沈媛媛 程 凱 張冉冉 劉成霞

1 濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院消化內(nèi)科 山東 濱州 256603;2 濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院甲狀腺外科 山東 濱州 256603

潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)的發(fā)病機制尚不明確，可能是遺傳易感性、由腸道菌群紊亂導(dǎo)致免疫炎癥激活和腸黏膜屏障受損引起的，在其機制研究中最常用的模型是葡聚糖硫酸鈉(dextransodiumsulfate，DSS)誘導(dǎo)結(jié)腸炎模型[1-2]。腸道常駐益生菌之一酪酸梭菌(Clostridiumbutyricum，CB)活菌及代謝產(chǎn)物短鏈脂肪酸(short chain fatty acids，SCFAs)具有以下作用：調(diào)節(jié)益生菌與致病菌的比例，保持腸道菌群平衡；為腸上皮細胞提供能量，促進腸上皮增殖及修復(fù)；調(diào)節(jié)免疫細胞的功能，維持機體免疫平衡。CB在腸易激綜合征、炎癥性腸病、糖尿病、腫瘤等疾病的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮其生物學(xué)效能[3-6]。腸道菌群中的脫硫弧菌(Desulfovibrio)在厭氧環(huán)境下可產(chǎn)生大量H2S，可破壞腸上皮完整性，在UC患者糞便中豐度明顯升高[7]。因此，本研究通過觀察CB對DSS結(jié)腸炎炎癥程度及腸黏膜屏障的作用，探討其對DSS結(jié)腸炎模型腸道菌群的影響，尤其是對脫硫弧菌可能的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 材料 30只健康6周齡雄性C57BL/6J小鼠，由濟南朋悅實驗動物繁育有限公司提供。本研究經(jīng)濱州醫(yī)學(xué)院動物倫理委員會審查通過。主要材料包括：DSS(分子量為36 000～50 000，MP biomedical公司)；CB活菌膠囊(國藥準(zhǔn)字號為S20040084，青島東海藥業(yè)有限公司)；MRS肉湯(貨號為M8540，Solarbio公司)；ZO-1 Rabbit pAb(貨號為A0659，ABclonal公司)、Occludin Polyclonal antibody(貨號為27260-1-AP，Proteintech公司)；TNF-α ELISA試劑盒(Millipore公司)。

1.2 方法 隨機將30只C57BL/6J小鼠分為3組，每組10只，在恒溫環(huán)境下飼養(yǎng)。根據(jù)文獻[8]，DSS結(jié)腸炎組和CB組小鼠均自由飲用3.5%(w/v)DSS溶液7 d，構(gòu)建DSS結(jié)腸炎模型。此后，CB組小鼠用108 CFU CB活菌混懸液灌胃處理7 d。CB混懸液由CB活菌膠囊粉末于MRS肉湯培養(yǎng)基中厭氧培養(yǎng)并傳代、純化，小鼠灌胃前，用0.9%生理鹽水稀釋菌液至108CFU/mL，具體制備方法見參考文獻[9]。正常對照組小鼠在常溫下常規(guī)飼養(yǎng)。

1.3 監(jiān)測指標(biāo) 每日記錄三組小鼠的體質(zhì)量、有無便血及大便性狀，按文獻[10]所述方法采用DAI評分。收集三組小鼠處理14 d后的新鮮糞便，16V3-V4區(qū)設(shè)計引物進行糞便微生物群落多樣性組成譜研究，由上海派森諾生物技術(shù)有限公司完成。取小鼠眼球血，靜置1 min，3 000 r/min離心10 min，取離心的上清按照ELISA試劑盒說明書進行檢測，用酶標(biāo)儀450 nm波長測定OD值，計算腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF-α)濃度。收集血清后，立即頸椎脫臼處死所有小鼠，快速取出結(jié)腸組織，記錄結(jié)腸長度，用4%多聚甲醛保存結(jié)腸組織后石蠟包埋切片，進行HE染色觀察組織炎癥程度，并采用免疫組化法測定組織中閉鎖小帶蛋白1(zonula occludens 1，ZO-1)(1∶400)和緊密連接蛋白Occludin(1∶400)含量。

2 結(jié)果

2.1 三組小鼠DAI評分和結(jié)腸長度的比較 與正常對照組相比，DSS結(jié)腸炎組小鼠在實驗后均出現(xiàn)活動減少、反應(yīng)遲鈍，DAI評分升高，P<0.05。與DSS結(jié)腸炎組小鼠相比，CB組小鼠DAI評分下降，P<0.05。實驗后解剖小鼠并測量結(jié)腸長度，與正常對照組小鼠相比，DSS結(jié)腸炎組小鼠的結(jié)腸長度縮短，P<0.05，而與DSS結(jié)腸炎組小鼠相比，CB組小鼠的結(jié)腸長度的結(jié)腸長度增加，P<0.05(表1)。

表1 三組小鼠DAI評分和結(jié)腸長度的比較

2.2 三組小鼠結(jié)腸組織學(xué)的變化 與正常對照組小鼠相比，DSS結(jié)腸炎組小鼠的結(jié)腸組織腺體損傷嚴重，隱窩結(jié)構(gòu)明顯異常，炎性細胞浸潤明顯。經(jīng)CB灌胃治療后，小鼠結(jié)腸組織炎性細胞浸潤減輕，損傷的腺體及異常的隱窩結(jié)構(gòu)減少(圖1)。

A. 正常對照組；B. DSS結(jié)腸炎組；C. CB組。

2.3 三組小鼠血清TNF-α濃度的比較 與正常對照組小鼠相比，DSS結(jié)腸炎組小鼠的血清TNF-α濃度升高，P<0.05。與DSS組相比，CB灌胃小鼠的血清TNF-α濃度降低，P<0.05(圖2)。

與正常對照組相比，*P<0.05；與DSS結(jié)腸炎組相比，#P<0.05。

2.4 三組小鼠結(jié)腸組織緊密連接蛋白ZO-1和Occludin的比較 與正常對照組相比，DSS結(jié)腸炎組小鼠緊密連接蛋白ZO-1和Occludin均表達下調(diào)。而經(jīng)CB活菌灌胃后，與DSS結(jié)腸炎組小鼠相比，CB組小鼠的結(jié)腸組織緊密連接蛋白ZO-1和Occludin均表達上調(diào)(圖3)。

圖3 三組小鼠結(jié)腸組織緊密連接蛋白ZO-1和Occludin表達的變化(×200)

2.5 三組小鼠糞便菌群的比較 與正常對照組小鼠相比，DSS結(jié)腸炎組小鼠糞便中脫硫弧菌屬(Desulfovibrio)豐度增加。而與DSS組相比，CB灌胃小鼠糞便中的脫硫弧菌屬豐度下降(圖4)。

圖4 三組小鼠糞便菌群物種組成熱圖

3 討論

UC是一種病因和發(fā)病機制尚未完全闡明的慢性復(fù)發(fā)性腸道炎癥，具有病程長、反復(fù)發(fā)作和進行性加重的特點。腸道慢性炎性反應(yīng)可導(dǎo)致中毒性巨結(jié)腸、腸梗阻及結(jié)腸炎相關(guān)性結(jié)腸癌(colitis-associated colorectalcancer，CAC)的發(fā)病，嚴重威脅人類健康和壽命[11]。近年來，隨著工業(yè)化及人們生活習(xí)慣的改變，UC的發(fā)病率逐年增高。關(guān)于通過DSS結(jié)腸炎模型探究UC的發(fā)病機制及藥物治療機制的研究也日益增多。UC患者的腸道菌群多樣性減少，有潛在保護作用的細菌亞種減少，而有致病作用的細菌亞種增多[12-13]。脫硫弧菌(Desulfovibrio)是腸道內(nèi)主要的硫酸鹽還原菌(sulphate-reducing bacteria，SRB)，有鞭毛結(jié)構(gòu)，在腸道厭氧環(huán)境下可產(chǎn)生大量H2S氣體。過量的H2S可競爭性抑制腸道內(nèi)環(huán)境中的短鏈脂肪酸(short chain fatty acids，SCFAs)含量，干擾腸上皮細胞能量代謝，從而破壞腸黏膜屏障，這可能是導(dǎo)致UC發(fā)病的重要機制。CB屬于腸道常駐益生菌，在厭氧狀態(tài)下可酵解產(chǎn)生大量酪酸、醋酸等短鏈脂肪酸，這些成分可快速通過腸黏膜屏障，為腸上皮細胞提供能量，并調(diào)控Akt/mTOR、TLR/MyD88等信號通路，促進腸上皮細胞增殖及修復(fù)，是益生菌治療UC的重要機制[14-15]。因此，研究CB調(diào)控脫硫弧菌為代表的腸道菌群改變對DSS結(jié)腸炎的作用機制有重要意義。

結(jié)腸長度和DAI評分是評估小鼠結(jié)腸炎炎癥程度的重要指標(biāo)。在本研究中，DSS結(jié)腸炎小鼠因結(jié)腸炎癥致結(jié)腸攣縮，而經(jīng)CB灌胃治療后，DSS結(jié)腸炎小鼠的結(jié)腸短縮程度下降。在CB灌胃處理DSS結(jié)腸炎小鼠后，DSS結(jié)腸炎小鼠的DAI評分下降，這些均提示CB活菌可以明顯減輕DSS小鼠的結(jié)腸炎癥程度。本研究觀察到DSS結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸隱窩大量破壞，且存在大量浸潤炎細胞，而經(jīng)CB灌胃后DSS結(jié)腸炎小鼠的結(jié)腸粘膜層炎細胞浸潤及隱窩破壞等病理表現(xiàn)均顯著改善。

免疫系統(tǒng)紊亂是UC重要發(fā)病機制之一。以巨噬細胞、單核細胞和樹突樣細胞為主的經(jīng)典固有免疫系統(tǒng)失衡和適應(yīng)性免疫系統(tǒng)激活可以大量釋放TNF-α、IL-6、IL-1β、iNOS、IL-12、IL-23等促炎細胞因子，誘導(dǎo)T細胞向Th1和Th17方向分化，識別TLR受體、激活NF-κB信號通路，促進炎癥發(fā)生、破壞腸上皮屏障完整性，使腸道菌群環(huán)境紊亂，這種變化在急性結(jié)腸炎模型中最為常見[16-17]。下調(diào)TNF-α等促炎因子或上調(diào)IL-10、EGF等抗炎因子能夠顯著改善結(jié)腸炎炎癥程度[18]。CB通過上調(diào)腸黏膜巨噬細胞中IL-10的表達來調(diào)控TLR/Myd88通路，并抑制急性結(jié)腸炎動物模型的炎癥反應(yīng)。本研究顯示，DSS結(jié)腸炎小鼠血清中TNF-α較正常對照組小鼠明顯增加，在CB活菌治療7 d后顯著下調(diào)了DSS結(jié)腸炎小鼠血清TNF-α的濃度。這提示，CB通過下調(diào)血清TNF-α水平顯著抑制了DSS結(jié)腸炎的炎癥程度。腸黏膜屏障破壞在UC的發(fā)病機制中具有重要作用。緊密連接蛋白主要由跨膜蛋白、外周膜蛋白和細胞骨架蛋白構(gòu)成，其作為腸黏膜屏障的重要組成部分，能夠調(diào)節(jié)腸黏膜屏障的通透性。ZO-1屬于外周膜蛋白家族，主要維持緊密連接蛋白復(fù)合體的完整性，而Occludin蛋白是跨膜蛋白的主要成員，能夠調(diào)控緊密連接蛋白的通透性、維持細胞極性[19]。DSS結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸組織中的ZO-1和Occludin蛋白水平均顯著下降。經(jīng)CB治療后，結(jié)腸組織中的ZO-1和Occludin蛋白則明顯上調(diào)，這提示，CB具有上調(diào)結(jié)腸緊密連接、保護腸黏膜屏障的作用，進而抑制DSS結(jié)腸炎的炎癥程度。

腸道菌群紊亂是UC發(fā)生發(fā)展的基礎(chǔ)。UC患者硫酸鹽還原菌含量較正常人群明顯升高，擾亂了腸道中乳酸和硫酸鹽代謝，侵襲性大腸桿菌、真菌增多。其代謝產(chǎn)物乙酸鹽和H2S含量增多，而這些代謝產(chǎn)物可促使腸上皮細胞發(fā)生凋亡，甚至癌變[20]。脫硫弧菌作為主要的硫酸鹽還原菌，是高通量測序中豐度較高的腸道菌群。本研究發(fā)現(xiàn)，與正常小鼠相比，脫硫弧菌在DSS結(jié)腸炎小鼠的糞便中含量增多，而CB處理DSS結(jié)腸炎小鼠后，小鼠糞便脫硫弧菌含量下降。因此，CB能夠抑制脫硫弧菌增殖，減少H2S，保護腸上皮細胞活力和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，從而發(fā)揮抑制DSS結(jié)腸炎的生物學(xué)作用。

綜上所述，CB可能通過下調(diào)脫硫弧菌屬，有效保護了結(jié)腸組織緊密連接蛋白ZO-1和Occludin，降低了血清促炎因子TNF-α含量，具有抑制DSS結(jié)腸炎的生物學(xué)活性。這為從調(diào)控腸道菌群角度治療UC提供了重要的理論依據(jù)，有很好的研究前景和社會效益。