn)靶向免疫球蛋白超家族成員9(immunoglobulin superfamily member 9，IGSF9)幾乎在所有腫瘤細胞中表達較高。2018年，IGSF9首次被報道與癌癥有關。IGSF9與子宮肌層浸潤和預后不良有關，可作為子宮內膜癌的新生標志物，在診斷、預后和治療方面具有潛在的應用價值[5]。通過生物信息學分析，IGSF9可作為鼻咽癌的一種新的預后指標反映腫瘤異質性[6]，但IGSF9作為一種免疫抑制受體未見報道。本研究旨在制備靶向IGSF9的特異阻斷型單克隆抗體，并驗證其功能，為腫瘤免疫治療藥物的研發(fā)提供理論基礎和實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 THP-1細胞購自武漢普諾賽生命科技有限公司(STR驗證細胞正確)，健康供體T細胞購自All Cells。BALB/c小鼠購自北京維通利華實驗動物技術有限公司?？贵w純化柱購自碧云天生物技術有限公司，抗體濃縮柱購自Merck公司。Anti-human CD3-APC(Cat# OKT3, 1∶200，Biolegend)，anti-human CD8-PE(Cat# RPA-T8，1∶200，Invitrogen)，anti-human CD4-PE(Cat# OKT4，1∶200，Biolegend)，anti-Rabbit secondary antibody-Alexa Fluor 647(1∶1 000，Jackson Lab)購自Biolegend公司，anti-human IGSF9(Cat# orb1926，1∶200，Biorbyt)購自Biorbyt公司。

1.2 儀器 C6-Plus流式細胞儀購自美國BD公司，微量移液器購自Eppendorf公司，倒置顯微鏡購自日本Olympus公司，熒光顯微鏡購自Zeiss公司，高速低溫離心機購自美國貝克曼庫爾特公司。

1.3 IGSF9-ECD-His蛋白制備 將human-IGSF9基因合成，亞克隆至pcDNA3.1(-)表達載體。以構建好的human-IGSF9蛋白質粒為模板進行分子克隆獲得human-IGSF9-ECD蛋白質粒。設計目標蛋白序列，通過分子克隆構建新的表達載體，質粒提取，進行表達鑒定。將質粒瞬時轉染HEK293/CHO細胞，擴大培養(yǎng)。收集細胞上清，進行蛋白親和層析純化。純化的蛋白通過SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)和Western blotting驗證。配置8%凝膠；電泳；考馬斯亮藍染色；脫色液脫色。 配置10%凝膠；電泳；轉膜；封閉；一抗孵育(anti-His抗體 1∶2 000)；洗膜；二抗孵育；洗膜；曝光。

IGSF9-ECD-His目標蛋白序列(信號肽，C-His標簽)為：

1MVWCLGLAVLSLVISQGADGRGKPEVVSVVGRAGESVVLGCDLLPPAGRPPLHVIEWLRF61GFLLPIFIQFGLYSPRIDPDYVGRVRLQKGASLQIEGLRVEDQGWYECRVFFLDQHIPED121DFANGSWVHLTVNSPPQFQETPPAVL EVQELEPVTLRCVARGSPLPHVTWKLRGKDLGQG181QGQVQVQNGTLRIRRVERGSSGVYTCQASSTEGSATHATQLLVLGPPVIVVPPKNSTVNA241SQDVSLACHAEAYPANLTYSWFQDNINVFHISRLQPRVRILVDGSLRLLATQPDDAGCYT301CVPSNGLLHPPSASAYLTVLYPAQVTAMPPETPLPIGMPGVIRCPVRANPPLLFVSWTKD361GKALQLDKFPGWSQGTEGSLIIALGNEDALGEYSCTPYNSLGTAGPSPVTRVLLKAPPAF421IERPKEEYFQEVGRELLIPCSAQGDPPPVVSWTKVGRGLQGQAQVDSNSSLILRPLTKEA481HGHWECSASNAVARVATSTNVYVLGTSPHVVTNVSVVALPKGANVSWEPGFDGGYLQRFS541VWYTPLAKRPDRMHHDWVSLAVPVGAAHLLVPGLQPHTQYQFSVLAQNKLGSGPFSEIVL601SAPEGLPTTPAAPGLPPTEIPPPLSPPRGLVAVRTPRGVLLHWDPPELVPKRLDGYVLEG661RQGSQGWEVLDPAVAGTETELLVPGLIKDVLYEFRLVAFAGSFVSDPSNTANVSTSGLEV721YPSRTQLPGLHHHHHH

1.4 抗體的制備及篩選

1.4.1 免疫BALB/c小鼠 將Human-IGSF9-ECD-His蛋白與弗氏佐劑混合，皮下注射6周齡雌性BALB/c小鼠(50 μg/只)，每2周免疫1次，免疫4次后，采血，分離血清。

1.4.2 ELISA檢測小鼠血清效價 ELISA檢測小鼠血清針對Human-IGSF9-ECD-His蛋白的效價。

1.4.3 流式細胞儀檢測小鼠血清特異性 檢測小鼠血清與THP-1-igsf9-WT細胞和THP-1-igsf9-KO細胞結合能力。

多式聯(lián)運步伐加快。珠航局通過優(yōu)化多式聯(lián)運體系，推廣珠江三角洲集裝箱運輸“陸改水”工程，實施大宗貨物綠色運輸北江示范項目，不斷完善主要港區(qū)與干線鐵路、高等級公路的連接，打通港口集疏運“最后一公里”，加快推進鐵公水和江海聯(lián)運等多式聯(lián)運發(fā)展；研究建立西江航運干線船舶大氣污染物排放控制區(qū)，開展船舶排放控制區(qū)船舶污染監(jiān)測監(jiān)管能力建設。

1.4.4 T細胞共培養(yǎng)篩選阻斷型抗血清 常規(guī)培養(yǎng)THP-1細胞，計數(shù)后的細胞(2.5×104細胞/孔)用X-ray(28 Gy)進行照射。在10 % FBS的RPMI 1 640培養(yǎng)基中加入IL2和CD3/CD28 coated beads，重懸CFSE染色的正常人外周血CD3+T 細胞(5×104細胞/孔)，加入U型96孔板。分為陰性對照組、陽性對照組以及實驗組。在實驗組孔中加入小鼠血清，5 d后顯微鏡下觀察抗血清的阻斷效應。

1.4.5 細胞融合 取小鼠脾臟，制備成單細胞懸液，與骨髓瘤細胞等比例混勻，在融合池中電融合，加入HAT DMEM培養(yǎng)基，將細胞均勻鋪到96孔板中培養(yǎng)10 d后篩選檢測。

1.4.6 ELISA篩選融合細胞 ELISA篩選效價高的融合細胞上清。

1.4.7 流式細胞儀檢測融合細胞上清特異性 檢測ELISA篩選后的融合細胞上清與THP-1-igsf9-WT細胞的結合能力。

1.4.8 T細胞共培養(yǎng)篩選融合細胞 用加入IL2、CD3/CD28 beads和10 % FBS的RPMI 1 640培養(yǎng)基重懸正常人外周血CD3+T細胞，加入到U型96孔板陽性對照組，將human-IGSF9-ECD-His蛋白和融合細胞上清加入到相應實驗組孔，5 d后顯微鏡下觀察融合細胞上清的阻斷效應。

1.4.9 細胞亞克隆制備 4倍稀釋融合細胞懸液，均勻加入到96孔板中，7～10 d后挑出陽性單克隆細胞，擴大培養(yǎng)定株。

1.4.10 細胞亞克隆篩選 同融合細胞篩選步驟一致。

1.5 抗體的獲取、純化及濃縮

1.5.1 抗體獲取 將1×107篩選后的亞克隆細胞腹腔注射BALB/c小鼠，15 d左右取小鼠腹水，用0.2 μm濾器過濾，用結合緩沖液按照1∶1比例稀釋腹水。

1.5.2 平衡純化柱 用10倍柱體積的結合緩沖液平衡純化柱。

1.5.3 樣品結合 混勻稀釋的樣品，從純化柱的上端加入，重復2遍上樣。

1.5.4 洗滌 待樣品結合后，用20倍柱體積的結合緩沖液洗滌純化柱。

1.5.5 洗脫和中和 在收集管中加入中和緩沖液，按5倍柱體積的洗脫液洗脫結合的抗體。

1.5.6 純化柱再生 用5倍柱體積的洗脫液洗滌純化柱，用5倍柱體積的去離子水洗滌純化柱，最后保存在等體積的保存液中，4 ℃保存。

1.5.7 純化樣品檢測 將純化的蛋白用SDS-PAGE進行檢測。

1.5.8 抗體濃縮 將純化的抗體加入濃縮柱中，以5 000 rpm/min的轉速離心15 min，加入PBS置換。

1.6 ELISA檢測TNF-α和IFN-γ

1.6.1 TNF-α檢測 將所需試劑平衡到室溫，按要求準備試劑、工作標準品、樣品。將50 μL標準品和樣品加入相應的孔，每孔加入50 μL Antibody Cocktail，室溫孵育1 h，Wash Buffer PT 清洗每孔，加入TMB顯影液，避光孵育10 min，加入100 μL終止液，反應1 min，酶標儀450 nm處讀取OD值。

1.6.2 IFN-γ檢測 實驗前將所需試劑平衡到室溫，配置所需試劑及樣品。將100 μL標準品、樣品、對照溶液加入對應的孔，每孔加入50 μL生物素化的anti-IFN-γ，室溫孵育2 h。每孔加入Wash Buffer清洗，加入100 μL 1×Streptavidin-HRP，室溫避光孵育30 min。加入TMB顯色液，室溫避光孵育15～20 min。加入100 μL終止液，酶標儀450 nm處讀取OD值。

1.7 統(tǒng)計學方法 應用GraphPad Prism8進行統(tǒng)計學分析。定量資料采用t檢驗和方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 IGSF9-ECD-His蛋白的制備及鑒定 本研究制備了帶有His標簽的人IGSF9胞外區(qū)蛋白(human-IGSF9-ECD-His)。SDS-PAGE和Western blotting結果都表明：在100 KD有非常明顯的單一條帶，與預期蛋白分子量一致，總共獲取5 mg IGSF9-ECD-His蛋白(圖1A)；接下來，本研究向T細胞培養(yǎng)體系中，加入1 μg IGSF9-ECD-His蛋白，發(fā)現(xiàn)IGSF9-ECD-His蛋白能夠顯著抑制CD3+T細胞增殖(圖1B)。

A. Human-IGSF9-ECD-His蛋白的SDS-PAGE和Western blotting驗證結果；B. 活化的CD3+ T在含有10% FBS、IL-2和CD3/CD28 coated beads的1640培養(yǎng)基中與1 μg IGSF9-ECD-His蛋白孵育。Negative. 只有CD3+ T細胞；Positive. 加入IL-2和CD3/CD28 coated beads的CD3+ T細胞；T+IGSF9-ECD-His. 在加入IL-2和CD3/CD28 coated beads的CD3+ T細胞中加入Human-IGSF9-ECD-His蛋白。

2.2 小鼠抗血清效價篩選以及流式細胞儀檢測抗血清特異性 本研究取免疫4次后的BALB/c小鼠血清，ELISA結果顯示，抗血清效價為1∶364 500，這表明，5只小鼠都產(chǎn)生了高效價的抗體(表1)。

表1 鼠抗血清效價ELISA檢測結果

流式細胞儀檢測小鼠血清的特異性，結果顯示：5只小鼠血清都可以和THP-1-igsf9-WT細胞結合，而不與THP-1-igsf9-KO細胞結合(圖2A)。將抗血清加入T細胞和THP-1細胞的共培養(yǎng)體系中，結果顯示：5只小鼠血清都可以逆轉THP-1對T細胞的增殖抑制(圖2B)。這表明，5只小鼠的血清都具有明顯的阻斷效應。

A. 流式細胞儀檢測被免疫小鼠的血清與THP-1-igsf 9-WT和-igsf 9-KO細胞結合能力；B. 向加入IL-2和CD3/CD28 coated beads的CD3+ T細胞與輻照后的THP-1細胞共培養(yǎng)體系中加入小鼠的血清。Negative. 只有CD3+ T細胞；Positive. 加入IL-2和CD3/CD28 coated beads的CD3+ T細胞；THP-1+T cells. 在加入IL-2和CD3/CD28 coated beads的CD3+ T細胞與輻照后的THP-1細胞共培養(yǎng)；THP-1+T+serum. 在THP-1細胞和T細胞共培養(yǎng)體系中加入小鼠血清。

2.3 融合細胞上清的效價及特異性 本研究分離小鼠脾臟細胞，與多發(fā)性骨髓瘤細胞SP2/0進行融合，通過ELISA檢測，獲得了64株陽性細胞株。從64株ELISA檢測陽性的上清中，篩選可以用于流式檢測的上清，最終獲取6株陽性融合細胞的上清能夠用于流式細胞儀檢測(圖3A)，并且這6株融合細胞上清都能逆轉IGSF9-ECD對T細胞的增殖抑制(圖3B)。

A. 從64組ELISA陽性的細胞上清中篩選出可以和THP-1-igsf 9-WT細胞結合的6組陽性融合細胞上清；B. 將融合細胞上清加入Human-IGSF9-ECD-His蛋白與T細胞共培養(yǎng)體系中，驗證融合細胞上清阻斷效果。

2.4 單克隆細胞上清阻斷IGSF9介導的T細胞增殖抑制 本研究選擇克隆號5C3融合細胞進一步亞克隆，最終獲取5株亞克隆細胞的上清能夠結合THP-1-igsf9-WT細胞，克隆號分別是5C3-1A4，5C3-1B2，5C3-1C12，5C3-2B2，5C3-2B8。T細胞共培養(yǎng)結果顯示5株亞克隆細胞上清能夠逆轉IGSF9-ECD蛋白對T細胞的增殖抑制，其中5C3-1A4是阻斷型效果最好的一株單克隆細胞(圖4)。因此，本研究最終選擇5C3-1A4細胞制備靶向IGSF9的單克隆抗體。

A. 從5C3亞克隆細胞中獲得的單克隆抗體加入到Human-IGSF9-ECD-His蛋白與T細胞共培養(yǎng)體系中5 d后的顯微鏡下圖像；B～C. 流式細胞儀檢測CD3+ T細胞、CD8+ T細胞、CD4+ T細胞的增殖，CFSE的稀釋代表T細胞的增殖。

2.5 單克隆細胞上清促進T細胞分泌IFN-γ和TNF-α 本研究將IGSF9抗體(5C3-1A4)加入到T細胞和THP-1細胞共培養(yǎng)體系中，檢測上清中IFN-γ和TNF-α水平，結果顯示：IGSF9抗體顯著恢復了T細胞增殖，并且增加了IFN-γ和TNF-α水平(圖5)。

A. Anti-IGSF9和hIgG(human IgG)加入到T細胞和THP-1細胞共培養(yǎng)體系中5 d后的顯微鏡下圖像；B. ELISA檢測細胞上清中IFN-γ水平；C. ELISA檢測細胞上清中TNF-α水平。****P<0.0001。

3 討論

抗腫瘤免疫反應已成為癌癥免疫治療的基本策略。阻斷PD-1/PD-L1信號通路為腫瘤免疫治療從增強到正?；_啟了新時期[7]。在這個過程中，由于腫瘤微環(huán)境的復雜性，許多障礙阻礙了免疫正?；陌l(fā)展[8]，因此發(fā)現(xiàn)新的腫瘤特異性免疫檢查點并且揭示新的作用機制將是科研工作者和臨床醫(yī)師面臨的巨大挑戰(zhàn)。

IGSF9作為一種神經(jīng)粘附分子，表達在胚胎神經(jīng)系統(tǒng)，能夠抑制神經(jīng)突觸的發(fā)育[9]。本課題組在前期研究中闡明了IGSF9在腫瘤以及腫瘤浸潤的免疫細胞上的表達模式，發(fā)現(xiàn)了IGSF9在患者腫瘤標本中有表達，而在正常標本中沒有檢測到，本研究在荷瘤小鼠上觀察到了同樣的結果，所以本研究斷定在腫瘤微環(huán)境中，IGSF9能夠被未知的因子誘導，并且可以成為免疫治療正常化策略中新的免疫檢查靶點。IGSF9首次作為一個免疫抑制分子被報道，能夠通過抑制T細胞增殖促進腫瘤免疫逃避。當腫瘤發(fā)生時，PD-L1可以被IFN-γ誘導，PD-L1和T細胞上的PD-1相互作用進而抑制T細胞增殖，同時，IGSF9也被未知因子誘導，和T細胞膜表面的未知蛋白結合進而抑制T細胞增殖。所以，本研究假設，IGSF9促進腫瘤逃避的機制是否與PD-L1和PD-1相互作用機制有相似之處。

在過去的十年里，癌癥免疫治療取得了前所未有的進展。免疫檢查點抑制劑(ICIs)這一類新型藥物是癌癥免疫治療領域研究的重點。到目前為止，最廣泛使用的ICIs是靶向免疫抑制受體(如CTLA-4、PD-1和PD-L1)的阻斷抗體，能夠恢復患者免疫系統(tǒng)的抗腫瘤應答，延長患者生存期[10]。盡管一些患者經(jīng)過ICIs治療后，經(jīng)歷了顯著的腫瘤消退，但大多數(shù)患者對這些治療并無反應，甚至出現(xiàn)免疫相關的副作用[11]。在本研究中，anti-IGSF9作為一種新的免疫檢查點抑制劑，顯著恢復了T細胞增殖抑制，為腫瘤免疫治療藥物的研發(fā)以及臨床上的應用奠定了基礎。

隨著臨床試驗證明，聯(lián)合治療具有較好的無進展生存期和總生存期。Anti-PD-1或anti-PD-L1單藥療法已被批準用于10多種癌癥類型的治療[12]，客觀有效率為15%～20%[13]。Anti-PD-1和anti-CTLA4聯(lián)合應用用于晚期黑色素瘤、晚期非小細胞肺癌、腎細胞癌和結直腸癌的治療[14]，但腫瘤患者類型還存在一定的局限性，所以anti-IGSF9和anti-PD-1的聯(lián)用可能考慮成為今后癌癥免疫治療一項新的策略。

綜上所述，本研究制備了靶向IGSF9的單克隆抗體，并驗證了其可以恢復IGSF9對T細胞的抑制，并且anti-IGSF9和anti-PD-1的聯(lián)合應用可以考慮作為一種新的臨床治療策略。