李 敏，楊 前，劉亞軒, 3，皮會(huì)豐，刁 波

430000 湖北 武漢，中部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室1；430000 湖北 武漢，中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤發(fā)生與干預(yù)湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室2；510515 廣東 廣州，南方醫(yī)科大學(xué)，廣州3；4000384 重慶，陸軍軍醫(yī)大學(xué)軍事預(yù)防醫(yī)學(xué)系軍隊(duì)勞動(dòng)衛(wèi)生學(xué)教研室4；4000384 重慶，電磁輻射醫(yī)學(xué)防護(hù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室5

重金屬元素鎘(Cadmium, Cd)是一種毒性非常大的工業(yè)和環(huán)境污染物。由于其在工業(yè)中的廣泛應(yīng)用，致使含鎘粉塵、廢水、廢渣對(duì)環(huán)境造成嚴(yán)重污染，再經(jīng)空氣、飲水和食品等途徑進(jìn)入人體，危害身體健康。研究表明，腎臟是Cd積累和滯留的主要器官。由于Cd在腎臟中的半衰期長(zhǎng)達(dá)30年，腎功能不全可能是Cd引起毒性損害甚至死亡的最大危險(xiǎn)因素。研究表明，腎小管上皮細(xì)胞是鎘毒性的主要靶點(diǎn)。各種形式的細(xì)胞死亡，包括由氧化應(yīng)激介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡、壞死和壞死性凋亡，都與鎘誘導(dǎo)的腎小管損傷有關(guān)。然而，其他類(lèi)型的氧化性細(xì)胞死亡是否參與鎘誘導(dǎo)的腎小管損傷尚不清楚。

鐵死亡是一種以鐵離子依賴為特征的非凋亡性細(xì)胞死亡，其本質(zhì)是細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)氧化物的代謝障礙，進(jìn)而在鐵離子的催化下異常代謝，產(chǎn)生大量脂質(zhì)ROS，攻擊生物大分子，觸發(fā)細(xì)胞死亡?？寡趸到y(tǒng)功能抑制和線粒體功能損傷是鐵死亡脂質(zhì)過(guò)氧化發(fā)生的重要原因。谷胱甘肽過(guò)氧化物酶4(glutathione peroxidase 4, GPX4)和長(zhǎng)鏈脂酰CoA合成酶(Acyl-CoA Synthetase Long chain family member 4, ACSL4)是鐵死亡的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，也是其標(biāo)記物。鐵死亡受鐵代謝的嚴(yán)格調(diào)控。儲(chǔ)鐵蛋白(Ferritin)是細(xì)胞內(nèi)主要的鐵儲(chǔ)存蛋白復(fù)合物，由鐵蛋白輕鏈1(ferritin light polypeptide 1, FLT)和鐵蛋白重鏈 1 (ferritin heavy polypeptide 1, FTH) 組成。鐵死亡與許多疾病有關(guān)，包括組織損傷、癌癥、感染和阿爾茨海默病。然而，鐵死亡在Cd誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞死亡中的作用尚不清楚。

自噬是一種依賴溶酶體的降解途徑，通過(guò)吞噬和降解清除受損的細(xì)胞內(nèi)成分，參與Cd誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性和細(xì)胞死亡。自噬關(guān)鍵因子如ATG5、ATG7和ATG16L1的敲除可抑制癌細(xì)胞中的鐵死亡。自噬的另一個(gè)核心效應(yīng)分子BECN，可直接與SLC7A11結(jié)合來(lái)誘導(dǎo)GSH 耗竭和鐵死亡。據(jù)報(bào)道，某些形式的自噬通過(guò)影響鐵積累、脂質(zhì)過(guò)氧化和抗氧化蛋白質(zhì)的降解來(lái)促進(jìn)鐵死亡。特別是鐵自噬(ferritinophagy)，一種選擇性自噬，可通過(guò)溶酶體降解儲(chǔ)鐵蛋白，增加細(xì)胞內(nèi)鐵離子水平促進(jìn)鐵死亡。該過(guò)程由核受體共激活因子4(nuclear receptor coactivator 4, NCOA4)介導(dǎo)，NCOA4 選擇性地結(jié)合自噬小體中的 FTH1并將其遞送到溶酶體中，從而導(dǎo)致鐵釋放。抑制自噬調(diào)節(jié)蛋白如ATG7或鐵自噬特異性受體 NCOA4 的表達(dá)，可抑制鐵死亡；而過(guò)表達(dá)NCOA4則可促進(jìn)細(xì)胞鐵死亡。然而，在Cd誘導(dǎo)的腎小管損傷中，鐵自噬介導(dǎo)的鐵死亡是否發(fā)揮重要作用仍然未知?；谝陨戏治觯狙芯坎捎肏K-2細(xì)胞構(gòu)建鎘暴露模型，研究鐵自噬誘導(dǎo)的鐵死亡在Cd暴露致腎小管上皮細(xì)胞毒性中的作用。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)和處理

HK-2細(xì)胞購(gòu)買(mǎi)自武漢大學(xué)細(xì)胞庫(kù)，用含10%胎牛血清(PAN公司)的MEM培養(yǎng)基(hyclone公司)進(jìn)行培養(yǎng)。氯化鎘及其他抑制劑購(gòu)自Sigma-Aldrich公司。為了證實(shí)鐵死亡的作用，細(xì)胞用4 μmol/L脂質(zhì)過(guò)氧化作用抑制劑ferrastatin-1(Fer-1)或12.5 μmol/L鐵離子螯合劑去鐵胺(deferroamine, DFO)預(yù)處理2 h。為了研究自噬-溶酶體途徑對(duì)Cd引起的鐵死亡的作用，用1 mmol/L自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-Methyladenine, 3-MA)或5 μmol/L溶酶體抑制劑氯喹(Chloroquine, CQ)預(yù)處理細(xì)胞2 h。對(duì)照細(xì)胞用溶劑處理。對(duì)于所有實(shí)驗(yàn)，在指定的預(yù)處理后再添加24 μmol/L Cd處理24 h。

1.2 細(xì)胞活力檢測(cè)

細(xì)胞于染毒結(jié)束后，用CCK8試劑(購(gòu)自東京同仁公司)檢測(cè)其細(xì)胞活力以評(píng)價(jià)鎘暴露對(duì)HK-2細(xì)胞的毒性。簡(jiǎn)單地說(shuō)，用不同濃度的鎘(0、12、24和36 μmol/L)處理細(xì)胞24 h。對(duì)于其他處理，按照上述方法處理細(xì)胞，并根據(jù)制造商的說(shuō)明在24 μmol/L Cd處理24 h后進(jìn)行評(píng)估。

1.3 細(xì)胞內(nèi)鐵離子的檢測(cè)

細(xì)胞內(nèi) Fe的積累可通過(guò)比色法使用鐵離子含量試劑盒(Abcam公司)監(jiān)測(cè)。HK-2細(xì)胞(1×10細(xì)胞)在6倍細(xì)胞體積的鐵測(cè)定緩沖液中快速均質(zhì)化，并在16 000×

g

下4 ℃離心10 min去除不溶性物質(zhì)。將50 μL樣品加入96孔板中，后用分析緩沖液將體積增加至100 μL。然后分別添加5 μL鐵測(cè)定緩沖液或鐵還原劑，分別用于Fe或總鐵的測(cè)量?；旌虾?，在25 ℃避光孵育30 min后，向每個(gè)孔中加入100 μL鐵探針，并在25 ℃避光孵育。最后，在593 nm處測(cè)量吸光度，并使用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算鐵濃度。

1.4 脂質(zhì)過(guò)氧化水平

脂質(zhì)過(guò)氧化水平可通過(guò)檢測(cè)氧化應(yīng)激標(biāo)記物丙二醛(Malondialdehyde， MDA)水平量化。HK-2細(xì)胞(1×10細(xì)胞)在冰上用 300 μL含有3 μL BHT的MDA裂解緩沖液勻漿，并以13 000×

g

離心10 min以去除不溶性物質(zhì)。然后根據(jù)制造商的說(shuō)明(碧云天公司)使用脂質(zhì)過(guò)氧化(MDA)測(cè)定試劑盒測(cè)量MDA含量。

1.5 免疫印跡分析

常規(guī)提取細(xì)胞蛋白并進(jìn)行免疫印跡分析，通過(guò)10%或12% SDS-PAGE分離樣品后轉(zhuǎn)印到PVDF膜上。封閉后與一抗，包括FTH(1∶2 000，NOVUS公司)、GPX4(1∶1 000，三鷹生物公司)、ACTB(1∶5 000，Sigma-Aldrich公司)、LC3B-Ⅱ(1∶1 000，Sigma-Aldrich公司)、NCOA4(ARA70，1∶1，賽默飛公司)和ACSL4(1∶1 000，賽默飛公司)4 ℃過(guò)夜孵育，將膜在TBST中洗滌后與二抗(1∶1000；碧云天公司)在室溫下再孵育1 h。蛋白條帶用BeyoECL Star (碧云天公司) 顯影。使用Image J軟件對(duì)條帶進(jìn)行密度分析。所有數(shù)據(jù)代表至少3個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。

1.6 透射電鏡

HK-2細(xì)胞收集離心后，用2.5%戊二醛在4 ℃下固定2 h，然后用 0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(phosphate-buffered saline，PBS)洗滌3次。然后，將細(xì)胞用1%鋨酸固定2 h，并用PBS洗滌3次。隨后，將細(xì)胞用1%四氧化鋨固定并通過(guò)酒精梯度脫水后嵌入樹(shù)脂中。再用乙酸鈾和檸檬酸鉛雙重染色后，使用透射電子顯微鏡(HT7800，日立)檢測(cè)樣品。

1.7 siRNA轉(zhuǎn)染

根據(jù)廠家的說(shuō)明書(shū)，細(xì)胞使用Opti-MEM? I無(wú)血清培養(yǎng)基(gibco公司)與Lipofectamine2000 轉(zhuǎn)染試劑(賽默飛公司)轉(zhuǎn)染si RNA以干擾相應(yīng)的分子。簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)，分別將siRNA和5 μL Lipofectamine2000用250 μL Opti-MEM稀釋后室溫孵育5 min。隨后將兩種溶液混合后再室溫孵育20 min后加入培養(yǎng)板中，并用不含抗生素的培養(yǎng)基加至2 mL。孵育7 h后，更換培養(yǎng)基后孵育16～24 h后用于實(shí)驗(yàn)。

1.8 統(tǒng)計(jì)分析

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均表示。組間比較采用方差分析，兩兩比較采用post-hoc Tukey檢驗(yàn)。零假設(shè)在0.05水平拒絕。

2 結(jié)果

2.1 Cd以劑量依賴性方式誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞鐵死亡

不同濃度Cd暴露后，24 μmol/LCd 在 24 h誘導(dǎo)細(xì)胞死亡，而36 μmol/LCd導(dǎo)致幾乎一半的細(xì)胞死亡(圖 1A)，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

<0.01)。相應(yīng)的，Cd處理導(dǎo)致 HK-2 細(xì)胞中 MDA 含量以劑量依賴性方式增加(圖 1B)，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

<0.01)。免疫印跡結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，Cd 處理下調(diào) GPX4蛋白水平，上調(diào) ACSL4 蛋白水平(圖 1C)，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

<0.01)。這些結(jié)果提示Cd誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞鐵死亡。

a：P<0.01，與0 μmol/L比較

2.2 抑制鐵死亡可減輕Cd誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞死亡

為了進(jìn)一步驗(yàn)證鐵死亡在鎘誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡中的作用，我們研究了抑制鐵死亡是否可以預(yù)防Cd誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞死亡。與Cd組相比，F(xiàn)er-1和DFO均可抑制Cd處理的HK-2細(xì)胞中MDA的升高(圖2A, B)；顯著減輕了Cd誘導(dǎo)的HK-2 細(xì)胞死亡(圖2C, 2D)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

<0.05)。表明鐵死亡是Cd誘導(dǎo)的HK-2 細(xì)胞死亡的一種重要形式。

2.3 Cd誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞自噬

TEM 結(jié)果表明，Cd處理增加了 HK-2 中自噬小體的數(shù)量(圖 3A)。免疫印跡分析結(jié)果表明， Cd暴露上調(diào)自噬標(biāo)志物L(fēng)C3B-Ⅱ的蛋白質(zhì)水平(圖 3B)，與對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

<0.01)。由于LC3B-Ⅱ的積累可能表明自噬激活或溶酶體降解受損，我們進(jìn)行了基于自噬性降解的自噬流評(píng)價(jià)，即在有和沒(méi)有自噬抑制劑的情況下檢測(cè) LC3B-Ⅱ 蛋白水平。與Cd組相比，免疫印跡分析結(jié)果顯示，CQ預(yù)處理進(jìn)一步增加了Cd處理的 HK-2 細(xì)胞中的 LC3B-Ⅱ 蛋白水平(圖 3C)，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

<0.01)，表明Cd暴露激活了腎小管上皮細(xì)胞中的自噬。

a：P<0.01，與Control組比較；b：P<0.05，與Cd組比較；c：P<0.01，與Cd組比較

A：代表性透射電鏡圖，紅色箭頭表示自噬小體，比例尺：1 μm；B , C：代表性免疫印跡條帶及半定量分析 a：P<0.01，與Control比較； b：P<0.01，與Cd組比較

2.4 Cd誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞鐵死亡需要自噬激活

為了闡明自噬與 Cd 誘導(dǎo)的鐵死亡之間的關(guān)系，應(yīng)用自噬藥理抑制劑 3-MA 抑制 HK-2中的自噬。與Cd組相比，3-MA 預(yù)處理顯著減輕了 Cd 誘導(dǎo)的鐵過(guò)載(圖 4A)(

P

<0.01)，抑制 Cd 暴露誘導(dǎo)的MDA(圖 4B)升高(

P

<0.01)，以及減少Cd 誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡(圖 4C)(

P

<0.05)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。此外，與Cd組相比， ATG7敲除減輕HK-2 細(xì)胞中Cd 誘導(dǎo)的鐵過(guò)載(圖 4D )和 MDA 積累(圖 4E)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

<0.01)。此外，CCK-8 分析顯示ATG7 敲除顯著減弱了 Cd 誘導(dǎo)的 HK-2 細(xì)胞死亡(圖 4F )(

P

<0.05)。這些數(shù)據(jù)表明，Cd 誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞鐵死亡需要自噬激活。

2.5 NCOA4 介導(dǎo)的儲(chǔ)鐵蛋白降解對(duì)于 Cd 誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞鐵死亡至關(guān)重要

已經(jīng)證明，儲(chǔ)鐵蛋白的自噬降解(即鐵自噬)可以促進(jìn)鐵死亡，而 NCOA4 是一種選擇性的貨物受體，可介導(dǎo)溶酶體中的儲(chǔ)鐵蛋白降解。因此，我們研究了 NCOA4 介導(dǎo)的儲(chǔ)鐵蛋白降解是否與 Cd 誘導(dǎo)的上皮細(xì)胞鐵死亡有關(guān)。免疫印跡分析結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，Cd 暴露導(dǎo)致HK-2 細(xì)胞中NCOA4 的表達(dá)顯著升高(

P

<0.01)，F(xiàn)TH表達(dá)顯著下降(

P

<0.05)(圖5A)。與Cd組相比，3-MA抑制自噬顯著降低了NCOA4 的表達(dá)水平，增加了 FTH的表達(dá)水平(圖 5B)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

<0.01)。此外，與Cd組相比，NCOA4 敲除顯著抑制了 Cd 誘導(dǎo)的 HK-2細(xì)胞中的儲(chǔ)鐵蛋白降解(圖 5C)(

P

<0.01)，減輕 Cd 誘導(dǎo)的 MDA 上調(diào)(圖 4E)(

P

<0.01)和細(xì)胞死亡(圖 4F)(

P

<0.05)?？傊?，這些結(jié)果表明NCOA4介導(dǎo)的儲(chǔ)鐵蛋白自噬依賴性降解，這對(duì)于 Cd 誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞鐵死亡至關(guān)重要。

3 討論

隨著工農(nóng)業(yè)的快速發(fā)展，鎘暴露嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康。腎功能衰竭是鎘引起的最重要疾病之一，腎小管細(xì)胞被認(rèn)為是鎘致腎損傷的主要部位。研究表明，低至2.5 mg/kg和2.5 μmol/L的Cd可分別在體內(nèi)和體外誘導(dǎo)腎損傷。鑒于多種類(lèi)型的細(xì)胞死亡與Cd 誘導(dǎo)的毒性有關(guān)，研究 Cd 誘導(dǎo)的腎小管細(xì)胞的細(xì)胞死亡機(jī)制可以幫助我們了解 Cd 誘導(dǎo)的腎臟疾病的發(fā)病機(jī)制，并為其防治提供潛在的策略。

在這里，我們發(fā)現(xiàn)鐵死亡是Cd誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞毒性的一種新機(jī)制，并發(fā)現(xiàn)鐵自噬介導(dǎo)的儲(chǔ)鐵蛋白降解促進(jìn)鎘誘導(dǎo)的鐵死亡。鐵死亡是新近發(fā)現(xiàn)的以鐵依賴性脂質(zhì)過(guò)氧化為特征的細(xì)胞死亡，與許多疾病過(guò)程有關(guān)。之前的研究表明，砷暴露通過(guò)破壞胰腺功能和神經(jīng)細(xì)胞的鐵穩(wěn)態(tài)而導(dǎo)致鐵死亡。氧化鋅納米顆粒誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞死亡也與鐵死亡有關(guān)，這表明鐵死亡在毒性損傷中的重要作用。越來(lái)越多的證據(jù)表明，鎘暴露會(huì)擾亂脂質(zhì)代謝，促進(jìn)ROS的過(guò)度產(chǎn)生，增加脂質(zhì)過(guò)氧化，并擾亂鐵穩(wěn)態(tài)。我們的研究結(jié)果表明，鎘暴露以劑量依賴的方式誘導(dǎo)鐵死亡，F(xiàn)er-1抑制脂質(zhì)過(guò)氧化減輕了鎘誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡。這一觀察結(jié)果支持鐵依賴性脂質(zhì)過(guò)氧化或鐵死亡在鎘誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞毒性中的重要作用。

1：Control組；2:3-MA組；3：Cd組；4:3-MA+Cd組；5:Con-si組；6：ATG7-si組；7：Con-si+Cd組；8：ATG7-si+Cd組；9：NCOA4-si組；10：NCOA4-si+Cd組；a：P<0.01，與Control組比較；b：P<0.05，與Cd組比較；c：P<0.01，與Cd組比較

a：P<0.05，b：P<0.01，與Control組比較；c：P<0.01，與Cd組比較

最近的研究表明自噬與鐵死亡調(diào)節(jié)有關(guān)。我們的結(jié)果表明，Cd誘導(dǎo)自噬激活，以及鐵死亡是自噬細(xì)胞死亡的一種形式，因?yàn)?-MA或敲除ATG7抑制自噬，均導(dǎo)致Cd暴露后細(xì)胞游離鐵、脂質(zhì)過(guò)氧化和細(xì)胞死亡降低。我們還證明Cd誘導(dǎo)的HK-2鐵死亡需要儲(chǔ)鐵蛋白，因?yàn)镹COA4敲除表現(xiàn)出與3-MA處理和ATG7敲除相似的作用。盡管NCOA4介導(dǎo)的鐵自噬在2014年首次被報(bào)道，但鐵自噬在各種病理生理過(guò)程中的許多作用都得到了闡明。例如，鐵自噬是紅細(xì)胞生成和鐵死亡介導(dǎo)的肝纖維化所必需的，并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞鐵死亡。我們的研究擴(kuò)展了鐵自噬的作用范圍，以參與重金屬Cd誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞功能障礙。

總之，我們報(bào)道了Cd暴露以劑量依賴性方式誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞鐵死亡，這與自噬激活密切相關(guān)，并且自噬在細(xì)胞死亡過(guò)程中發(fā)揮了促死亡作用。最重要的是，鎘暴露導(dǎo)致儲(chǔ)鐵蛋白的自噬降解，即鐵自噬，導(dǎo)致鐵過(guò)載、脂質(zhì)過(guò)氧化，并最終導(dǎo)致鐵死亡。Cd暴露誘導(dǎo)的壞死、細(xì)胞凋亡和自噬已被認(rèn)為是控制細(xì)胞命運(yùn)的毒理機(jī)制。我們的研究擴(kuò)展了這一概念，并提出鐵自噬介導(dǎo)的鐵死亡是一種由Cd誘導(dǎo)的新型細(xì)胞死亡形式，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)鎘腎臟毒性防治藥物提供理論支持。