張 斌

(湖南科技學(xué)院 化學(xué)與生物工程學(xué)院，湖南 永州 425199)

植物在生長過程中經(jīng)常會受到一些不利的環(huán)境因素影響，如干旱、鹽、極端溫度等，這對農(nóng)作物的產(chǎn)量和品質(zhì)會產(chǎn)生巨大的威脅[1]。在植物遭受非生物脅迫時，其自身也會進行一系列的調(diào)控以響應(yīng)和適應(yīng)外界不利的環(huán)境[2]。因此，對植物進行耐逆性遺傳改良的基礎(chǔ)就是探究植物響應(yīng)脅迫的分子機制。大豆是我國重要的糧油作物，為食品加工和動物飼料制造提供原料，但高鹽和干旱嚴重影響大豆的正常生長，導(dǎo)致減產(chǎn)，而關(guān)于大豆響應(yīng)鹽脅迫的分子機制也有較多報道，如ABA信號途徑、SOS信號途徑、轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控等[3]。

植物響應(yīng)非生物脅迫的基因表達調(diào)控是一個非常復(fù)雜的過程，可以發(fā)生在轉(zhuǎn)錄、翻譯和翻譯后修飾等多個層面，其中轉(zhuǎn)錄調(diào)控最為重要[4]。在轉(zhuǎn)錄水平上，基因表達的調(diào)控主要通過啟動子區(qū)的順式作用元件控制[5]。啟動子是基因轉(zhuǎn)錄起始密碼子上游的DNA序列，包含與轉(zhuǎn)錄因子相互作用的順式作用元件，是轉(zhuǎn)錄因子啟動或抑制基因表達的重要元件[4]。順式作用元件作為重要的分子開關(guān)，在植物生長發(fā)育的各個階段和環(huán)境適應(yīng)方面都發(fā)揮著重要的功能。植物啟動子元件在非生物脅迫應(yīng)答方面的功能也已有較多的報道。擬南芥bZIP轉(zhuǎn)錄因子AREB1、AREB2和ABF3通過結(jié)合DREB2A啟動子中的ABRE元件，激活下游靶基因的表達，進而調(diào)控植物對滲透脅迫的響應(yīng)[6]。Yao等[4]研究發(fā)現(xiàn)，楊樹ERF76基因啟動子區(qū)含有多種非生物脅迫響應(yīng)元件，如MYB、MYC和GT-1元件；并且在轉(zhuǎn)基因擬南芥中ERF76啟動子能夠受鹽脅迫誘導(dǎo)增強GUS報告基因的表達。滿玲娟等[7]克隆了梭梭樹HaFT-3基因啟動子，通過轉(zhuǎn)基因擬南芥證明HaFT-3基因啟動子受高溫、低溫、ABA、IAA誘導(dǎo)。古袁揚等[8]研究發(fā)現(xiàn)，番茄SlNAC1基因啟動子上包含多種生物和非生物脅迫應(yīng)答元件，并通過構(gòu)建5′-缺失的SlNAC1啟動子驅(qū)動的GUS基因表達載體鑒定到鹽響應(yīng)關(guān)鍵元件—GT1GMSCAM4元件。

已有研究指出，植物PP2C家族成員在植物鹽、干旱等脅迫響應(yīng)中發(fā)揮重要調(diào)控作用[9]。擬南芥AtPP2CG1則以 ABA 依賴性方式對植物耐鹽性進行正調(diào)控[10]；小麥TaPP2C1過表達可增強轉(zhuǎn)基因煙草的耐鹽性[11]。Zhang等[12]研究表明，二穗短柄草BdPP2CA6在擬南芥中過表達導(dǎo)致其生長前期對ABA的超敏感，并通過ABA依賴途徑增強擬南芥耐鹽性。Singh 等[13]研究發(fā)現(xiàn)，水稻PP2C基因OsPP108受ABA、鹽和干旱脅迫誘導(dǎo)表達上調(diào)，過表達OsPP108的擬南芥在種子萌發(fā)、根系生長和幼苗生長過程中對ABA高度敏感；但是過表達OsPP108擬南芥植株對鹽、甘露醇和干旱脅迫具有更強的耐受性。前期筆者對大豆進行鹽處理后的轉(zhuǎn)錄組測序，在差異基因中篩選到一個上調(diào)倍數(shù)較高的基因GmPP2C89，但是該基因是如何響應(yīng)鹽脅迫的，其在植物抵抗鹽害過程中的功能和機制仍需進一步探究。

本研究利用生物信息學(xué)技術(shù)分析了其啟動子區(qū)的順式作用元件，克隆不同長度的GmPP2C89啟動子片段融合GUS報告基因，在擬南芥中探究該啟動子的鹽、干旱和滲透脅迫誘導(dǎo)效應(yīng)，同時對可能的關(guān)鍵元件進行分析；并利用轉(zhuǎn)基因擬南芥對基因的耐鹽功能進行深入解析，旨在為研究大豆和其他物種PP2C家族基因的功能提供參考，也為大豆耐逆性遺傳育種提供重要的候選基因。

1 材料和方法

1.1 植物材料培養(yǎng)

本研究使用的植物材料包括栽培大豆(Glycinemax)和擬南芥(Col-0，Arabidopsisthaliana)。將植物材料種子直接播種于營養(yǎng)土和蛭石混合(1∶1)基質(zhì)中，用自來水澆灌，在植物生長室培養(yǎng)，條件：長日照(16 h晝/8 h夜)，溫度22～25 ℃，空氣濕度60%～70%。

1.2 RNA提取和熒光定量PCR分析

用20% PEG、300 mmol/L甘露醇溶液分別處理生長10 d的大豆幼苗，分別在0，6，12，24 h取葉片提取總RNA。利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒SuperScript Ⅲ First-Strand Synthesis SuperMix(ThermoFisher scientific)合成cDNA，使用熒光定量PCR儀(CFX96，Bio-Rad，美國)進行熒光定量PCR檢測。利用2-ΔΔCt法計算基因的相對表達量。大豆UBI3基因和擬南芥ACTIN基因作為內(nèi)參，本研究所用引物如表1所示。

1.3 啟動子順式作用元件分析及GUS載體構(gòu)建

根據(jù)大豆基因組數(shù)據(jù)庫(https：//soykb.org/)中啟動子參考序列設(shè)計引物，以大豆DNA為模板克隆啟動子片段，并對其進行測序。將啟動子序列提交到在線數(shù)據(jù)庫PlantCARE(http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)進行順式作用元件預(yù)測，統(tǒng)計非生物脅迫相關(guān)的元件位置和數(shù)量?？寺〗財嗟膯幼有蛄?，將全長和截斷的啟動子片段插入PBI101載體的GUS基因上游，構(gòu)建GUS載體，引物如表1所示。

表1 本研究所用引物Tab.1 Primers used in this study

1.4 擬南芥遺傳轉(zhuǎn)化

將野生型擬南芥種子均勻播種于營養(yǎng)土和蛭石混合(1∶1)基質(zhì)中，在植物生長室培養(yǎng)28～35 d，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的浸花法轉(zhuǎn)化擬南芥，收獲T0種子后，用卡那霉素或草銨膦篩選，并進行PCR鑒定，最終獲得轉(zhuǎn)基因擬南芥材料。

1.5 GUS染色

將擬南芥幼苗浸沒到GUS染色液(1.44 mL 1 mol/L Na2HPO4、1.06 mL 1 mol/L NaH2PO4、1 mL 100 mmol/L K4Fe(CN)6·3H2O、1 mL 100 mmol/L K3Fe(CN)6、500 μL 500 mmol/L EDTA、50 μL TritonX-100、20 mg X-Gluc，用去離子水定容至50 mL)，用真空泵抽真空約5 min，然后置于37 ℃，避光12 h。將GUS染液回收后，加入75%乙醇脫色(除去葉綠素)，然后拍照觀察GUS染色情況。

1.6 轉(zhuǎn)基因擬南芥耐鹽性分析

克隆GmPP2C89的CDS序列，構(gòu)建過表達載體35S∷GmPP2C89，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的浸花法轉(zhuǎn)化野生型擬南芥。擬南芥種子經(jīng)75%酒精消毒后于MS培養(yǎng)基和含有100 mmol/L NaCl的MS培養(yǎng)基上，在生長室垂直放置培養(yǎng)7 d，統(tǒng)計根長。培養(yǎng)室條件：溫度25 ℃，長日照(晝16 h/夜8 h)，50%～70%相對濕度。擬南芥材料在營養(yǎng)土中正常生長28 d后，用150 mmol/L NaCl水溶液處理10 d，利用Zang等[14]報道的方法測定MDA含量和電解質(zhì)滲透率。此外，提取擬南芥葉片RNA，利用熒光定量PCR檢測抗氧化酶基因(SOD、POD和CAT)和ABA途徑關(guān)鍵基因(RD26、RD29A和RD29B)的表達水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 GmPP2C89基因的非生物脅迫誘導(dǎo)表達模式

前期對正常生長和鹽處理的栽培大豆進行了轉(zhuǎn)錄組測序，數(shù)據(jù)已上傳NCBI數(shù)據(jù)庫(登錄號：PRJNA741583)。在轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中篩選到一個上調(diào)倍數(shù)較高的基因GmPP2C89(NaCl處理組該基因的平均FPKM值較對照組約上調(diào)42倍)(圖1-A)。本研究又用20% PEG和300 mmol/L 甘露醇溶液處理栽培大豆幼苗，利用GmPP2C89基因的表達模式。結(jié)果顯示，PEG和甘露醇處理均導(dǎo)致GmPP2C89基因表達水平顯著上調(diào)，PEG處理后12 h表達水平上調(diào)倍數(shù)最高(25倍)(圖1-B)，甘露醇處理6 h表達水平上調(diào)倍數(shù)最高(28倍)(圖1-C)。

A.鹽處理的大豆轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中GmPP2C89基因的FPKM值；B.20%PEG處理的大豆中GmPP2C89基因的表達水平； C.300 mmol/L甘露醇處理的大豆中GmPP2C89基因的表達水平。不同字母表示差異顯著(P<0.05)。圖5，6同。 A.FPKM value of GmPP2C89 gene in soybean transcriptome data treated with salt；B.Expression level of GmPP2C89 gene in soybean treated with 20% PEG； C.Expression level of GmPP2C89 gene in soybean treated with 300 mmol/L mannitol.；Different letters indicate significant differences(P<0.05).The same as Fig.5，6.

2.2 GmPP2C89基因啟動子區(qū)的順式作用元件預(yù)測

利用PlantCARE數(shù)據(jù)庫對GmPP2C89基因轉(zhuǎn)錄起始密碼子ATG上游的2 000 bp序列進行順式作用元件分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該啟動子區(qū)含有較多參與非生物脅迫響應(yīng)的元件，包括ABRE、DRE、G-box、MBS、MYB、MYC和TC-rich repeats等元件。其中ABRE元件數(shù)量最多，共4個；MYC元件3個；G-box、MBS、MYB和TC-rich repeats元件各2個；DRE元件1個(圖2)。

圖2 GmPP2C89基因啟動子區(qū)非生物脅迫響應(yīng)元件的分布Fig.2 Distribution of abiotic stress response cis-elements in the promoter of GmPP2C89 gene

2.3 不同長度的GmPP2C89基因啟動子克隆及GUS融合載體構(gòu)建

在克隆出2 000 bp的啟動子片段基礎(chǔ)上，根據(jù)順式作用元件的功能和分布區(qū)域，將啟動子片段分成3個不同長度的缺失片段，即本研究共包含4個啟動子片段：啟動子全長片段(P1)、3個5′端缺失片段(P2、P3和P4)。相比全長啟動子，P2片段缺失了MYB、MYC和ABRE元件各1個；P3片段缺失了MYB、MYC和ABRE元件各2個，DRE和TC-rich repeats元件各1個；而P4片段缺失了全部的非生物脅迫響應(yīng)元件，僅保留了核心啟動子區(qū)(圖3-A)。以大豆DNA為模板，使用高保真DNA聚合酶克隆得到長度分別為2 000，1 370，980，240 bp的啟動子片段(圖3-B)。利用同源重組技術(shù)將啟動子片段插入PBI101載體以構(gòu)建重組載體，并進行酶切驗證，證明GUS融合載體構(gòu)建成功(圖3-C)。

A.不同長度的啟動子及順式作用元件位置；B.啟動子片段克隆電泳；C.載體構(gòu)建成功酶切電泳。 A.Promoters of different lengths and cis-element positions；B.Promoter fragment cloning electrophoresis diagram； C.Vector construction successful digestion electrophoresis diagram.

2.4 轉(zhuǎn)基因擬南芥的獲得及GUS染色分析

通過浸花法將GUS融合載體轉(zhuǎn)化野生型擬南芥。利用卡那霉素篩選初步獲得抗性植株，并進一步進行PCR鑒定獲得轉(zhuǎn)基因植株(圖4-A—D)，分別用P1∷GUS、P2∷GUS、P3∷GUS、P4∷GUS表示。GUS染色結(jié)果如圖4-E所示，正常培養(yǎng)的擬南芥P1∷GUS、P2∷GUS、P3∷GUS和P4∷GUS葉片都有

A～D.不同長度的啟動子融合GUS載體轉(zhuǎn)化的擬南芥篩選和PCR鑒定；E.150 mmol/L NaCl、20%PEG和300 mmol/L甘露醇處理后的GUS染色。

較淺的藍色，說明截斷的啟動子序列也能在正常條件下啟動基因的表達。在NaCl處理后，P1∷GUS和P2∷GUS植株葉片的GUS染色明顯變深，P3∷GUS葉片次之，P4∷GUS葉片GUS表達則未被鹽處理誘導(dǎo)。PEG模擬干旱處理也導(dǎo)致P1∷GUS和P2∷GUS葉片的GUS染色變深，P3∷GUS和P4∷GUS葉片中GUS都未被誘導(dǎo)。甘露醇處理則表現(xiàn)出與鹽處理類似的現(xiàn)象，但是GUS染色相對較淺。說明GmPP2C89基因啟動子區(qū)的非生物脅迫響應(yīng)元件在鹽、干旱和滲透脅迫中發(fā)揮特定功能。

2.5 GmPP2C89基因過表達增強轉(zhuǎn)基因擬南芥耐鹽性

本研究獲得了GmPP2C89基因過表達的轉(zhuǎn)基因擬南芥GmPP2C89-OX。根長試驗表明，在正常MS培養(yǎng)基上，WT和GmPP2C89-OX擬南芥根長無顯著差異，而在含100 mmol/L NaCl的MS上GmPP2C89-OXX根長顯著高于WT(圖5-A、B)。對生長28 d的擬南芥植株進行鹽處理，結(jié)果顯示，WT和GmPP2C89-OX的生長都受到抑制，但GmPP2C89-OX的長勢明顯優(yōu)于WT(圖5-C)。測定正常和鹽處理條件下擬南芥葉片中的MDA含量(以鮮質(zhì)量計)和電解質(zhì)滲透率，發(fā)現(xiàn)鹽處理條件下擬南芥GmPP2C89-OX葉片MDA含量(以鮮質(zhì)量計)和電解質(zhì)滲透率顯著低于WT(圖4-D、E)，說明擬南芥GmPP2C89-OX在鹽脅迫條件下受傷害較輕、其耐鹽性增強。

2.6 GmPP2C89過表達植株中脅迫相關(guān)基因表達發(fā)生改變

為了探究GmPP2C89介導(dǎo)的信號途徑，利用熒光定量PCR技術(shù)檢測了參與脅迫響應(yīng)的抗氧化酶基因(SOD、POD和CAT)和ABA途徑關(guān)鍵基因(RD26、RD29A和RD29B)的表達水平，結(jié)果顯示，鹽處理后這些基因在WT和GmPP2C89-OX中都顯著上調(diào)；其中SOD、POD和RD29B在GmPP2C89-OX中的表達水平顯著高于WT；而CAT、RD26和RD29A在WT和GmPP2C89-OX間無顯著差異(圖6)。這些結(jié)果初步證實，GmPP2C89通過調(diào)控脅迫相關(guān)基因的表達，增強擬南芥對鹽脅迫的適應(yīng)能力。

A～B.MS培養(yǎng)基和含100 mmol/L NaCl的MS培養(yǎng)基上的根長表型和統(tǒng)計；C～E.28 d的擬南芥經(jīng)150 mmol/L NaCl處理10 d的表型和MDA含量、電解質(zhì)滲透率。 A—B.Root length phenotype and statistics on MS medium and MS medium with 100 mmol/L NaCl；C—E.Phenotype and MDA content， electrolytic leakage of Arabidopsis thaliana treated with 150 mmol/L NaCl for 10 d.

圖6 擬南芥植株WT和GmPP2C89-OX中脅迫相關(guān)基因的表達模式Fig.6 Expression pattern of stress-related genes in WT and GmPP2C89-OX seedlings

3 討論

轉(zhuǎn)錄調(diào)控是植物應(yīng)對不利環(huán)境因素的重要機制，通常由轉(zhuǎn)錄因子控制脅迫相關(guān)基因的表達來緩解逆境對植物造成的傷害，而在這一過程中，基因啟動子上的順式作用元件(即轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點)發(fā)揮主要作用[15]。徐金龍等[16]指出，非生物脅迫相關(guān)基因(RD29A、RD29B、RD22、ERD1等)啟動子區(qū)的E-box(G-box)、ABRE、DRE、MYB、MYC、GT-1、W-box等元件可以與特定的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合參與脅迫反應(yīng)，此外，MBS、TC-rich repeats等元件也參與植物非生物脅迫應(yīng)答。PlantCARE是植物順式作用調(diào)控元件數(shù)據(jù)庫[17]，該工具被廣泛地應(yīng)用在植物啟動子區(qū)順式作用元件的預(yù)測研究中[4，7，18]。本研究利用PlantCARE數(shù)據(jù)庫分析了GmPP2C89基因啟動子上的順式作用元件，發(fā)現(xiàn)包含ABRE、DRE、G-box、MBS、MYB、MYC和TC-rich repeats等元件，說明GmPP2C89基因表達水平受鹽、干旱和滲透脅迫誘導(dǎo)上調(diào)很可能是由某個或多個特定轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控。

陳雨倩等[18]根據(jù)順式作用元件的位置分別克隆了不同長度的麻瘋樹JcGAST1基因啟動子片段，通過煙草葉片瞬時表達和GUS染色確定了啟動子的核心區(qū)域。本研究根據(jù)GmPP2C89啟動子上非生物脅迫相關(guān)順式作用元件的分布區(qū)域，克隆了啟動子全長片段和3個不同長度的5′缺失片段，構(gòu)建了啟動子融合GUS的報告載體。可穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)基因擬南芥可能是進行啟動子響應(yīng)非生物脅迫特性研究更好的材料，任麗等[19]克隆了白樺BpTCP7基因啟動子，并利用啟動子融合GUS載體轉(zhuǎn)化擬南芥，分析了該基因的時空表達特異性，并證明NaCl、PEG 脅迫誘導(dǎo)處理后BpTCP7基因表達量上調(diào)(以擬南芥GUS染色深淺代表)。因此，將啟動子融合GUS載體轉(zhuǎn)化野生型擬南芥，獲得純合后代進行GUS染色分析。GUS染色顯示，全長啟動子能夠被這3種脅迫誘導(dǎo)驅(qū)動GUS報告基因的表達；而不包含任何非生物應(yīng)答元件的P4片段則不受誘導(dǎo)，但是其包含核心啟動子元件，能夠啟動基因的正常水平表達。P3啟動子在PEG處理后未驅(qū)動GUS基因的高表達，說明其缺失了干旱/脫水響應(yīng)元件，P3相對于P2缺失了ABRE、MYB、MYC、DRE和TC-rich repeats，其中DRE被普遍認為是一個干旱/低溫/高溫/鹽應(yīng)答元件[8]，推測DRE元件在GmPP2C89應(yīng)答干旱脅迫中起關(guān)鍵作用。

本研究利用轉(zhuǎn)基因擬南芥對GmPP2C89基因的功能做了進一步探究，發(fā)現(xiàn)過表達GmPP2C89的擬南芥的耐鹽性顯著增強。丙二醛(MDA)作為膜脂過氧化的產(chǎn)物，其含量反映了植物細胞因非生物脅迫(包括鹽脅迫)而受損的程度[20]，發(fā)現(xiàn)鹽脅迫下GmPP2C89-OX植株中的MDA含量顯著低于WT，證明GmPP2C89-OX植株受鹽害較輕?？寡趸傅幕钚栽鰪娪兄谥参餃p少氧化損傷[21]，因此，檢測了抗氧化酶編碼基因SOD、POD和CAT的表達水平，發(fā)現(xiàn)鹽脅迫下GmPP2C89-OX植株中SOD和POD的表達量顯著高于WT，說明GmPP2C89在此過程中直接或間接激活了抗氧化系統(tǒng)，進而調(diào)節(jié)植株對鹽脅迫的適應(yīng)能力。前期報道明確指出，PP2C基因可通過ABA依賴途徑參與植物鹽脅迫調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)[12-13]。ABA途徑中的關(guān)鍵基因RD26、RD29A和RD29B被多種非生物脅迫和ABA處理誘導(dǎo)上調(diào)，被認為是脅迫響應(yīng)的標記基因[22]。檢測RD26、RD29A和RD29B基因的表達水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)鹽脅迫下GmPP2C89-OX植株中RD29B的表達水平顯著高于WT，說明GmPP2C89可能通過ABA依賴途徑正調(diào)控植株耐鹽性。