閆留延，李劍峰，張世文，張 博，王永芳，張小梅，祖超凡，王振山， 桑璐曼，何占祥，賈小平，董志平

(1.河南科技大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，河南 洛陽 471023；2.河北省農(nóng)林科學(xué)院 谷子研究所，國家谷子改良中心，河北 石家莊 050035)

PRRs(Pseudo-response regulators)家族基因廣泛參與植物花期調(diào)控、生物量積累及對逆境脅迫的抵御作用[1-4]。作為PRR家族的重要成員，PRR73是擬南芥(Arabidopsisthaliana)PRR7的直系同源基因，目前在C4作物中報(bào)道較少，只在玉米(Zeamays)中利用圖位克隆法獲得了該基因[5]。作為我國重要的雜糧作物，谷子(Setariaitalica)遺傳資源豐富，地理分布廣泛，存在較多的光溫敏感自然變異類型，是C4禾谷類作物光溫敏感調(diào)控機(jī)制研究的理想模型[6-9]。研究谷子PRR73基因?qū)鉁丶胺巧锩{迫的響應(yīng)特點(diǎn)，可以了解光周期和溫度如何共同調(diào)控PRR73基因表達(dá)來實(shí)現(xiàn)谷子對不同光溫環(huán)境的適應(yīng)性調(diào)節(jié)，揭示PRR73基因參與非生物脅迫調(diào)節(jié)的可能機(jī)制，具有重要意義。

PRRs家族蛋白質(zhì)包含3個(gè)區(qū)域：PRR結(jié)構(gòu)域、CCT結(jié)構(gòu)域和可變域，分別位于蛋白質(zhì)的N端、C端和中部[10-13]。被子植物PRRs基因的PRR、CCT結(jié)構(gòu)域高度保守，但PRR結(jié)構(gòu)域中個(gè)別氨基酸變化可以導(dǎo)致基因功能改變[14-15]。對玉米ZmPRR73的研究表明，在不保守的可變域中氨基酸的變化可能也影響光周期敏感性[5]。擬南芥PRR7通過CONSTANS依賴途徑控制開花時(shí)間，可以阻遏CCA1和LHY啟動(dòng)子的活性，調(diào)節(jié)CCA1和LHY響應(yīng)環(huán)境溫度和調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)活性氧的水平[12-13，16-20]。此外，PRR7能夠負(fù)調(diào)控抗冷基因CBF和調(diào)節(jié)ABA來響應(yīng)冷脅迫和干旱脅迫，參與植物對鐵過量的適應(yīng)性反應(yīng)[20-24]。谷子和其他禾本科作物一樣，光周期調(diào)控開花研究已經(jīng)有所報(bào)道，但光周期和溫度如何共同調(diào)控生長發(fā)育的研究則極少涉及[25-33]。事實(shí)上光周期和溫度通過復(fù)雜的互作效應(yīng)影響谷子生長發(fā)育，一些光周期途徑的關(guān)鍵基因如SiCCT參與了谷子光溫互作調(diào)控[34]。

作為光周期調(diào)控途徑的另一個(gè)關(guān)鍵基因，PRR73在C4作物光溫互作調(diào)節(jié)以及應(yīng)對非生物脅迫中是否起到一定作用是值得研究的一個(gè)問題。本研究從谷子中克隆SiPRR73基因，系統(tǒng)分析其對光周期、光溫組合以及5種非生物脅迫的響應(yīng)特性，以揭示光周期和溫度對SiPRR73基因的調(diào)控模式以及這種調(diào)控對谷子適應(yīng)不同光溫環(huán)境的潛在意義，并揭示SiPRR73基因參與抵抗非生物脅迫的調(diào)節(jié)機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

所用的谷子品種延谷11號來自陜西，是對光溫較敏感的春谷品種。

1.2 材料種植及樣品采集

采用盆栽種植，所用塑料盆規(guī)格為10 cm×10 cm，盆內(nèi)裝有營養(yǎng)土，種植120盆，每盆播種5～8粒種子，置于25 ℃、14 h光/10 h暗的培養(yǎng)室長至三葉期定苗，其中部分植株在五葉期采集嫩葉用于克隆SiPRR73基因；另有部分植株繼續(xù)培養(yǎng)，抽穗后采集根、莖稈、次頂葉、頂葉、穗頸、幼穗于液氮中保存。設(shè)置長日照(25 ℃、15 h光/9 h暗，LD)、短日照(25 ℃、9 h光/15 h暗，SD)2個(gè)不同光周期處理，每個(gè)處理24盆，其中，長日照設(shè)定21：00—6：00為黑暗， 6：00—21：00為光照；短日照設(shè)定15：00—6：00為黑暗， 6：00—15：00為光照(下同)。在六葉期時(shí)于6：00開始取樣，取頂端嫩葉，每隔2 h取樣一次，連續(xù)48 h取樣，此外從三葉期開始于9：00取樣，每隔3 d取樣一次，短日照取至八葉期(抽穗)，長日照取至十二葉期，所有樣品于液氮保存。設(shè)置4種光溫組合處理：低溫長日照(溫度22 ℃、光周期15 h光/9 h暗，LTLD)、低溫短日照(溫度22 ℃、光周期9 h光/15 h暗，LTSD)、高溫長日照(溫度27 ℃、光周期15 h光/9 h暗，HTLD)、高溫短日照(溫度27 ℃、光周期9 h光/15 h暗，HTSD)；每個(gè)處理16盆，培養(yǎng)至六葉期從6：00開始取樣，每隔3 h取樣一次，連續(xù)24 h取樣，所采頂端嫩葉于液氮中保存。

用于非生物脅迫處理的谷苗種植條件同上，每個(gè)脅迫處理和對照處理均8盆谷苗，在培養(yǎng)室(溫度為25 ℃，光照條件為14 h光/10 h暗)培養(yǎng)21 d，隨后進(jìn)行脅迫處理，NaCl、ABA、EDTA-Fe、PEG6000的處理濃度分別為200 mmol/L、100 μmol/L、600 μmol/L、20%，低溫處理溫度為15 ℃。對照組(溫度為25 ℃，光照條件為14 h光/10 h暗，CK)和每個(gè)處理組取樣時(shí)間均為處理前(0 h)，脅迫處理后0.5，1，2，4，8，16，24 h，所取的頂端嫩葉于液氮中保存。

1.3 SiPRR73的克隆及生物信息學(xué)分析

葉片總RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄分別用康為世紀(jì)RNA提取試劑盒及寶生物公司第一鏈cDNA合成試劑盒完成，基因特異引物信息見表1?；驍U(kuò)增體系為20 μL，包括cDNA模板1 μL，2×Es Taq MasterMix(Dye)10 μL，引物(正向與反向混合)0.5 μL，剩余體積用ddH2O補(bǔ)足。擴(kuò)增循環(huán)程序： 94 ℃預(yù)變性4 min；變性(94 ℃/30 s)、退火(58 ℃/30 s)、延伸(72 ℃/90 s)，循環(huán)35次；最后72 ℃延伸 8 min。PCR產(chǎn)物用全式金的膠回收試劑盒純化回收，回收產(chǎn)物連入pBM16A載體，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑選陽性克隆進(jìn)行測序。

利用NCBI的BlastP程序(https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastp&PAGE_TYPE=BlastSearch&LINK_LOC=blasthome)搜索保守結(jié)構(gòu)域；從公共數(shù)據(jù)庫下載其他物種的43個(gè)PRR73蛋白序列，利用 ClustalW 1.8軟件對包含谷子SiPRR73蛋白的44條PRR73蛋白序列進(jìn)行多序列比對，系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建采用MEGA 6.05軟件。

1.4 谷子SiPRR73基因的表達(dá)分析

按照1.3步驟完成樣品RNA的提取及第一鏈cDNA的反轉(zhuǎn)錄合成，谷子內(nèi)參基因SiActin和SiPRR73基因分別用表1中對應(yīng)的特異引物(SiActin-FQ、SiPRR73-FQ)進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增體系按照TB GreenTM 試劑盒(寶生物公司)說明書準(zhǔn)備，使用羅氏熒光定量PCR儀擴(kuò)增，兩步法擴(kuò)增程序：預(yù)變性(95 ℃/30 s)；40個(gè)循環(huán)包括變性(95 ℃/30 s)、退火(58 ℃/30 s)?；蛳鄬Ρ磉_(dá)量的計(jì)算用2-ΔΔCt方法。

表1 基因擴(kuò)增及熒光定量PCR引物Tab.1 Primers used for gene amplification and fluorescence quantitative PCR

2 結(jié)果與分析

2.1 SiPRR73基因結(jié)構(gòu)域、進(jìn)化關(guān)系分析

從谷子葉片提取高質(zhì)量總RNA(圖1-A)，反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA，利用RT-PCR技術(shù)分2段擴(kuò)增SiPRR73基因，擴(kuò)增產(chǎn)物SiPRR73-G1、SiPRR73-G2經(jīng)電泳檢測與目標(biāo)片段相符(圖1-B)?；厥掌谓?jīng)測序后拼接得到2 928 bp的cDNA序列，其中CDS長度為2 283 bp，推定的蛋白質(zhì)氨基酸數(shù)量為760個(gè)。SiPRR73 蛋白含有REC、CCT等2個(gè)結(jié)構(gòu)域(圖2)。系統(tǒng)進(jìn)化分析表明，C4作物家族的谷子、高粱(Sorghumbicolor)、糜子(Panicummiliaceum)、玉米(Zeamays)、哈氏黍(Panicumhallii)PRR73蛋白具有較近的進(jìn)化關(guān)系(圖3)。

A.谷子總RNA電泳：1，2.兩管RNA。B.SiPRR73基因的RT-PCR產(chǎn)物電泳：1.DL2000 Marker；2，3.分段擴(kuò)增產(chǎn)物SiPRR73-G1、SiPRR73-G2。

圖2 SiPRR73蛋白所包含的結(jié)構(gòu)域Fig.2 The domains contained in SiPRR73 protein

圖3 PRR73蛋白的分子系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.3 Molecular phylogenetic tree of PRR73 proteins

2.2 谷子不同組織部位SiPRR73基因的表達(dá)特性

SiPRR73基因具有明顯的組織表達(dá)特異性，在次頂葉表達(dá)水平最高，其次為頂葉，隨后依次為穗頸、幼穗、莖稈、根(圖4)。

2.3 SiPRR73基因?qū)庵芷诘捻憫?yīng)特點(diǎn)

兩晝夜基因表達(dá)模式一致，因此，圖5-A中只展示24 h表達(dá)模式。短日照條件下，SiPRR73基因在光照8 h后(14：00)表達(dá)量達(dá)到峰值，隨后開始下降，在整個(gè)晝夜中呈節(jié)律性表達(dá)，只出現(xiàn)一個(gè)表達(dá)峰。長日照條件下，SiPRR73基因在8：00表達(dá)量迅速升高，在10：00和14：00出現(xiàn)表達(dá)峰值，14：00后表達(dá)量緩慢下降?？傊琒iPRR73基因呈現(xiàn)出光依賴性晝夜節(jié)律表達(dá)模式，短日照下只有一個(gè)表達(dá)峰，長日照下有2個(gè)表達(dá)峰，且無論長日照還是短日照光照期表達(dá)水平總體高于黑暗期。從圖5-B可以看出，總體上短日照條件下從三葉期到八葉期(抽穗)SiPRR73基因的表達(dá)水平要低于長日照，長日照條件下八到十二葉期仍維持營養(yǎng)生長，SiPRR73在十一、十二葉期表達(dá)量升至較高水平。

不同小寫字母表示處理間差異顯著(P<0.05)。圖5—7同。 Different lowercase letters indicate significant differences between treatments at P<0.05. The same as Fig.5—7.

A.晝夜表達(dá)規(guī)律；B.不同葉期表達(dá)規(guī)律。 A. Diurnal expression pattern；B. Expression pattern at different leaf stages.

2.4 光周期和溫度對SiPRR73基因表達(dá)的調(diào)控作用

溫度對SiPRR73基因表達(dá)峰的數(shù)目有明顯影響，在高溫(27 ℃)條件下的光照期SiPRR73出現(xiàn)2個(gè)表達(dá)峰，而在低溫(22 ℃)條件下的光照期只出現(xiàn)1個(gè)表達(dá)峰，光周期的改變并不影響高、低溫間表達(dá)峰數(shù)目的差異；光周期控制SiPRR73表達(dá)峰出現(xiàn)的早晚，溫度的改變并不影響SiPRR73在短日照條件下的表達(dá)峰比長日照下提前的特點(diǎn)。此外，SiPRR73表現(xiàn)出一定光誘導(dǎo)表達(dá)特性，黑暗期表達(dá)水平相對較低(圖6)。

2.5 非生物脅迫條件下SiPRR73基因的表達(dá)模式

NaCl處理1 h內(nèi)SiPRR73基因受誘導(dǎo)表達(dá)，隨后的時(shí)間除了8 h誘導(dǎo)表達(dá)，其余時(shí)間點(diǎn)基因表達(dá)均處于抑制狀態(tài)(圖7-A)。SiPRR73基因在ABA處理1，8 h受誘導(dǎo)表達(dá)，其余時(shí)間點(diǎn)表達(dá)基本處于抑制狀態(tài)(圖7-B)。PEG模擬干旱脅迫除了脅迫0.5，24 hSiPRR73表達(dá)受到抑制，其余時(shí)間點(diǎn)均處于誘導(dǎo)表達(dá)狀態(tài)，特別是處理8，12 h，基因表達(dá)最強(qiáng)(圖7-C)。SiPRR73在低溫(15 ℃)處理24 h內(nèi)均受誘導(dǎo)表達(dá)，4，8 h表達(dá)最強(qiáng)，說明SiPRR73在應(yīng)對低溫脅迫中可能發(fā)揮功能(圖7-D)。在EDTA-Fe 處理下，SiPRR73在早期(2 h內(nèi))表達(dá)受到抑制，4～18 h均處于誘導(dǎo)表達(dá)狀態(tài)，24 h表達(dá)再次受到抑制，推測其在鐵脅迫過程中發(fā)揮特定作用(圖7-E)。5種非生物脅迫中，PEG和低溫總體上誘導(dǎo)SiPRR73表達(dá)，而NaCl在脅迫早期誘導(dǎo)基因表達(dá)，后期總體表現(xiàn)為抑制狀態(tài)，F(xiàn)e脅迫則早期抑制基因表達(dá)，后期總體誘導(dǎo)基因表達(dá)。SiPRR73對ABA脅迫的響應(yīng)特點(diǎn)接近NaCl，主要差異在于脅迫0.5 h NaCl誘導(dǎo)基因表達(dá)而ABA抑制基因表達(dá)。

圖6 光溫互作對SiPRR73基因晝夜表達(dá)模式的影響Fig.6 The effect of photo-thermal interaction on diurnal expression pattern of SiPRR73

圖7 非生物脅迫條件下SiPRR73基因的表達(dá)模式Fig.7 Expression pattern of SiPRR73 under abiotic stress conditions

3 結(jié)論與討論

通過對擬南芥、水稻、高粱、玉米4種植物CCT結(jié)構(gòu)域基因進(jìn)化分析，發(fā)現(xiàn)水稻OsPRR73基因劃分到第4組，該組包括擬南芥2號、5號染色體上的一些CCT結(jié)構(gòu)域基因[35]。本研究發(fā)現(xiàn)，谷子SiPRR73與水稻、玉米、小麥、高粱等禾本科家族PRR73基因聚為1組，但在組內(nèi)又分為3個(gè)亞組，谷子與玉米、糜子、高粱等C4作物PRR73基因聚為1個(gè)亞組，水稻、小麥PRR73基因分別聚為另外2個(gè)亞組。組織特異性表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，谷子SiPRR73和玉米ZmPRR73、水稻OsPRR73一樣，均在葉片中的表達(dá)量最高，受光調(diào)控，而小麥TaPRR73基因則在根部表達(dá)量較高，說明PRR73基因在禾本科家族內(nèi)部進(jìn)化過程中功能發(fā)生了分化[4-5，36]。谷子SiPRR73在長、短日照條件下的晝夜表達(dá)模式與水稻OsPRR73、小麥TaPRR73相似，即在溫度不變的情況下，長日照有2個(gè)表達(dá)峰，短日照有1個(gè)表達(dá)峰，與玉米ZmPRR73長短日照下均只有1個(gè)表達(dá)峰存在差異[4-5，37]，說明盡管同為C4作物，谷子和玉米PRR73基因?qū)庵芷诘捻憫?yīng)模式存在一定差異。溫度是光周期外影響植物生長的另一個(gè)重要環(huán)境因子，二者存在復(fù)雜的互作效應(yīng)。對擬南芥的研究發(fā)現(xiàn)，提高溫度能抵消短日照對開花的抑制作用[38]；而大麥和大豆都是在誘導(dǎo)開花的光周期條件下高溫促進(jìn)開花，抑制開花的光周期條件下高溫抑制開花[39-42]。谷子光溫互作模式與大豆相似，短日照和高溫對抽穗具有正向作用，長日照和高溫對抽穗具有負(fù)向效應(yīng)[34]。本研究發(fā)現(xiàn)，光周期和溫度均對SiPRR73的表達(dá)模式產(chǎn)生了影響，但影響方式不同，光周期主要影響了基因表達(dá)峰出現(xiàn)時(shí)間的早晚，溫度主要影響了表達(dá)峰的數(shù)目，而這種影響會(huì)導(dǎo)致基因功能發(fā)生改變，從而影響谷子抽穗開花，這表明SiPRR73可能參與谷子對不同光周期和溫度環(huán)境的適應(yīng)性調(diào)節(jié)過程。

PRRs家族基因與植物對非生物脅迫的抵御也有密切關(guān)系[43]。CBF與擬南芥對低溫脅迫的抵御能力有關(guān)，PRR9通過調(diào)節(jié)CBF的表達(dá)參與抵御低溫脅迫[44-45]。本研究發(fā)現(xiàn)，低溫(15 ℃)脅迫的整個(gè)過程SiPRR73基因呈現(xiàn)強(qiáng)誘導(dǎo)表達(dá)模式，說明該基因可能參與谷子對低溫脅迫的抵抗作用。PRRs家族基因與ABA調(diào)控基因有部分重疊，ABAR、ABI3通過ABA調(diào)控表達(dá)參與植物抗逆性，這些基因也受PRRs家族基因TOC1的負(fù)向調(diào)節(jié)，同時(shí)對TOC1有反向調(diào)節(jié)作用，通過這種調(diào)節(jié)環(huán)的方式參與ABA信號傳導(dǎo)[46]。SiPRR73基因表達(dá)明顯受到ABA調(diào)節(jié)，且在ABA處理不同時(shí)間表達(dá)模式不同，表明SiPRR73可能參與ABA介導(dǎo)的信號傳遞途徑。擬南芥PRR5基因參與鹽脅迫調(diào)節(jié)[47]，本研究發(fā)現(xiàn)，SiPRR73對NaCl脅迫的響應(yīng)特點(diǎn)接近ABA，因此可能與鹽脅迫應(yīng)答有關(guān)。水稻OsPRR73的表達(dá)受到干旱抑制[2]，而本研究發(fā)現(xiàn)，谷子SiPRR73基因明顯被PEG模擬的干旱脅迫所誘導(dǎo)，說明水稻與谷子PRR73基因存在不同的干旱脅迫應(yīng)對機(jī)制。植物鐵蛋白具有儲(chǔ)鐵功能，可以緩解鐵過量，擬南芥PRR7抑制鐵蛋白基因的表達(dá)，與鐵脅迫應(yīng)答有關(guān)[20，24]。本研究發(fā)現(xiàn)，鐵脅迫初期SiPRR73基因的表達(dá)受到抑制，說明鐵脅迫需要大量鐵蛋白發(fā)揮儲(chǔ)鐵功能，脅迫信號傳遞給SiPRR73基因，使其表達(dá)減弱，有利于鐵蛋白基因的表達(dá)，而后期SiPRR73表達(dá)增強(qiáng)說明隨著脅迫減弱，鐵蛋白需求減少，SiPRR73開始抑制基因表達(dá)，因此，推測SiPRR73和擬南芥PRR7一樣，參與了作物抵御鐵脅迫。

本研究首次克隆得到谷子SiPRR73基因包含完整編碼區(qū)的cDNA序列，該基因CDS長度2 283 bp，編碼760個(gè)氨基酸；SiPRR73基因在谷子次頂葉表達(dá)水平最高，受光誘導(dǎo)和光周期調(diào)控；光周期和溫度共同調(diào)節(jié)SiPRR73基因表達(dá)，通過改變表達(dá)峰出現(xiàn)時(shí)間、表達(dá)峰數(shù)目影響基因表達(dá)模式，從而可能參與了谷子對不同光溫環(huán)境的適應(yīng)性調(diào)節(jié)；SiPRR73基因也參與了谷子對鹽脅迫、低溫脅迫、ABA脅迫、干旱脅迫和鐵脅迫的應(yīng)答反應(yīng)。