劉程煜，趙娟娟，王亞玲，李思雨，徐 衎，任栓成，高 東，唐 玲

400050 重慶，重慶醫(yī)科大學(xué)附屬康復(fù)醫(yī)院1；401331 重慶，重慶醫(yī)科大學(xué)附屬大學(xué)城醫(yī)院神經(jīng)科2；400038 重慶，陸軍軍醫(yī)大學(xué)(第三軍醫(yī)大學(xué))基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室3；400042 重慶，陸軍特色醫(yī)學(xué)中心醫(yī)學(xué)心理科4

應(yīng)激是機(jī)體處于各種不利情況下所表現(xiàn)出的一種狀態(tài)，這種狀態(tài)有助于機(jī)體在短時(shí)間內(nèi)處理各種突發(fā)事件。應(yīng)激涉及自主行為變化和神經(jīng)內(nèi)分泌(即下丘腦-垂體-腎上腺軸)系統(tǒng)的激活。在急性暴露于應(yīng)激事件中，個(gè)體除了表現(xiàn)出焦慮、恐懼等特定的行為變化外，其正常的睡眠覺醒行為受到明顯影響,包括入睡困難、早醒、睡眠片段化等睡眠障礙，從而增加失眠的風(fēng)險(xiǎn)。覺醒系統(tǒng)過度激活與應(yīng)激所致的睡眠障礙疾病密切相關(guān)。既往研究表明，下丘腦室旁核促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素神經(jīng)元、外側(cè)下丘腦神經(jīng)降壓素神經(jīng)元促食欲素神經(jīng)元等覺醒系統(tǒng)神經(jīng)元在應(yīng)激狀態(tài)下被激活，參與應(yīng)激條件下的覺醒調(diào)節(jié)。因此，研究急性應(yīng)激下涉及的大腦相關(guān)覺醒系統(tǒng)活動(dòng)的改變，有助于更好地闡明應(yīng)激導(dǎo)致的睡眠覺醒異常的神經(jīng)機(jī)制。

丘腦中線核團(tuán)是覺醒上行網(wǎng)狀激活系統(tǒng)的重要組成部分，包括丘腦室旁核(paraventricular thalamic nucleus，PVT)、中央內(nèi)側(cè)核(central medial thalamic nucleus，CM)、連接核(reuniens thalamic nucleus，Re)及菱形核(rhomboid thalamic nucleus，Rh)等。其中PVT位于丘腦中線核團(tuán)的背側(cè)，是控制覺醒的關(guān)鍵丘腦區(qū)域。激活PVT谷氨酸能神經(jīng)元可誘導(dǎo)從睡眠到覺醒的快速轉(zhuǎn)換，而抑制PVT可導(dǎo)致覺醒水平降低。PVT被認(rèn)為是整合應(yīng)激相關(guān)信號(hào)的重要節(jié)點(diǎn)，受各種應(yīng)激源強(qiáng)烈激活從而引起適應(yīng)性行為反應(yīng)。PVT向大腦多個(gè)區(qū)域發(fā)出廣泛投射，包括伏隔核、杏仁核、終紋床核和前額葉皮層等。值得注意的是，中央杏仁核(central amygdala，CeA)作為杏仁核信號(hào)的輸出核團(tuán)，在應(yīng)激、先天性恐懼和焦慮行為中發(fā)揮重要作用。然而，PVT-CeA通路在應(yīng)激過程中如何變化仍不清楚。

因此，本研究將野生型小鼠暴露于捕食者氣味——2,4,5-三甲基噻唑(2,4,5-trimethylthiazole，TMT)中，建立急性應(yīng)激模型，以揭示中線丘腦中參與急性應(yīng)激反應(yīng)的核團(tuán)及其與CeA的神經(jīng)通路。首先，我們?cè)贑eA注射逆行示蹤染料揭示中線丘腦對(duì)CeA的神經(jīng)投射特點(diǎn)。隨后通過c-Fos表達(dá)作為神經(jīng)元激活的標(biāo)志物，對(duì)中線丘腦相關(guān)核團(tuán)和杏仁核激活水平進(jìn)行量化。最后采用染料逆行標(biāo)記結(jié)合c-Fos染色及神經(jīng)通路特異性的光纖鈣信號(hào)記錄研究CeA投射-PVT神經(jīng)元在TMT刺激下的c-Fos表達(dá)模式和鈣活動(dòng)變化。本研究試圖明確PVT對(duì)CeA的投射是否構(gòu)成應(yīng)激反應(yīng)的神經(jīng)通路，從而有助于理解應(yīng)激源暴露時(shí)PVT涉及的神經(jīng)通路改變。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)健康雄性C57BL/6J野生型小鼠(8～12周齡，體質(zhì)量25～30 g)購(gòu)自陸軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。購(gòu)買后小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，飼養(yǎng)環(huán)境符合標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室條件，水和食物自由獲得。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程保持12 h光/暗循環(huán)。實(shí)驗(yàn)過程符合國(guó)家和有關(guān)單位實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理和使用的規(guī)定，盡可能降低小鼠的痛苦和數(shù)量。

1.1.2 主要試劑 兔多克隆抗c-Fos抗體(ab190289，1∶1 000，美國(guó)Abcam)、驢抗兔488熒光二抗(A-21206，1∶800，美國(guó)Invitrogen)、免疫染色封閉液(P0102，上海碧云天)、免疫染色一抗稀釋液(P0103，上海碧云天)、免疫染色二抗稀釋液(P0265，上海碧云天)、2,4,5-三甲基噻唑(T1068，上海化成工業(yè))、AAV-EF1α-DIO-GCaMp7b(PT-1423，武漢樞密)、AAV/retro-Syn-Cre(PT-0136，武漢樞密)、CTB555(C34776，1mg/μL，美國(guó)Lumaflouor)、RetroBeads(R180-1000，美國(guó)Lumaflouor)、核染料4，6-二脒基-2-苯基吲哚(Nuclear dye 4，6-Diamidino-2-phenylindole，DAPI，F(xiàn)6057，美國(guó)Sigma-Aldrich)。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物手術(shù) 野生型小鼠經(jīng)異氟烷充分麻醉后，將其頭部固定于腦立體定位儀上。剪去小鼠頭頸部毛發(fā)，消毒手術(shù)區(qū)，沿中線剪開頭皮，范圍以充分暴露顱骨前囟和后囟為宜。清理顱骨表面結(jié)締組織后，在手術(shù)顯微鏡下通過調(diào)整腦立體定位儀的雙側(cè)耳桿和鼻夾，使小鼠顱骨表面處于同一平面。參考第8版小鼠腦圖譜，確定注射坐標(biāo)PVT腦區(qū)(Bregma，AP=-1.20 mm；ML=0 mm；DV=-2.52 mm)、CeA腦區(qū)(Bregma，AP=-1.20 mm；ML=±2.80 mm；DV=-4.00 mm)。用顱骨鉆在小鼠目標(biāo)腦區(qū)上方鉆1個(gè)直徑約為1 mm的小孔。手術(shù)顯微鏡下看到腦組織表面后，清理周圍碎骨，挑開硬腦膜。用開口直徑約為20 μm的玻璃微電極將病毒或染料緩慢推進(jìn)至目標(biāo)腦區(qū)。停留5 min后開始注射，注射速度為30 nL/min。為了防止液體回吸，注射完成后將玻璃微電極留置10 min后再緩慢退出。消毒縫合創(chuàng)口，待小鼠復(fù)蘇后，單籠飼養(yǎng)。

對(duì)于光纖鈣信號(hào)記錄，小鼠注射病毒3周后進(jìn)行PVT光纖埋置，PVT 坐標(biāo)同病毒注射。當(dāng)光纖的尖端置于腦組織表面時(shí)，開始探測(cè)鈣信號(hào)。緩慢植入光纖，實(shí)時(shí)觀察鈣信號(hào)變化。下降深度約為2.80～2.90 mm，待鈣信號(hào)穩(wěn)定且信噪比大于5%后停止下降光纖。清除顱骨表面血液，用紫外固化牙科水泥在光纖周圍及顱骨表面均勻涂抹。待牙科水泥完全固定后， 消毒縫合創(chuàng)口。注射CTB555或RetroBeads逆行示蹤劑后，需讓其充分逆行標(biāo)記3～5 d后才進(jìn)行相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)。對(duì)于注射位點(diǎn)不準(zhǔn)確的小鼠，不納入統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.2 行為學(xué)實(shí)驗(yàn) 對(duì)于免疫熒光染色實(shí)驗(yàn)，將10 μL的TMT滴加到2 cm×2 cm濾紙上，隨后放入到實(shí)驗(yàn)小鼠的家籠里。對(duì)照組則是在相同大小的濾紙上將滴入等體積生理鹽水。1.5 h后灌注取腦，進(jìn)行免疫熒光染色；對(duì)于光纖鈣信號(hào)記錄，先將小鼠放到曠場(chǎng)里，適應(yīng)周圍環(huán)境3 min后，將滴有10 μL TMT的棉簽放在小鼠鼻子前面3 s，每只小鼠連續(xù)重復(fù)至少3次，記錄期間的鈣信號(hào)變化，并由頂端的紅外攝像頭所記錄。

在進(jìn)行行為學(xué)實(shí)驗(yàn)前3 d，每天將小鼠移至行為實(shí)驗(yàn)室，并對(duì)小鼠進(jìn)行10 min適應(yīng)性撫摸、提尾等操作。為了避免晝夜節(jié)律帶來的影響，所有行為學(xué)實(shí)驗(yàn)都在同一時(shí)間段進(jìn)行。

1.2.3 免疫組織化學(xué) c-Fos是一種即時(shí)早期基因，其產(chǎn)物c-Fos蛋白在各種因素刺激下常常表達(dá)增加，可作為神經(jīng)元激活的分子標(biāo)志物。對(duì)于c-Fos免疫熒光染色實(shí)驗(yàn)，在行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，小鼠經(jīng)異氟烷充分麻醉，用50ml磷酸鹽緩沖溶液(phosphate buffered solution，PBS)和50 mL 4%多聚甲醛溶液(paraformaldehyde，PFA)對(duì)小鼠進(jìn)行心臟灌注。取下大腦，放置于4%PFA中后固定6 h，隨后浸泡在30%蔗糖溶液中直至沉底。用冰凍切片機(jī)連續(xù)切片，厚度為30 μm。取每只小鼠相同層面的腦切片，先用PBS漂洗10 min×3次，隨后加入封閉液在室溫下封閉30 min，封閉完成后在一抗稀釋液中，按1∶1 000加入兔多克隆抗c-Fos抗體。4 ℃過夜，第2天用PBS漂洗10 min×3次，隨后加入驢抗兔488熒光二抗，室溫下孵育2 h，孵育結(jié)束后，用PBS漂洗10 min×3次，DAPI染色封片。GCaMp7b通過自身熒光識(shí)別，無需抗體標(biāo)記。用蔡司熒光顯微鏡拍攝目標(biāo)腦區(qū)，高分辨率圖像應(yīng)用 Zeiss LSM800 共聚焦顯微鏡拍攝。每只小鼠腦區(qū)取6張腦片進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

1.2.4 光纖鈣信號(hào)數(shù)據(jù)分析 使用Inper Technology提供的腳本以40 Hz記錄光纖鈣信號(hào)。光纖鈣信號(hào)的變化由ΔF/F=(F-F0)/F0公式計(jì)算。對(duì)原始數(shù)據(jù)采用基線矯正、噪聲扣除和濾波處理。使用最小二乘回歸法從488 nm信號(hào)中扣除410 nm信號(hào)。使用多項(xiàng)式擬合校正來減小長(zhǎng)期記錄造成的漂白效應(yīng)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)均以表示。使用GraphPad Prism 8.0.1軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。兩組間比較采用獨(dú)立樣本

t

檢驗(yàn)、配對(duì)

t

檢驗(yàn)。如果數(shù)據(jù)未通過Shapiro-Wilk正態(tài)性檢驗(yàn)，則采用非參數(shù)檢驗(yàn)。

P

<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 逆行染料示蹤顯示中線丘腦核團(tuán)中投射到中央杏仁核的神經(jīng)元

為研究丘腦中線核團(tuán)與CeA可能存在的神經(jīng)連接，利用逆行染料示蹤技術(shù)，在野生型小鼠CeA中注射CTB555，從而特異性追蹤投射到CeA的丘腦中線核團(tuán)。經(jīng)過3～5 d的表達(dá)后，對(duì)丘腦中線核團(tuán)的胞體及CeA的注射位點(diǎn)進(jìn)行檢驗(yàn)。

結(jié)果顯示，CTB555注射在CeA中且丘腦中線核團(tuán)的神經(jīng)元被CTB55標(biāo)記，這些被標(biāo)記的神經(jīng)元主要集中在第三腦室下方的PVT腦區(qū)，且沿PVT腦區(qū)前中后軸都有分布。此外，少數(shù)丘腦中線核團(tuán)投射到CeA的神經(jīng)元分布在CM、Rh/Re腦區(qū)中部(圖1)。這一結(jié)果表明存在丘腦中線核團(tuán)到CeA的投射，且主要為PVT投射到CeA。

A：CTB555注射示意圖；B：CTB555注射到CeA典型圖；C：小鼠CeA注射CTB555后逆追到丘腦中線核團(tuán)中神經(jīng)元(紅色)和DAPI(藍(lán)色)的代表性圖像，PVT、CM、Rh/Re區(qū)域，比例尺為100μm；右下：對(duì)PVT、CM、Rh/Re區(qū)域標(biāo)記到的神經(jīng)元進(jìn)行放大，比例尺為20μm

2.2 急性應(yīng)激對(duì)小鼠丘腦中線核團(tuán)及杏仁核的c-Fos表達(dá)影響

為研究丘腦中線核團(tuán)及杏仁核在急性應(yīng)激下的神經(jīng)元活動(dòng)模式，通過免疫熒光染色方法來構(gòu)建上述核團(tuán)在急性應(yīng)激下的c-Fos表達(dá)圖譜。急性TMT暴露90 min后，免疫熒光結(jié)果顯示：與生理鹽水組相比，小鼠急性暴露于TMT應(yīng)激下的丘腦中線核團(tuán)及杏仁核的c-Fos表達(dá)明顯增加(表1)。進(jìn)一步對(duì)中線丘腦核團(tuán)進(jìn)行分區(qū)發(fā)現(xiàn)，急性暴露于TMT應(yīng)激下，PVT腦區(qū)的c-Fos表達(dá)顯著增加(

P

<0.01)；CM、Rh/Re腦區(qū)的c-Fos表達(dá)水平有增加的趨勢(shì)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖2)。對(duì)杏仁核亞群進(jìn)行區(qū)分發(fā)現(xiàn)，急性暴露于TMT應(yīng)激下，CeA神經(jīng)元的c-Fos表達(dá)顯著增加(

P

<0.05)，而相鄰的基底外側(cè)杏仁核(basolateral amygdala，BLA)神經(jīng)元c-Fos表達(dá)無明顯變化(圖1)。

A:急性暴露于捕食者氣味應(yīng)激示意圖：B：小鼠急性暴露于生理鹽水和捕食者氣味后的c-Fos(綠色)和DAPI(藍(lán)色)免疫熒光染色的代表性圖像，標(biāo)記了PVT、CM、Rh/Re區(qū)域；C：根據(jù)第8版小鼠腦圖譜進(jìn)行c-Fos量化，在急性暴露于生理鹽水(黑色)和捕食者氣味(紅色)后，PVT、CM、Rh/Re中的c-Fos表達(dá)數(shù)量 a: P<0.01，與生理鹽水組比較

表1 急性暴露于捕食者氣味后小鼠丘腦中線核團(tuán)及杏仁核c-Fos表達(dá)

中線丘腦杏仁核組別nPVTCMRh/ ReBLACeA生理鹽水組4172.30±31.2329.75±8.85438.75±17.5271.00±33.1922.5±5.172捕食者氣味組4392.50±50.2852.00±15.5048.25±13.1679.25±12.4595.25±23.35統(tǒng)計(jì)值t(6)=3.721t(6)=1.247t(6)=0.1242t(6)=0.2328t(3.294)=3.042P值0.0098b0.25900.90520.82370.0494a

a: <0.05，b：<0.01，與生理鹽水組比較

A：小鼠急性暴露于生理鹽水和捕食者氣味后的c-Fos(綠色)和DAPI(藍(lán)色)免疫熒光染色的代表性圖像，標(biāo)記了BLA和CeA區(qū)域；B：根據(jù)第8版小鼠腦圖譜進(jìn)行c-Fos量化，在急性暴露于生理鹽水(黑色)和捕食者氣味(紅色)后，BLA和CeA中的c-Fos表達(dá)數(shù)量 a: P<0.05，與生理鹽水組比較

2.3 急性應(yīng)激對(duì)CeA投射-PVT神經(jīng)元c-Fos表達(dá)的影響

鑒于PVT與CeA的解剖連接和功能上的相關(guān)性，推測(cè)PVT-CeA通路可能在調(diào)節(jié)急性應(yīng)激過程中發(fā)揮重要作用。目前PVT-CeA通路是否參與急性應(yīng)激過程中尚未明確，因此本研究通過c-Fos免疫熒光染色方法結(jié)合逆行示蹤技術(shù)檢測(cè)PVT-CeA通路在急性應(yīng)激刺激下的激活程度。

在CeA腦區(qū)注射逆行示蹤劑RetroBeads，3～5 d后，將小鼠暴露于TMT應(yīng)激模式下，隨后對(duì)PVT腦區(qū)進(jìn)行c-Fos免疫熒光染色。對(duì)于注射位置準(zhǔn)確的小鼠，分別統(tǒng)計(jì)RetroBeads+神經(jīng)元的數(shù)量和c-Fos+/RetroBeads+神經(jīng)元的共標(biāo)百分比(圖4)。結(jié)果顯示，PVT-CeA通路中RetroBeads+神經(jīng)元在暴露于TMT氣味后被激活的比例顯著高于生理鹽水組(

P

<0.05)，表明CeA投射-PVT神經(jīng)元能被急性暴露于TMT刺激所激活。

2.4 急性應(yīng)激對(duì)CeA投射-PVT神經(jīng)元鈣活動(dòng)的影響

光纖鈣信號(hào)記錄技術(shù)可以瞬時(shí)反應(yīng)自由活動(dòng)小鼠腦區(qū)群體神經(jīng)元的鈣信號(hào)變化，因此我們通過檢測(cè)鈣信號(hào)的變化來表征神經(jīng)元的活動(dòng)，進(jìn)而實(shí)時(shí)研究神經(jīng)元活動(dòng)與動(dòng)物行為的相關(guān)性。

進(jìn)一步采用光纖鈣信號(hào)記錄的方法研究在體條件下，CeA投射-PVT神經(jīng)元集群的鈣信號(hào)在急性應(yīng)激狀態(tài)下的活動(dòng)模式。利用腦立體定位注射技術(shù)在野生型小鼠的PVT注射AAV-EF1α-DIO-GCaMp7b病毒，在雙側(cè)CeA注射AAV/retro-Syn-Cre病毒，從而特異性感染CeA投射-PVT神經(jīng)元。病毒表達(dá)3周后，在小鼠PVT上方埋置光纖，手術(shù)恢復(fù)1周后，進(jìn)行行為學(xué)實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，CeA投射-PVT神經(jīng)元被病毒感染并在胞體表達(dá)。小鼠暴露于生理鹽水前后，GCaMp7b熒光變化差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而小鼠暴露于TMT前后，GCaMp7b熒光在基礎(chǔ)波動(dòng)范圍內(nèi)顯著增加(

P

<0.01，圖5)。進(jìn)一步對(duì)比兩種刺激的ΔF/F值發(fā)現(xiàn)，急性暴露于TMT刺激的ΔF/F顯著高于暴露于生理鹽水的ΔF/F值(

P

<0.01)，表明急性暴露于TMT下，顯著激活了CeA投射-PVT神經(jīng)元。

A：RetroBeads注射示意圖; B：RetroBeads注射到CeA典型圖；C：小鼠c-Fos(綠色)和CeA投射-PVT神經(jīng)元(紅色)的代表性圖像，PVT區(qū)域；右下：對(duì)PVT區(qū)域共標(biāo)的神經(jīng)元進(jìn)行放大；D：根據(jù)第8版小鼠腦圖譜進(jìn)行c-Fos量化，在急性暴露于生理鹽水和捕食者氣味后，PVT-CeA神經(jīng)元(紅色)中的c-Fos表達(dá)百分比(黃色)。 a: P<0.05，與生理鹽水組比較

3 討論

應(yīng)激神經(jīng)通路的激活有助于動(dòng)物在不利的環(huán)境條件下啟動(dòng)生理和防御行為反應(yīng)。然而參與應(yīng)激的神經(jīng)通路長(zhǎng)期處于激活狀態(tài)對(duì)機(jī)體是有害的，能引起一系列神經(jīng)精神疾病，包括創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙、病理性焦慮、失眠等。因此，理解參與應(yīng)激的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，不僅可以促進(jìn)研究者對(duì)應(yīng)激狀態(tài)下內(nèi)部神經(jīng)通路調(diào)節(jié)的認(rèn)識(shí)，還有助于開發(fā)神經(jīng)精神疾病治療的新策略。PVT作為應(yīng)激反應(yīng)中覺醒調(diào)節(jié)的整合點(diǎn)，接受如下丘腦室旁核、腦干藍(lán)斑等在調(diào)控覺醒和應(yīng)激方面都至關(guān)重要腦區(qū)的大量投射。PVT的不同下游纖維投射對(duì)覺醒調(diào)控有著不同的作用，其中PVT-終紋床核通路參與調(diào)節(jié)饑餓應(yīng)激下的覺醒水平。值得注意的是，杏仁核是調(diào)控情感行為的重要樞紐，CeA作為杏仁核的主要輸出部位，整合應(yīng)激相關(guān)信息后輸出至下丘腦、腦干等腦區(qū)調(diào)控應(yīng)激反應(yīng)。PVT向CeA發(fā)出大量投射，目前大部分的PVT-CeA通路的研究集中在焦慮和恐懼行為上，PVT與 CeA的神經(jīng)結(jié)構(gòu)連接與急性應(yīng)激的關(guān)聯(lián)仍不清楚。因此，對(duì)PVT-CeA通路在急性應(yīng)激下的激活情況研究仍較少。

大多數(shù)嚙齒類動(dòng)物應(yīng)激模型都通過暴露于單一的應(yīng)激源來建立。TMT是一種模擬狐貍尿氣味的化合物，被廣泛用于嚙齒類動(dòng)物應(yīng)激模型的建立。嚙齒類動(dòng)物接觸TMT時(shí)，能引起焦慮和恐懼情緒的改變并觸發(fā)防御行為，因此捕食者氣味暴露是誘發(fā)嚙齒類

A：急性暴露于捕食者氣味同步光纖鈣信號(hào)記錄工作原理示意圖；B：AAV-EF1α-DIO-jGCaMp7b、AAV/retro-Syn-Cre病毒注射示意圖；C：jGCaMp7b-表達(dá)CeA投射-PVT神經(jīng)元及光纖埋置位置典型圖；D：急性暴露于捕食者氣味前后CeA投射-PVT神經(jīng)元鈣信號(hào)波形示意圖；E.急性暴露于捕食者氣味前后CeA投射-PVT神經(jīng)元鈣信號(hào)熱圖；F：定量分析急性暴露于捕食者氣味前后CeA投射-PVT神經(jīng)元集群鈣信號(hào)幅度變化百分比。a: P<0.01，與生理鹽水組比較；b：P<0.01，與暴露于TMT前比較

動(dòng)物應(yīng)激有效的方式之一。本研究將小鼠急性暴露于TMT中作為一種強(qiáng)烈的應(yīng)激范式。一些研究表明，TMT作為一種厭惡性刺激，而不是恐懼性刺激。事實(shí)上，與厭惡性氣味相比，TMT確實(shí)會(huì)引發(fā)防御行為，比如回避，防御性掩埋等。然而TMT作為單一的氣味分子可能不會(huì)引起與自然捕食者氣味相同的行為和神經(jīng)生物學(xué)反應(yīng)。因此，TMT暴露適合作為一個(gè)在嚙齒類動(dòng)物中誘發(fā)不可控應(yīng)激的模型。

本研究發(fā)現(xiàn)小鼠急性暴露于TMT應(yīng)激下，丘腦中線核團(tuán)中PVT腦區(qū)的c-Fos表達(dá)顯著增加；而在杏仁核中，CeA神經(jīng)元的c-Fos表達(dá)顯著增加，而BLA神經(jīng)元c-Fos表達(dá)無明顯變化。PVT作為丘腦中線核團(tuán)的一部分，在調(diào)節(jié)覺醒功能和應(yīng)激行為反應(yīng)方面發(fā)揮著重要作用。既往研究證明，嚙齒動(dòng)物PVT在不同類型的應(yīng)激條件下都能顯著激活。杏仁核作為邊緣系統(tǒng)一部分，與機(jī)體面對(duì)應(yīng)激反應(yīng)時(shí)產(chǎn)生的恐懼、焦慮情緒和防御反應(yīng)相關(guān)行為有關(guān)。研究表明，應(yīng)激情況下會(huì)引起特定杏仁核亞群長(zhǎng)期形態(tài)和功能的改變。然而，在SOTNIKOV等研究中發(fā)現(xiàn)小鼠暴露于TMT中主要在BLA中c-Fos表達(dá)增加，而對(duì)CeA中的c-Fos表達(dá)無明顯影響。本研究結(jié)果與上述研究之間的差異可能是由于小鼠品系不同，應(yīng)激源暴露和組織取材的時(shí)間不同造成的差異。首先，不同品系的小鼠對(duì)同一應(yīng)激源可導(dǎo)致不同的內(nèi)分泌和行為反應(yīng)；此外，本研究將小鼠急性暴露于TMT中60 min后立刻取材，盡管c-Fos蛋白染色常用于作為一種標(biāo)記神經(jīng)元激活的方法，但該技術(shù)存在一定的時(shí)間局限性。c-Fos蛋白從開始表達(dá)到表達(dá)高峰需要一定的時(shí)間。一方面，盡管c-Fos水平越高表明激活程度越高，但某些神經(jīng)元中c-Fos的表達(dá)缺失并不一定意味著激活的缺失。另一方面，無法確定在c-Fos誘導(dǎo)之前及誘導(dǎo)期間，一些其他行為或內(nèi)在狀態(tài)對(duì)c-Fos表達(dá)帶來的偏倚。這些實(shí)驗(yàn)方法的不同可以解釋本研究結(jié)果與其他研究結(jié)果之間的差異。值得注意的是，本研究結(jié)果與其他一些研究一致，JANITZKY等研究發(fā)現(xiàn)，野生性C57小鼠急性暴露于TMT應(yīng)激下，CeA腦區(qū)c-Fos表達(dá)顯著增加。而在YANG等研究中發(fā)現(xiàn)TMT暴露可特異性誘導(dǎo)小鼠PVT、CeA腦區(qū)大量c-Fos表達(dá)，而對(duì)BLA無明顯影響。此外，本研究采用時(shí)間分辨率更高的光纖鈣信號(hào)記錄技術(shù)來研究CeA投射-PVT神經(jīng)元對(duì)急性暴露于TMT的激活情況，且研究結(jié)果與上述等人c-Fos實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，進(jìn)一步表明丘腦室旁核、中央杏仁核過度活躍與急性暴露于TMT應(yīng)激有關(guān)。

本研究表明，丘腦中線核團(tuán)中大量PVT神經(jīng)元投射到CeA。一些研究發(fā)現(xiàn)，與BLA相比，PVT神經(jīng)元主要投射到CeA，且PVT可調(diào)節(jié)CeA神經(jīng)元的興奮性從而影響恐懼抑郁樣行為。本研究中，急性暴露于TMT下引起PVT、CeA明顯的c-Fos激活，提示該應(yīng)激下可能通過激活PVT神經(jīng)元及其投射到CeA的神經(jīng)末梢，從而直接激活CeA的神經(jīng)元起作用。鑒于PVT-CeA通路的解剖基礎(chǔ)，且CeA和PVT在功能上的相關(guān)性，PVT與CeA的神經(jīng)通路活動(dòng)變化在急性TMT應(yīng)激狀態(tài)下仍不清楚。本研究利用免疫熒光染色和光纖鈣信號(hào)記錄實(shí)驗(yàn)，研究PVT-CeA通路在急性TMT應(yīng)激狀態(tài)下的激活程度。結(jié)果表明，CeA投射-PVT神經(jīng)元能被急性暴露于TMT刺激激活，鈣信號(hào)記錄實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了這一點(diǎn)，提示該通路密切參與急性TMT應(yīng)激過程。

值得注意的是，本研究工作仍存在一定的局限性。CeA中主要由γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)能神經(jīng)元組成，這些GABA能神經(jīng)元表達(dá)多種肽類物質(zhì)。如促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(corticotropin-releasing factor，CRF)、蛋白激酶C-δ、生長(zhǎng)抑素(somatostatin，SOM)或神經(jīng)降壓素等。已知PVT與CeA-SOM和CeA-CRF神經(jīng)元形成突觸聯(lián)系，但在急性暴露于TMT應(yīng)激研究中本研究未對(duì)PVT-CeA通路中具體的分子標(biāo)志物進(jìn)行驗(yàn)證，這需要我們進(jìn)一步的研究。其次，本研究主要在雄性小鼠上進(jìn)行研究，沒有驗(yàn)證雌性小鼠急性暴露于TMT應(yīng)激時(shí)對(duì)PVT-CeA通路的影響。應(yīng)激反應(yīng)具有性別二態(tài)性，提示雌性小鼠在未來相關(guān)工作中的重要性。此外，本研究未使用光遺傳學(xué)、化學(xué)遺傳學(xué)等技術(shù)手段來驗(yàn)證PVT-CeA通路的功能充分性和必要性。

綜上所述，本研究結(jié)果表明PVT-CeA通路在急性暴露于TMT應(yīng)激反應(yīng)中被激活，PVT到CeA神經(jīng)通路的詳細(xì)解析將為壓力應(yīng)激相關(guān)疾病的發(fā)生發(fā)展提供理論依據(jù)和新的治療策略。