王文龍 劉郭琦 宋嬌嬌 于棟林 唐 娟 薛博元 黃玉梅

1 濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院口腔頜面外科 山東 濱州 256603；2 濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院口腔修復(fù)科 山東 濱州 256603

頭頸部鱗狀細(xì)胞癌(head and neck squamous cell carcinoma, HNSCC)是一種常見(jiàn)的頭頸部腫瘤，約占頭頸部腫瘤的90%。它常發(fā)生于口腔、口咽部和喉部，是一種病死率高達(dá)40%～50%的疾病[1-2]。世界范圍內(nèi)每年有超830 000人被診斷患有HNSCC，超過(guò)43 000人死于HNSCC[3]。HNSCC的治療方法包括手術(shù)切除、放療、化療、免疫治療、靶向治療等，但這些方法沒(méi)有顯著提高其5年總體生存率[4]。多數(shù)患者往往在癌癥晚期確診，并且治療效果及預(yù)后較差[5]。因此，明確HNSCC的發(fā)生發(fā)展機(jī)制，找出其特異性標(biāo)志物及通路，對(duì)HNSCC的早期發(fā)現(xiàn)及靶向和免疫治療具有舉足輕重的作用。

已有研究闡述了circRNAs的多種功能，如circRNA可以作為miRNA的內(nèi)源RNA(competing endogenous RNAs，CeRNA)，與其他RNA競(jìng)爭(zhēng)miRNA配對(duì)[6-7]。circRNA是前體mRNA(pre-mRNA)經(jīng)過(guò)直接反向剪接，將其5′剪接供體和3′剪接受點(diǎn)共價(jià)連接形成的單鏈環(huán)狀RNA，擁有比線性RNA更穩(wěn)定的共價(jià)閉環(huán)結(jié)構(gòu)，不受核糖核酸酶的影響，更耐降解?；趤?lái)源和結(jié)構(gòu)，circRNA主要分為外顯子circRNA、內(nèi)含子circRNA和外顯子-內(nèi)含子circRNA[8]。circRNA還可調(diào)節(jié)細(xì)胞核內(nèi)的轉(zhuǎn)錄以及與蛋白質(zhì)因子結(jié)合[9]。circRNA已被證明與人類多種疾病有關(guān)，包括癌癥、神經(jīng)退行性疾病和心血管疾病等[10-14]。

DEAD-box解旋酶5(DEAD-box helicases 5，DDX5)是一種通過(guò)ATP水解產(chǎn)生的能量催化雙鏈RNA解旋的酶，因其保守序列Walker B 基序中含有Asp-Glu-Ala-Asp(D-E-A-D)而得名[15]。DDX5最早被發(fā)現(xiàn)于猿猴病毒40T抗原的免疫交叉反應(yīng)過(guò)程中[16]。DDX5參與調(diào)節(jié)各種細(xì)胞RNA代謝發(fā)揮了重要作用，共同激活許多轉(zhuǎn)錄因子[17-19]。DDX5在多種癌癥中的異常表達(dá)影響了癌細(xì)胞發(fā)生發(fā)展，并且與預(yù)后、生存以及腫瘤分期等有顯著相關(guān)性[20-21]。

1 材料與方法

1.1 線上數(shù)據(jù)庫(kù)分析 通過(guò)線上數(shù)據(jù)庫(kù)Timer(http://timer.cistrome.org/)以及UALCAN (http://ualcan.path.uab.edu/index.html)預(yù)測(cè)DDX5人類多種惡性腫瘤，特別是頭頸部鱗癌，與鄰近正常組織的表達(dá)情況以及意義。

1.2 材料 于濱州醫(yī)學(xué)院口腔頜面外科術(shù)中切取標(biāo)本時(shí)分別留取大小約為3 mm×3 mm×3 mm的頭頸部鱗癌及對(duì)應(yīng)癌旁組織各5份，組織體積與RNAstore(樣本保存液)按照體積比1∶10保存，然后將所有樣本儲(chǔ)存于液氮中。本研究的實(shí)驗(yàn)程序和方案均經(jīng)濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。納入標(biāo)準(zhǔn)為：由我院病理科術(shù)后常規(guī)病理確診為HNSCC；為首次手術(shù)且術(shù)前未經(jīng)放療和(或)化療；患者知情同意。

1.3 RNA提取 使用Trizol試劑(Invitrogen/Thermo Fisher Scientific公司，美國(guó))從HNSCC和癌旁組織樣本中提取總RNA。使用NanoDrop ND-1000系統(tǒng)(Thermo Fisher Scientific公司，美國(guó))測(cè)量RNA表達(dá)水平。RNA完整性采用標(biāo)準(zhǔn)變性瓊脂糖凝膠電泳方法評(píng)估。

1.4 微陣列分析 利用5對(duì)癌組織和癌旁組織進(jìn)行微陣列分析，以便通過(guò)比較HNSCC和鄰近對(duì)照樣本來(lái)鑒定差異表達(dá)的circRNAs和mRNAs。根據(jù)Arraystar的標(biāo)準(zhǔn)程序進(jìn)行樣品制備和微陣列雜交。用RNaseR(Eicentre；Illumina，Inc.，美國(guó))消化總RNA以去除線性RNA并豐富circRNA。然后，利用隨機(jī)引發(fā)法(Arraystar Super RNA標(biāo)記試劑盒，Arraystar公司，美國(guó))擴(kuò)增富集的circRNA，并轉(zhuǎn)錄成熒光cRNA。將標(biāo)記的cRNA雜交到Arraystar Human circRNA Array V2(Arraystar公司，美國(guó))上。清洗載玻片后，使用安捷倫G2505C掃描儀(安捷倫科技有限公司，美國(guó))掃描陣列。采用安捷倫特征提取軟件(11.0.1.1版)用于分析采集的陣列圖像。mRNA使用Invitrogen SuperScript的ds-cDNA合成試劑盒，利用Oligo(dT)反轉(zhuǎn)引物(100 pmol)將5 μg總RNA反轉(zhuǎn)錄為雙鏈cDNA(ds-cDNA)。按照美國(guó)NimbleGen Systems公司的基因表達(dá)分析方案對(duì)ds-cDNA進(jìn)行標(biāo)記。取4 μg標(biāo)記的ds-cDNA，使用NimbleGen雜交體系在42°C條件下使熒光標(biāo)記的ds-cDNA與芯片雜交16～20 h，然后使用相應(yīng)洗脫液洗滌，最后使用Axon GenePix 4000B 微陣列掃描儀對(duì)芯片進(jìn)行掃描。隨后的數(shù)據(jù)處理使用R.中的limma軟件包進(jìn)行兩組之間表達(dá)的circRNA和mRNAs通過(guò)火山圖過(guò)濾進(jìn)行鑒定。HNSCC和相鄰對(duì)照組之間差異表達(dá)的circRNA和mRNAs通過(guò)折疊變化篩選。

1.5 功能富集分析 基因本體論(gene ontology，GO)項(xiàng)目提供了一個(gè)受控詞匯表來(lái)描述任何生物體中的基因和基因產(chǎn)物屬性(http://www.geneontology.org/)。GO分類涵蓋生物過(guò)程、細(xì)胞成分和分子功能。P值表示差異表達(dá)基因中GO術(shù)語(yǔ)富集的意義。京都基因和基因組百科全書(shū)(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG，http://www.kegg.jp)路徑分析用于收集路徑簇，涵蓋差異基因表達(dá)譜中的分子相互作用和反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)。P值表示與特定基因相關(guān)的通路的重要性。

1.6 OncomiR數(shù)據(jù)中關(guān)鍵miRNA數(shù)據(jù)的下載 OncomiR(http://www.oncomir.org/oncomir/)基于癌癥基因組圖譜(the cancer genome atlas，TCGA)數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)30種癌癥類型的腫瘤發(fā)展和進(jìn)展中的失調(diào)miRNA進(jìn)行預(yù)測(cè)。本研究將與HNSCC發(fā)生發(fā)展相關(guān)的miRNA納入分析(參數(shù)設(shè)置依次為Search by Cancer Type：Tumor Development；Select a significance threshold，P<0.05；Select a cancer type，HNSCC)。同時(shí)將差異倍數(shù)值大小前5位的circRNA與靶向結(jié)合位點(diǎn)的miRNA取交集，共同納入本次研究。用線上工具(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)畫(huà)韋恩圖，可視化miRNA交集結(jié)果。

1.7 建立ceRNA網(wǎng)絡(luò)圖 應(yīng)用線上數(shù)據(jù)庫(kù)Targetscan預(yù)測(cè)上述miRNA的靶 mRNA，將預(yù)測(cè)的結(jié)果與芯片所檢測(cè)到的差異mRNA取交集，構(gòu)建mRNA-miRNA關(guān)系對(duì)。保留上述預(yù)測(cè)circRNA-miRNA和mRNA-miRNA中共有的miRNA、mRNA和共同作用的circRNA。采用Cytoscape軟件構(gòu)建circRNA-miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

1.8 TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中頭頸部鱗狀細(xì)胞癌的數(shù)據(jù)分析 本研究通過(guò)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)下載了502例癌組織HNSCC患者臨床資料并納入研究，比較了DDX5的表達(dá)在癌組織中與患者的性別、TNM分期、臨床分期和腫瘤解剖部位的關(guān)系。

1.9 RNA 提取及qRT-PCR RNA提取采用的是通用型 RNA 提取試劑盒(艾科瑞生物工程有限公司，中國(guó))。根據(jù)制作商的說(shuō)明，從樣本中提取 RNA 樣本，并儲(chǔ)存于-80℃，存儲(chǔ)時(shí)間不超過(guò)半年。實(shí)驗(yàn)步驟均于超凈臺(tái)中無(wú)酶條件下進(jìn)行，使用 Evo M-MLV 反轉(zhuǎn)錄試劑盒Ⅱ(艾科瑞生物工程有限公司，中國(guó)) 對(duì)提取的 RNA 進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄獲得 cDNA，儲(chǔ)存于在-20℃。 使用 SYBR Green Pro Taq HS qPCR 試劑盒(艾科瑞生物工程有限公司，中國(guó))進(jìn)行 qPCR。每組樣品設(shè)3個(gè)獨(dú)立副孔。PCR 條件為：95℃下30 s，95℃下5 s，60℃下30 s，共 40個(gè)循環(huán)。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)兩次以上減少誤差。對(duì)于定量分析，使用2-△△Cq 方法計(jì)算 mRNA 的相對(duì)表達(dá)水平。DDX5引物：正向 5′-GCCATTCCTAGAGAGAGGCGA-3′；反向 5′-CCTTAGGAGCACCACCGTAGA-3′。β-actin：正向 5′-TGGCACCCAGCACAATGAA-3′；反向 5′-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-3′。

1.10 免疫組化 進(jìn)行組織層面相關(guān)蛋白表達(dá)情況的分析，石蠟切片均由濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院病理科完成，切片厚度在 3～5 μm，利用通用 SP 試劑盒(中杉金橋，中國(guó))進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。切片于65℃烤片，二甲苯脫蠟 15 min×3次，梯度酒精水化 10 min×6 次，EDTA 抗原修復(fù)，過(guò)氧化氫酶、山羊血清依次室溫孵育 10 min，一抗 37℃恒溫箱中孵育 1 h，生物素標(biāo)記山羊抗小鼠/兔 IgG 室溫孵育 15 min，辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液孵育 10 min，DAB 顯色，顯色過(guò)程于顯微鏡下進(jìn)行，顯色時(shí)間約15～30 s，蘇木素復(fù)染 1 min，鹽酸酒精分化 2～3 次，沖水反藍(lán)，中性樹(shù)膠封片，最終由兩名經(jīng)驗(yàn)豐富的病理科醫(yī)師進(jìn)行判讀結(jié)果。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用GraphPad Prism8軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。qRT-PCR 數(shù)據(jù)分析采用兩個(gè)獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行。CircRNA和mRNA的顯著差異表達(dá)水平采用FDR篩選進(jìn)行比較分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 circRNA、mRNA微陣列分析 本研究對(duì)5對(duì)HNSCC組織進(jìn)行circRNA、mRNA分析，共檢測(cè)到287個(gè)circRNAs，其中有146個(gè)上調(diào)circRNAs和141個(gè)下調(diào)circRNAs (P<0.05，差異倍數(shù)>1.5)。共有1 053個(gè)失調(diào)mRNA，其中有377個(gè)mRNAs高表達(dá)和676個(gè)mRNAs低表達(dá)(log2差異倍數(shù)>1.3，P<0.05)。將顯著上調(diào)和下調(diào)的mRNA表達(dá)繪制在火山圖上和散點(diǎn)圖(圖1A、B)，直接展示了兩個(gè)對(duì)照組之間被檢測(cè)的差異基因。聚類分析表明，circRNA在兩組間存在差異表達(dá)(圖1C)。由此可見(jiàn)，在HNSCC組織中，相較于配對(duì)的癌旁組織，mRNA、circRNA的表達(dá)譜是有差異的。

A. mRNA火山圖；B. mRNA熱圖；C. circRNA熱圖。

2.2 GO和KEGG富集分析 GO分析可以分為分子功能(molecular function，MF)、生物過(guò)程(biological process，BP)和細(xì)胞組分(cellular component，CC)三個(gè)部分。本研究應(yīng)用GO分析推斷差異的mRNA可能存在的分子功能。1 053個(gè)差異mRNA主要涉及的CC主要富集在“細(xì)胞外細(xì)胞器”“細(xì)胞外膜結(jié)合細(xì)胞器”“胞外囊泡外小體”“細(xì)胞外周”“質(zhì)膜”“膜的組成部分”等。主要涉及的MF主要富集在“外源性肽抗原的抗原加工和呈遞”“肽抗原結(jié)合”“核糖體的結(jié)構(gòu)成分”“核糖體的結(jié)構(gòu)成分”以及“抗原結(jié)合”等。主要涉及的BP主要富集在 “外源性肽抗原的抗原加工和呈遞”“肽抗原的抗原處理和呈遞”“系統(tǒng)過(guò)程”“G蛋白偶聯(lián)受體信號(hào)通路”“抗原處理和呈遞”以及“感覺(jué)知覺(jué)中化學(xué)刺激的檢測(cè)”等條目(圖2)。本研究采用KEGG富集通路分析差異mRNA所參與的功能，基于差異表達(dá)的mRNA進(jìn)行通路分析以推斷參與的通路。差異的mRNAs主要富集在“抗原處理和呈遞”“移植物抗宿主病”“自然殺傷細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性”(圖2)。

A～C分別為上調(diào)的mRNA在細(xì)胞組分、分子功能、生物過(guò)程中的前10個(gè)顯著性富集GO項(xiàng)；D～F分別為下調(diào)的mRNA在細(xì)胞組分、分子功能、生物過(guò)程中的前10個(gè)顯著性富集GO項(xiàng)。

2.3 與差異表達(dá)的circRNA結(jié)合的miRNA 本研究通過(guò)對(duì)差異表達(dá)的circRNA進(jìn)行閾值篩選，以P<0.01, FDR<0.1為閾值，選取了差異倍數(shù)值大小在前5位的circRNA(包括hsa_circRNA_102485、hsa_circRNA_014280、hsa_circRNA_402089、hsa_circRNA_036186、hsa_circRNA_404474)。然后，利用Arraystar自制的miRNA靶點(diǎn)預(yù)測(cè)軟件預(yù)測(cè)circRNA-miRNA關(guān)系對(duì)，選出前15個(gè)miRNA。接著，利用在線工具OncomiR篩選 HNSCC中腫瘤形成這一方面發(fā)現(xiàn)，與腫瘤形成、發(fā)展有關(guān)的miRNA共有371個(gè)。本研究通過(guò)與15個(gè)差異表達(dá)的miRNA取交集發(fā)現(xiàn)共有hsa-miR-103a-2-5p、hsa-miR-342-3p、hsa-miR-505-5p、hsa-miR-377-3p 4種miRNA(圖3)。

圖3 與差異表達(dá)的circRNA結(jié)合的miRNA篩選韋恩圖

2.4 miRNA-mRNA預(yù)測(cè) 本研究利用數(shù)據(jù)庫(kù)Targetscan對(duì)上述4種的差異miRNA預(yù)測(cè)其靶向的mRNA發(fā)現(xiàn)共有7 315個(gè)靶向的mRNA，再與本研究芯片中已篩選出的差異mRNA取交集發(fā)現(xiàn)共有75個(gè)的差異mRNA(圖4)，構(gòu)建了miRNA-mRNA關(guān)系對(duì)。

圖4 miRNA-mRNA預(yù)測(cè)篩選韋恩圖

2.5 構(gòu)建ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò) 本研究通過(guò)OncomiR、Targetscan數(shù)據(jù)庫(kù)與芯片預(yù)測(cè)取交集，分別得到circRNA-miRNA以及miRNA-mRNA關(guān)系對(duì)，利用Cytoscape軟件構(gòu)建及可視化1個(gè)由2個(gè)circRNA、4個(gè)miRNA和75個(gè)mRNA組成的ceRNA網(wǎng)絡(luò)圖(圖5)。

粉色圓點(diǎn)代表mRNA，黃色方塊代表miRNA，藍(lán)色箭頭代表circRNA。

2.6 DDX5在泛癌中的表達(dá) 本研究前期通過(guò)對(duì)Timer數(shù)據(jù)庫(kù)分析發(fā)現(xiàn)，與鄰近正常組織比較，多種廣泛類型人類腫瘤的DDX5 mRNA表達(dá)水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，在膀胱尿路上皮癌、乳腺浸潤(rùn)癌、膽管癌、結(jié)腸癌、食管癌、頭頸部鱗癌、腎嫌色細(xì)胞癌、肝細(xì)胞癌、肺腺癌、肺鱗癌、皮膚黑色素瘤、胃癌、甲狀腺癌、子宮內(nèi)膜癌中有顯著表達(dá)(圖6A)。值得注意的是， DDX5在HNSCC中的表達(dá)上調(diào)，P<0.05。UALCAN數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)顯示，與鄰近正常組織比較，HNSCC中的DDX5高表達(dá)，P<0.05(圖6B)。同時(shí)，本研究在上述ceRNA網(wǎng)絡(luò)圖中發(fā)現(xiàn)了DDX5的上游miRNA-103a-2-5p,circRNA-102485(圖6C)。

A. 研究所有TCGA腫瘤中DDX5基因在腫瘤和鄰近正常組織之間的差異表達(dá)情況，*P<0.5，**P<0.01，***P<0.001；B. 預(yù)測(cè)與鄰近正常組織比較，HNSCC中的DDX5高表達(dá)；C. 利用Cytoscape可視化miRNA-103a-2-5p-circRNA-102485-DDX5軸。

2.7 HNSCC中DDX5表達(dá)的臨床分子特征 本研究對(duì)基于TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)下載的512例HNSCC樣本進(jìn)行分析，通過(guò)基礎(chǔ)R包將FPKM(fregments per kilobase per million)格式的RNAseq數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換成TPM(transcripts per million reads)格式，并進(jìn)行l(wèi)og2轉(zhuǎn)化，通過(guò)中位數(shù)區(qū)分出DDX5高表達(dá)(n=251)和DDX5低表達(dá)(n=251)。本研究發(fā)現(xiàn)，DDX5的表達(dá)與患者的臨床分期(P<0.05)、性別(P<0.05)和腫瘤解剖細(xì)分(P<0.05)顯著相關(guān)，但是與TNM分期無(wú)相關(guān)性(表1)。

表1 HNSCC中DDX5表達(dá)的臨床分子特征

2.8 DDX5在HNSCC中差異表達(dá)的驗(yàn)證 DDX5在組織中的陽(yáng)性染色主要位于細(xì)胞質(zhì)，在細(xì)胞核中也有少量表達(dá)。與癌旁組織比較，DDX5在HNSCC組織中陽(yáng)性率相對(duì)較高(圖7A)。本研究還收集用于芯片分析的組織在內(nèi)的12對(duì)HNSCC樣本的RNA，采用qRT-PCR驗(yàn)證生物信息學(xué)分析結(jié)果。結(jié)果顯示，與癌旁組織比較，DDX5在HNSCC的表達(dá)增加，P<0.05(圖7B)。這與本研究中芯片分析和免疫組化結(jié)果是一致的。

A. 免疫組化法檢測(cè)HNSCC組織中的DDX5的表達(dá)(×100，×400)，黑箭頭表示癌旁組織，紅色箭頭表示癌組織；B. 癌及癌旁組織qRT-PCR結(jié)果，*P<0.05。

3 討論

在過(guò)去10年里，HNSCC最顯著的治療進(jìn)展是免疫療法的應(yīng)用。免疫療法基于以下前提，即癌癥需要免疫監(jiān)視、癌細(xì)胞表型和/或腫瘤微環(huán)境的改變才能逃避免疫系統(tǒng)并在臨床上表現(xiàn)出來(lái)。事實(shí)上，免疫系統(tǒng)被認(rèn)為是HNSCC的發(fā)展、建立和傳播的關(guān)鍵[22-23]。目前已有研究證明DDX5在HNSCC發(fā)生發(fā)展中的重要作用，但通過(guò)DDX5尋找上游靶基因以及發(fā)現(xiàn)DDX5及其上游基因構(gòu)成的信號(hào)通路在HNSCC發(fā)生發(fā)展中的作用的研究還未有進(jìn)展。因此,研究尋找HNSCC標(biāo)志物DDX5及其相關(guān)基因通路有助于深入了解該疾病，并及時(shí)進(jìn)行各種免疫療法和靶向治療。

環(huán)狀RNA(circRNAs)是真核生物中共價(jià)閉合的內(nèi)源性生物分子，具有組織特異性和細(xì)胞特異性表達(dá)模式，其生物發(fā)生受特定順式作用元件和反式作用因子調(diào)控。許多circRNA通過(guò)作為microRNA或蛋白質(zhì)抑制物，或調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)功能，或通過(guò)自身翻譯發(fā)揮重要的生物學(xué)功能[24]。盡管這些轉(zhuǎn)錄的環(huán)狀性質(zhì)使它們的檢測(cè)、定量和功能表征具有挑戰(zhàn)性，但高通量RNA測(cè)序和circRNA特異性計(jì)算工具的進(jìn)展推動(dòng)了鑒定circRNAs 方法的發(fā)展[25]。

本研究通過(guò)基因芯片篩選來(lái)鑒定circRNA、mRNA在樣本癌及癌旁組織中的表達(dá)譜，并通過(guò)ceRNA分析來(lái)評(píng)估circRNA-miRNA-mRNA的相互作用?；蛐酒Y選結(jié)果顯示，HNSCC組織以及癌旁組織共檢測(cè)到287個(gè)circRNAs，發(fā)現(xiàn)有146個(gè)上調(diào)circRNAs和141個(gè)下調(diào)circRNAs。另外，發(fā)現(xiàn)共有1 053個(gè)失調(diào)mRNA，其中有377個(gè)mRNAs高表達(dá)和676個(gè)mRNAs低表達(dá)。以差異倍數(shù)值大小在前五位選出hsa_circRNA_102485、hsa_circRNA_014280、hsa_circRNA_402089、hsa_circRNA_036186、hsa_circRNA_404474。接著對(duì)miRNA進(jìn)行重疊，篩選出hsa-miR-103a-2-5p、hsa-miR-342-3p、hsa-miR-505-5p、hsa-miR-377-3p。再對(duì)差異miRNA預(yù)測(cè)其靶向的mRNA，發(fā)現(xiàn)共有75個(gè)共同靶向的差異mRNA。本研究還構(gòu)建了ceRNA網(wǎng)絡(luò)圖，通過(guò)先前Timer以及UALCAN數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)DDX5 mRNA在HNSCC的表達(dá)是顯著上調(diào)的?？傊?，本研究發(fā)現(xiàn)了circRNA-102485-miRNA-103a-2-5p-DDX5軸。目前尚未有研究報(bào)道circRNA-102485、has-miR-103a-5p在腫瘤中的作用，尚需對(duì)其功能進(jìn)行進(jìn)一步研究。

DDX5作為一種ATP依賴性RNA螺旋酶，參與廣泛的生物過(guò)程，包括轉(zhuǎn)錄、翻譯、前體信使RNA加工或選擇性剪接，從而影響細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移、分化以及凋亡等，由此認(rèn)為，其與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[17, 21]。本研究先前發(fā)現(xiàn)，DDX5解螺旋酶在多種腫瘤中異常表達(dá)，且可作為乳腺癌、非小細(xì)胞肺癌、肝細(xì)胞癌、食管癌等的治療靶點(diǎn)[8, 17, 19, 26-27]。本研究借助芯片技術(shù)以及多種線上數(shù)據(jù)庫(kù)，利用Targetscan、OncomiR、Timer和UALCAN數(shù)據(jù)進(jìn)行挖掘，發(fā)現(xiàn)DDX5在HNSCC中是高表達(dá)且有意義，故在ceRNA網(wǎng)絡(luò)圖中發(fā)現(xiàn)了circRNA-102485-miRNA-103a-2-5p-DDX5軸。在骨肉瘤中，Circ-XPR1通過(guò)分泌miR-214-5p產(chǎn)生的吸附作用可以調(diào)節(jié)DDX5的表達(dá)，從而對(duì)骨肉瘤細(xì)胞的增殖產(chǎn)生影響，為治療相關(guān)靶點(diǎn)提供了基礎(chǔ)[28]。本研究發(fā)現(xiàn)，與癌旁組織比較，HNSCC中的DDX5 mRNA水平和蛋白水平都明顯上調(diào)。免疫組化發(fā)現(xiàn)，與癌旁組織比較，DDX5主要集中于癌巢，并且在qRT-PCR中DDX5在HNSCC的表達(dá)也相對(duì)上調(diào)，這也與本研究的芯片預(yù)測(cè)是一致的。DDX5作為一種共轉(zhuǎn)錄激活因子，與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子-3形成DDX5/STAT3軸，以控制腫瘤促進(jìn)因子的轉(zhuǎn)錄，包括成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β、基質(zhì)金屬肽酶-2、缺氧誘導(dǎo)因子、白細(xì)胞介素-6等，從而影響腫瘤生長(zhǎng)、集落形成、血管生成、癌細(xì)胞遷移[29]。DDX5在HNSCC中的高轉(zhuǎn)錄水平與臨床分期以及腫瘤的解剖部位有密切關(guān)系，因此，DDX5在HNSCC中可作為潛在的診斷生物標(biāo)志。與此同時(shí)，Xu等[30]發(fā)現(xiàn)DDX5可以作為生物治療肺癌的一個(gè)靶點(diǎn)，miR-431抑制了DDX5的表達(dá)，同時(shí)明顯抑制了肺癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移。DDX5在胃癌中的表達(dá)是顯著上調(diào)的，且與胃癌病理分期有密切關(guān)系[21]。DDX5作為組織特異性致癌分子的一種常見(jiàn)上游調(diào)節(jié)因子，為腸道疾病的治療提供了極好的靶點(diǎn)[31]。

綜上所述，本研究通過(guò)構(gòu)建DDX5-miRNA-circRNA網(wǎng)絡(luò)調(diào)控圖，揭示了DDX5在HNSCC中的表達(dá)是明顯上調(diào)的。DDX5在HNSCC中展示了其所參與的復(fù)雜的生理過(guò)程，具有成為HNSCC診斷的潛在生物標(biāo)記物的潛力，但仍需要進(jìn)一步的臨床以及基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證。本研究通過(guò)采用芯片技術(shù)以及線上數(shù)據(jù)庫(kù)的結(jié)合為HNSCC的研究機(jī)制和靶向治療提供了新的潛在靶點(diǎn)。