葛學(xué)麗 陶雨凡 兀 琦 石中琪 張加余 王少平

濱州醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院 山東 煙臺(tái) 264003

被稱(chēng)為“血肉有情之品”的動(dòng)物類(lèi)中藥，在我國(guó)已有悠久的應(yīng)用歷史，并在中國(guó)醫(yī)藥寶庫(kù)中有著舉足輕重的地位。與植物藥相比，動(dòng)物藥成分更為復(fù)雜，由于動(dòng)物藥活性強(qiáng)、潛力大、療效高、應(yīng)用范圍廣等優(yōu)點(diǎn)，其需求量不斷增加，進(jìn)而導(dǎo)致大量混偽品充斥中藥材市場(chǎng)，嚴(yán)重的影響了臨床療效及其制劑的質(zhì)量[1-2]。因此，規(guī)范動(dòng)物藥治療評(píng)價(jià)，對(duì)中藥材市場(chǎng)具有重要的意義。

目前，守宮和制水蛭多收載于各省市中藥材標(biāo)準(zhǔn)和飲片炮制規(guī)范中，但僅限于來(lái)源、性狀和炮制方法等簡(jiǎn)單內(nèi)容。例如，1979年版《江西中藥炮制規(guī)范》僅規(guī)定了守宮的基原和炮制方法，2012年版《福建省中藥飲片炮制規(guī)范》則只在規(guī)定了基原、炮制方法和性狀鑒別檢查，質(zhì)量水平仍然偏低。在1986年版《北京市中藥炮制規(guī)范》中僅規(guī)定了制水蛭的性狀鑒別，2008年版新增了其基原、浸出物、炮制方法鑒別，質(zhì)量水平有待提高。為保證守宮和制水蛭的飲片質(zhì)量水平，亟需對(duì)其質(zhì)量控制方法進(jìn)行研究。本研究分別收集了來(lái)自全國(guó)不同產(chǎn)區(qū)的6批守宮和10批制水蛭樣品，從性狀、顯微特征、薄層鑒別、水分、灰分、酸不溶性灰分和醇浸出物含量等方面進(jìn)行研究，為進(jìn)一步完善提升守宮和制水蛭的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器與試劑 馬弗爐(上海YAMATO科技貿(mào)易有限公司F0510C)；電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海一恒科學(xué)有限公司DHG-9140A)；恒溫水浴鍋(常州德科儀器制造有限公司HH-6)；超聲波清洗機(jī)(上海比郎儀器制造有限公司BILON22-500C)；顯微鏡(北京科至達(dá)信息技術(shù)有限公司CX31RBSFA)；守宮對(duì)照藥材(批號(hào)為121734-201601，河北安國(guó)藥材市場(chǎng))；水蛭對(duì)照藥材(批號(hào)為121061-201806，安徽亳州仁中藥業(yè))；硅膠G薄層板(煙臺(tái)市化學(xué)工業(yè)研究所、青島海洋化工廠、美國(guó)merck公司)；所用試劑均為分析純。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)材料 守宮購(gòu)自河北安國(guó)藥材市場(chǎng)，藥材來(lái)源見(jiàn)表1，經(jīng)濱州醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院代龍教授鑒定為壁虎科動(dòng)物無(wú)蹼壁虎GekkoswinhoanaGüenlhe、多疣壁虎Gekkojaponicus(DumeriletBibron)或蹼趾壁虎GekkosublimatesGüenlhe的干燥全體。水蛭藥材購(gòu)自河北弘森藥業(yè)有限公司和安徽亳州仁中藥業(yè)，其來(lái)源見(jiàn)表1，經(jīng)濱州醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院代龍教授鑒定為水蛭科動(dòng)物螞蟥WhumaniapigraWhitman、水蛭HirudonpponicaWhitman或柳葉螞螨WhimaniaacranulataWhitman干燥全體的炮制品。

1.2 方法

1.2.1 性狀鑒別 采用《中國(guó)藥典》2020年版(四部)通則0212項(xiàng)下的鑒定方法，對(duì)守宮和制水蛭的形狀、大小、表面(色澤與特征)、質(zhì)地、斷面(折斷面或切斷面)及氣味等特征進(jìn)行觀察并描述。

1.2.2 顯微鑒別 分別將各批次守宮粉末和制水蛭粉末過(guò)四號(hào)篩，挑取少許置載玻片上，滴加10%水合氯醛試液進(jìn)行透化，加蓋玻片，置于生物顯微鏡下觀察。

1.2.3 薄層色譜鑒別 守宮參照《中國(guó)藥典》2020年版四部通則研究[3]，采用70%乙醇5 mL、50%乙醇5 mL、70%甲醇5 mL和50%甲醇5 mL做樣方法，使用不同型號(hào)廠家薄層板(青島海洋HSG板、煙臺(tái)江友HSH板和HSG板)和展開(kāi)劑(正丁醇-冰醋酸-水(3∶1∶1)，正丁醇-冰醋酸-水(6∶1∶1))以及不同點(diǎn)樣量(3、2、1 μL)進(jìn)行考察，最終所確定的薄層鑒別方法如下所示：取守宮粉末0.4 g置于錐形瓶中，加70%乙醇5 mL，超聲提取30 min，過(guò)濾，濾液作為供試品溶液。另取壁虎對(duì)照藥材0.4 g，同法制成對(duì)照藥材溶液。分別吸取上述溶液各3 μL，點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以正丁醇-冰醋酸-水(3∶1∶1)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，用上述展開(kāi)劑進(jìn)行二次展開(kāi)，取出，晾干，噴以茚三酮試液，在105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，置日光下檢視。

制水蛭參照《中國(guó)藥典》2020年版一部水蛭項(xiàng)下的鑒別方法[4]，本研究分別選取青島海洋、煙臺(tái)江友和默克的G系列預(yù)制薄層板作為點(diǎn)樣材料；采用環(huán)己烷-乙酸乙酯(4∶1)、正己烷-乙酸乙酯(4∶1)、正己烷-乙酸乙酯-水(8∶2∶1)作為展開(kāi)劑，分別點(diǎn)樣1、3、5和10 μL對(duì)制水蛭各批次飲片和水蛭對(duì)照藥材的樣品溶液進(jìn)行薄層試驗(yàn)進(jìn)行考察。最終確定了以下最佳鑒別方法：取制水蛭粉末1 g置于錐形瓶中，加乙醇5 mL，超聲處理15 min，過(guò)濾，取濾液作為供試品溶液。另取水蛭對(duì)照藥材1 g，同法制成對(duì)照藥材溶液。分別吸取上述兩種溶液各5 μL，點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以環(huán)己烷-乙酸乙酯(4∶1)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，分別置日光及紫外光(365 nm)下檢視。

1.2.4 浸出物、總灰分、酸不溶性灰分和水分含量的測(cè)定 浸出物、總灰分、酸不溶性灰分和水分含量測(cè)定分別參照《中國(guó)藥典》2020版(四部)通則下的醇溶性浸出物測(cè)定法、總灰分測(cè)定法、酸不溶性灰分測(cè)定法、水分含量測(cè)定法(烘干法)進(jìn)行測(cè)定。

2 結(jié)果

2.1 性狀鑒別 守宮呈扁平條狀，全長(zhǎng)10～12 cm，頭橢圓形而扁，有眼一對(duì)，頭體背面灰黑色或灰色，覆以粒鱗，胸腹面黃白色，被覆瓦狀鱗，尾基與體等長(zhǎng)，指、趾間無(wú)蹼跡或有蹼跡。氣味微腥。制水蛭呈不規(guī)則段狀、扁塊狀或扁圓柱狀，略鼓起，背部黑褐色，腹面棕黃色至棕褐。質(zhì)地酥脆，氣微腥，微香。

2.2 鑒別

2.2.1 顯微鑒別 守宮粉末棕黃色或棕褐色；可見(jiàn)的特征性顯微結(jié)構(gòu)主要有鱗片、橫紋肌、骨碎片、皮膚碎片等(圖1)。鱗片近無(wú)色，單個(gè)鱗片較大，呈多角形、類(lèi)圓形。有的布有細(xì)小粒狀物，多與皮膚碎片疊在一起。橫紋肌纖維較多，近無(wú)色或淡黃色，有細(xì)密橫紋，明暗相間，呈平行的波峰狀。骨碎片較多，無(wú)色或淡黃色，呈不規(guī)則形狀，表面有細(xì)小裂縫狀或針狀孔隙，骨陷窩呈裂縫狀、長(zhǎng)條狀或類(lèi)長(zhǎng)圓形，多為同方向排列。皮膚碎片呈淡黃色或棕褐色，表面觀細(xì)胞界限不明顯，布有棕色或棕黑色色素，聚集成星芒狀。制水蛭粉末為深褐色或深棕色；可見(jiàn)表皮細(xì)胞、纖維細(xì)胞、縱肌纖維細(xì)胞等特征性顯微結(jié)構(gòu)(圖2)。表皮細(xì)胞呈類(lèi)圓形或五邊形，色澤近黃色或無(wú)色，排列緊密，紋理清晰，不甚透明。纖維細(xì)胞的纖維長(zhǎng)短不一，成束或單個(gè)存在，透明?？v肌纖維細(xì)胞斷面清晰，細(xì)胞內(nèi)部中空，外層增厚，可見(jiàn)增厚紋理。

A.鱗片；B.橫紋??；C.骨碎片；D.皮膚碎片。

A.表皮細(xì)胞；B.纖維細(xì)胞；C.縱肌纖維細(xì)胞。

2.2.2 薄層色譜鑒別 于日光燈下進(jìn)行檢試，與守宮對(duì)照藥材比較，所收集的6批次守宮的薄層色譜中斑點(diǎn)清晰，且分離效果良好(圖3)。分別在日光及紫外光(365 nm)下檢試，所收集的制水蛭的供試品與對(duì)照藥材在相應(yīng)的位置上顯示相同顏色的斑點(diǎn)(圖4)。

1為對(duì)照藥材，2～7分別對(duì)應(yīng)樣品1～6供試藥材。

Z-6 為水蛭對(duì)照藥材，Z-1～Z-5分別對(duì)應(yīng)樣品Z-1～Z-5供試藥材，Z-7～Z-8分別對(duì)應(yīng)樣品Z-6～Z-10供試藥材

2.3 浸出物、總灰分、酸不溶性灰分、水分含量的測(cè)定 依照“1.2.3”法，測(cè)定6批守宮粉末樣品和10批制水蛭藥材粉末樣品的浸出物、總灰分、酸不溶性灰分、水分以及醇浸出物含量的測(cè)定結(jié)果(表1)。

表1 守宮和制水蛭水分、總灰分和酸不溶性灰分測(cè)定結(jié)果(n=3)

結(jié)果顯示：6批守宮和10批制水蛭的平均含水量分別為8.87%、8.94%，總灰分平均含量分別為16.96%、4.84%，酸不溶性灰分平均含量分別為0.39%、0.89%，醇浸出物平均含量分別為19.27%、25.03%。

依據(jù)上述結(jié)果，參照《中國(guó)藥典》2020年版，暫規(guī)定守宮水分不得超過(guò)10.0%，總灰分不得超過(guò)20.0%，酸不溶性灰分不得超過(guò)0.5%，醇溶性浸出物不得少于14.0%；制水蛭水分不得超過(guò)16.0%，總灰分不得超過(guò)7%，酸不溶性灰分不得超過(guò)1.5%，醇溶性浸出物不得低于15%。

3 討論

中藥壁虎又稱(chēng)守宮，為壁虎科動(dòng)物無(wú)蹼壁虎Gekko swinhoana Güenlhe等的干燥全體。早在宋朝趙佶所著《圣濟(jì)總錄》中就有關(guān)于守宮入藥的記載?！侗静菥V目》中記載守宮味咸、寒，有小毒，具有祛風(fēng)定驚、散結(jié)解毒的功效，可用于治療中風(fēng)癱瘓、手足不舉、歷節(jié)風(fēng)痛、風(fēng)痰驚癇、瘵瘍惡瘡、小兒疳痢和血積瘰等疾病?，F(xiàn)代研究表明，壁虎具有抗腫瘤、平喘、抗血栓形成和改善組織血液供應(yīng)等作用[5-7]。水蛭為水蛭科動(dòng)物螞蟥Whumania pigra Whitman、水蛭Hirudo npponica Whitman或柳葉螞螨Whimania acranulata Whitman的干燥全體，氣味咸、苦，有小毒，具有破血通經(jīng)、逐瘀消瘕之功[6]，主要用于用于治療血瘀經(jīng)閉、癥瘕痞塊、中風(fēng)偏癱和跌撲損傷。由于水蛭特殊的腥臭味，多將其炮制入藥，制水蛭作為水蛭的炮制品[7]，已廣泛應(yīng)用于臨床多種疾病，特別是在心腦血管疾病、慢性腎臟疾病和糖尿病等疾病的治療方面極具開(kāi)發(fā)潛力[10-13]。

由于部分動(dòng)物類(lèi)藥材價(jià)格較高，資源緊缺，目前動(dòng)物類(lèi)中藥常發(fā)生摻偽等情況。因此，本研究對(duì)來(lái)源于全國(guó)不同地區(qū)的守宮和制水蛭分別進(jìn)行性狀鑒別、薄層鑒別、水分、總灰分、酸不溶性灰分和浸出物含量測(cè)定考察，并初步制定出了它們的相關(guān)限度。通過(guò)本研究，一方面可為守宮和制水蛭的飲片生產(chǎn)、市場(chǎng)流通及其產(chǎn)品開(kāi)發(fā)提供檢驗(yàn)檢測(cè)依據(jù)，另一方面有助于為進(jìn)一步的守宮和制水蛭的藥用活性成分和藥理作用研究提供依據(jù)。

本研究發(fā)現(xiàn)，守宮可見(jiàn)的特征性顯微結(jié)構(gòu)主要有鱗片、橫紋肌、骨碎片和皮膚碎片等；制水蛭則可見(jiàn)表皮細(xì)胞、纖維細(xì)胞、縱肌纖維細(xì)胞等。采用顯微鑒別對(duì)守宮和制水蛭進(jìn)行粉末顯微鑒別，可在一定程度上彌補(bǔ)性狀鑒別的不足。薄層色譜研究表明，6批守宮和10批水蛭分別與守宮對(duì)照藥材和水蛭對(duì)照藥材具有相同的斑點(diǎn)，且分離度較好。通過(guò)研究所建立的薄層鑒別、水分、總灰分、酸不溶性灰分和浸出物含量測(cè)定作簡(jiǎn)單，準(zhǔn)確可靠，可用于守宮和制水蛭的質(zhì)量控制。

本研究的局限在于未進(jìn)行守宮和制水蛭中特征性相關(guān)成分的含量研究。其主要原因是動(dòng)物類(lèi)中藥研究水平普遍偏低，大多缺乏明確的且與藥效相關(guān)聯(lián)的指標(biāo)性成分。另一方面，盡管中國(guó)藥典2020年版針對(duì)水蛭活性蛋白建立了基于生物活性測(cè)定法，但本研究所涉及的制水蛭是水蛭藥材的燙制品，在炮制過(guò)程中蛋白質(zhì)會(huì)發(fā)生變性反應(yīng)，同時(shí)距離水蛭炮制的工藝標(biāo)準(zhǔn)化尚有一大段距離，導(dǎo)致基于生物活性測(cè)定法對(duì)制水蛭進(jìn)行質(zhì)量控制不合理。此外，由于所用批次較少，所擬定標(biāo)準(zhǔn)代表性不強(qiáng)。因此，在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中我們將會(huì)繼續(xù)累積數(shù)據(jù)進(jìn)一步完善該標(biāo)準(zhǔn)。