梁世周 許建平 蔡文品 孔萬仲 奚經(jīng)巧 金曉立 曾云祥

血流感染的治療是全世界醫(yī)療衛(wèi)生機(jī)構(gòu)的臨床重點，有報道其致死率為18.2%～21.4%[1]。有研究結(jié)果顯示，對于膿毒性休克患者，如果每延遲1 h給予有效治療，死亡風(fēng)險增加35%[2]。因此，早期適當(dāng)使用抗生素治療對改善血流感染的預(yù)后至關(guān)重要[3]。目前，腸桿菌目菌株是引起血流感染的主要病原體，其分離率高達(dá)30%[4]。同時，近年來耐碳青霉烯腸桿菌目對全球公共衛(wèi)生構(gòu)成的威脅呈指數(shù)級增長，成為最常見的一個全球衛(wèi)生問題[5]。中國細(xì)菌耐藥監(jiān)測網(wǎng)（CHINET）顯示，2005—2019年36所三級醫(yī)院肺炎克雷伯菌對亞胺培南的耐藥率從3.0%上升至25.3%，且呈逐年遞增趨勢[6]。此外，耐碳青霉烯類藥物的大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌，已成為近年來死亡率上升最快的病原菌[7]。在腸桿菌目中，碳青霉烯類耐藥性通常是由于諸如外排泵、孔蛋白損失和產(chǎn)生大量耐藥酶等過程導(dǎo)致的，其中產(chǎn)碳青霉烯酶是最常見的耐藥機(jī)制。因此，耐藥酶的快速檢測成為近年來的熱點研究領(lǐng)域。

目前，基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜（matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS）是碳青霉烯酶活性檢測的最新進(jìn)展，被成功地用于從革蘭陰性菌落中直接檢測碳青霉烯酶的活性[8-10]。筆者嘗試?yán)肕ALDI-TOF MS直接從陽性血液培養(yǎng)瓶中對腸桿菌目細(xì)菌生產(chǎn)的碳青霉烯酶活性進(jìn)行快速檢測，并與耐藥基因PCR分子檢測結(jié)果比較，評估該方法的可靠性。

1 材料和方法

1.1 菌株來源 收集2012年1月至2018年12月溫州市中醫(yī)院各臨床科室分離的腸桿菌目細(xì)菌46株，不含重復(fù)菌株。其中產(chǎn)碳青霉烯酶腸桿菌目細(xì)菌（carbapenemase-producing Enterobacteriaceae，CPE）25株，包括攜帶 blaKPC-27株，blaNDM（包括NDM-1、4、5型）8株，blaIMP-42株，同時攜帶blaKPC-2和blaCTX-M4株，同時攜帶blaKPC-2和blaNDM-42株，同時攜帶blaNDM-1和blaIMP-42株；非產(chǎn)碳青霉烯酶腸桿菌目細(xì)菌（non-carbapenemase-producing Enterobacteriaceae，NCPE）21株 ，其 中 攜 帶blaCTX-M5株，未檢測到上述基因型且碳青霉烯類敏感的腸桿菌目細(xì)菌16株。篩查2022年3月至4月本院各病房送檢已簽發(fā)報告的陽性血培養(yǎng)標(biāo)本，收集致病菌為耐碳青霉烯類腸桿菌目細(xì)菌（carbapenemase-resistant Enterobacteriaceae,CRE）9例，非耐碳青霉烯類腸桿菌目細(xì)菌（non-carbapenemase-resistant Enterobacteriaceae,NCRE）17例，對上述26例血培養(yǎng)樣本打亂順序，作為方法驗證的臨床樣本。質(zhì)控菌株選用大腸埃希菌ATCC?25922和肺炎克雷伯ATCC?BAA1706作為陰性對照，肺炎克雷伯ATCC?BAA1705作為陽性對照，均購自浙江省臨床檢驗中心。

1.2 主要試劑和儀器 全自動快速生物質(zhì)譜檢測系統(tǒng)（Bruker autoflexTMMALDI-TOF MS）及相關(guān)配套試劑（德國布魯克科技有限公司），血培養(yǎng)瓶、Vitek2 Compact細(xì)菌鑒定與藥物敏感儀及相關(guān)配套試劑（法國梅里埃生物科技有限公司），血瓊脂平板（鄭州安圖生物股份有限公司），1.5 ml EP管若干，亞胺培南標(biāo)準(zhǔn)品（湖北惠擇普醫(yī)藥科技有限公司,CAS號：64221-86-9），十二烷基硫酸鈉（天津北辰方正化工），真空采血管（美國BD公司），高速離心機(jī)（美國賽默飛世科技公司），萬分之一天平（日本島津公司）。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)菌鑒定和藥敏試驗 采用Vitek2 Compact做細(xì)菌鑒定和藥敏試驗，結(jié)果解釋參照CLSI M100 S31標(biāo)準(zhǔn)[12]。

1.3.2 耐藥基因檢測 采用煮沸法提取細(xì)菌DNA模板。PCR體系50 μl，2×PCR Master Mix 25 μl，上、下游引物 10 μmol/L 各 1 μl，模板 DNA 2 μl，滅菌水 21 μl。PCR反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，退火溫度30 s，72℃45 s，30個循環(huán)；72℃延伸5 min。再取PCR擴(kuò)增物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，觀察并拍攝。詳細(xì)步驟及引物設(shè)計參照文獻(xiàn)[11]。

1.3.3 模擬陽性血培養(yǎng) 復(fù)融上述菌株于血平板中，過夜培養(yǎng)18 h。挑取少許菌落溶于無菌0.9%氯化鈉溶液中，配制成0.5麥?zhǔn)蠞舛染鷳乙海ㄏ喈?dāng)于1.5×108CFU/ml），稀釋至1×103CFU/ml。在輸血科收集報廢O型懸浮紅細(xì)胞和O型血漿，混合制成紅細(xì)胞壓積（Hct）約為0.4的模擬人血液。取1 ml上述菌懸液混于9 ml人模擬血液，注入血培養(yǎng)瓶中，放置血培養(yǎng)儀等待報陽后取出備用。

1.4 血培養(yǎng)液前處理

1.4.1 制備菌懸液 用注射器抽取報陽后的血培養(yǎng)液5 ml，置于真空采血管內(nèi)，1 170 r/min，離心5 min，將紅細(xì)胞沉置分離膠下部，棄上清液。加入0.5%十二烷基硫酸鈉（SDS）溶液1 ml洗滌，用旋渦振蕩器混勻后，再次1 170 r/min，離心5 min。該洗滌步驟重復(fù)進(jìn)行2次，棄上清液，加入0.9%氯化鈉溶液1 ml復(fù)混，獲得單一的菌懸液備用。

1.4.2 菌株鑒定 于EP管中分別加入150 μl上述菌懸液和450 μl無水乙醇，混勻后16 000 r/min，離心2 min，棄上清液后加入20 μl 70%甲酸溶液和20 μl乙腈，混勻，再次 16 000 r/min，離心 2 min。取上清液 1 μl，點靶；干燥后滴加1 μl基質(zhì)液（α-HCCA），晾干后上機(jī)。

1.4.3 亞胺培南分解試驗 利用萬分之一天平稱取10 mg亞胺培南和20 mg SDS溶于10 ml 0.9%氯化鈉注射液中，配制成0.2%SDS、1.0 mg/ml亞胺培南混合液，備用。吸取30 μl上述混合液于EP管中，再加入30 μl菌懸液，混勻后放置37℃水浴箱2 h。隨后，將EP管16 000 r/min，離心2 min，取上清液 1 μl，點靶；干燥后滴加1 μl基質(zhì)液，晾干，上機(jī)。

1.5 MALDI-TOF MS分析及結(jié)果判定 質(zhì)譜儀采用反射正離子模式，手動采集光譜，采集區(qū)間為100～600Da；參數(shù)設(shè)置：離子源1∶10.00 kV；離子源2∶9.08 kV；鏡頭：3.00 kV；脈沖離子提取時間：10 ns；激光頻率：60.0 Hz。應(yīng)用flexControl 3.3軟件(Bruker Daltonics)分析所得光譜。

菌種鑒定收集2 000～20 000 Da的光譜，用BTS進(jìn)行儀器校準(zhǔn)，通過軟件IVD MALDI Biotyper 3.1版識別菌名，并且以軟件給出的Biotyper log值評價鑒定效果：分值≥2.0視為鑒定到種水平，1.70～1.99視為鑒定到屬水平，分值＜1.70視為不可信結(jié)果。

通過觀察亞胺培南（Imipenem:C11H17N3O4S,相對分子質(zhì)量：299.35 g/mol）產(chǎn)生的質(zhì)譜峰[Imipenem+H+]:300 m/z、亞胺培南和基質(zhì)液混合物[Imipenem+α-HCCA+H+]：489 m/z質(zhì)譜峰，兩處峰完全消失，判定為試驗菌產(chǎn)生可以分解亞胺培南的碳青霉烯酶。

1.6 方法驗證 對上述26株臨床陽性血培養(yǎng)樣本按照1.3～1.4步驟操作。

1.7 質(zhì)量控制

1.7.1 質(zhì)譜峰校準(zhǔn) 利用基質(zhì)液中α-氰基-4-羥基肉桂酸（α-HCCA：C10H7NO3,相對分子質(zhì)量189.17 g/mol）電離產(chǎn)生的質(zhì)譜峰對波峰采集區(qū)間0～600 Da進(jìn)行校準(zhǔn)，校準(zhǔn)峰分別為 HCCA_[M+H+]：190.050 m/z、HCCA_[M+Na+]：212.032 m/z和 HCCA_[2M+H+]：379.092 m/z，3個校準(zhǔn)峰值同時出現(xiàn)，并且每個峰的最大偏差（Err/ppm）都不超過±100 ppm，即視為校準(zhǔn)通過[14]。同時，把α-HCCA的質(zhì)譜峰作為空白實驗對照。

1.7.2 藥物對照 取0.5 g/ml亞胺培南混合0.1%SDS溶液1 μl點靶干燥后滴加基質(zhì)液，上機(jī)后收集的質(zhì)譜峰作為此次實驗的藥物對照。

1.7.3 陰陽性對照 以大腸埃希菌ATCC?25922和肺炎克雷伯菌ATCC?BAA1706作為不產(chǎn)碳青霉烯酶的陰性對照株，肺炎克雷伯菌ATCC?BAA1705作為產(chǎn)KPC的陽性對照株，按照上述實驗流程檢測。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件。計量資料以表示；使用Kappa對質(zhì)譜法結(jié)果和原先檢出的基因檢測結(jié)果進(jìn)行一致性檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 質(zhì)譜峰校準(zhǔn)分析 經(jīng)校準(zhǔn)，質(zhì)譜儀內(nèi)部校準(zhǔn)通過，見圖1a。圖1b中300 Da處為亞胺培南分子電離產(chǎn)生的質(zhì)譜峰，和約為489 Da處由亞胺培南與HCCA混合物形成的質(zhì)譜峰，以及SDS（C12H25SO4Na，相對分子質(zhì)量：288.38）分子_[SDS+Na+]:311 Da處的質(zhì)譜峰。

圖1 質(zhì)譜校準(zhǔn)峰、亞胺培南和SDS質(zhì)譜峰示意圖

2.2 藥敏及質(zhì)譜結(jié)果 本實驗共收集CPE 25株和NCPE 21株，包含5種腸桿菌目細(xì)菌，攜帶碳青霉烯酶基因blaKPC-2、blaIMP-4和blaNDM及β內(nèi)酰胺酶blaCTX-M，見表1。藥敏結(jié)果顯示，25株CPE對亞胺培南和厄他培南的最小抑菌濃度（MIC）分別為4～≥16不等，另外21株NCPE的MIC為≤0.5～2。陽性血培養(yǎng)液提純菌液的直接細(xì)菌鑒定結(jié)果同之前純菌落鑒定結(jié)果完全一致，軟件給出的Biotyper log值為2.188±0.102，種水平鑒定率為96.0%，屬水平鑒定率為100.0%。在亞胺培南水解試驗中，結(jié)果顯示：25株CPE生成的質(zhì)譜圖均未出現(xiàn)300 m/z和489 m/z處的質(zhì)譜峰，提示亞胺培南已被完全水解。而21株NCPE則全部檢測到300 m/z和489 m/z的質(zhì)譜峰，見圖2。應(yīng)用一致性檢驗結(jié)果Kappa=1，提示兩種方法高度一致。

表1 49株腸桿菌目PCR、藥敏及血培養(yǎng)液直接檢測的質(zhì)譜結(jié)果

圖2 10例300 m/z和489 m/z處的質(zhì)譜峰消存情況（a：空白對照；b：藥物對照；c:肺炎克雷伯菌ATCC?BAA1705；d：肺炎克雷伯菌ATCC?BAA1706；e：產(chǎn)KPC-2肺炎克雷伯菌；f：產(chǎn)IMP-4植生拉烏爾菌；g：產(chǎn)NDM-1陰溝腸桿菌；h：產(chǎn)KPC-2和NDM-4肺炎克雷伯菌；i:產(chǎn)CTX-M肺炎克雷伯菌；j：無攜帶耐藥基因的大腸埃希菌）

2.3 質(zhì)譜圖結(jié)果 所有質(zhì)譜圖結(jié)果均表現(xiàn)為300 m/z和489 m/z同時存在或同時消失，未出現(xiàn)兩處峰結(jié)果不一致的結(jié)果。同時311 m/z處由SDS生成的質(zhì)譜峰均高于300 m/z處質(zhì)譜峰，且十分穩(wěn)定。

2.4 方法驗證結(jié)果 驗證結(jié)果顯示，其中有17例出現(xiàn)300 m/z和489 m/z處質(zhì)譜峰，且均對應(yīng)17株碳青霉烯類藥物敏感的菌株。剩下9例未出現(xiàn)這兩處質(zhì)譜峰，對應(yīng)9株耐碳青霉烯類藥物的腸桿菌目病原菌。統(tǒng)計結(jié)果顯示其靈敏度和特異度均為1.00。

3 討論

目前，根據(jù)CLSI和EUCAST指南，臨床實驗室應(yīng)報告碳青霉烯類藥物的敏感性，而在確認(rèn)碳青霉烯酶的產(chǎn)生未做必要性要求。因此，自動化系統(tǒng)習(xí)慣性地忽視碳青霉烯酶的檢測。近年來，針對CPE可以有效且快速分解亞胺培南的特性，通過飛行時間質(zhì)譜技術(shù)捕捉亞胺培南所顯示的特征譜峰，檢測其水解情況，從而判斷碳青霉烯酶活性的方法逐漸被開發(fā)。而本實驗證實，該方法同樣適用于在陽性血培養(yǎng)液中對CPE的檢出。

本實驗篩選46株經(jīng)確定常見碳青霉烯酶基因型的細(xì)菌，模擬血培養(yǎng)報陽后，再經(jīng)MALDI-TOF MS直接對血培養(yǎng)液做細(xì)菌鑒定和亞胺培南水解實驗。結(jié)果顯示，質(zhì)譜檢測21株CPE的結(jié)果均未檢測到300 m/z和489 m/z處的質(zhì)譜峰，而25株NCPE則均可檢測到，對比基因表型高度一致。此外，對血培養(yǎng)液直接鑒定的細(xì)菌種水平鑒定率為96.0%。該數(shù)據(jù)與國外相關(guān)報道接近[13-14]。

在質(zhì)譜圖方面，本實驗選擇300 m/z和489 m/z兩處質(zhì)譜峰作為結(jié)果的判斷，旨在避免因為細(xì)菌自身蛋白或其他雜質(zhì)造成300 m/z或489 m/z任一處出現(xiàn)假性藥物峰的錯誤判讀[15]。因為一旦出現(xiàn)這兩處峰的結(jié)果不一致，實驗人員可以對結(jié)果質(zhì)疑并重新評估。然而，本實驗均未出現(xiàn)該情況。此外，311 m/z處由SDS產(chǎn)生的質(zhì)譜峰極其穩(wěn)定，且表現(xiàn)出相較其他譜峰更高的分辨率。SDS在實驗中作為去污劑和表面活性劑，分別在血培養(yǎng)液的洗滌和上清液點靶后的快速干燥上起相應(yīng)作用。通過涂片在顯微鏡下發(fā)現(xiàn)，未加入SDS洗滌的血培養(yǎng)液攜帶豐富的雜質(zhì)，而這些雜質(zhì)將會使下一步細(xì)菌鑒定的Biotyper log值下降0.5分以上（數(shù)據(jù)未顯示）。并且，SDS的陰離子表面活性劑功能可以改變液體表面張力，從而克服上清液在靶板上干燥慢的缺陷。有研究表明，補(bǔ)充SDS在任何情況下都不會改變抗生素峰譜[15]，本實驗中也得以證實。

本研究選擇亞胺培南作為水解底物，其相較于美羅培南和厄他培南，具備水解時間快[8]，獲得的質(zhì)譜峰通常更清晰，使結(jié)果更易判讀[16]等好處。但是，在本實驗中未發(fā)現(xiàn)亞胺培南降解產(chǎn)物對應(yīng)的峰，即使是重復(fù)的孵化和測量也沒有獲得更好可解釋的結(jié)果。這一點與相關(guān)報道一致[13,16]。這可能與其水解產(chǎn)物的不穩(wěn)定性有關(guān)[15]，但目前尚未被證實。在本團(tuán)隊前期實驗中發(fā)現(xiàn)，部分梅里埃生產(chǎn)的血培養(yǎng)瓶中含有碳粒成分，這對微生物蛋白的提取及純化影響較大，不宜進(jìn)行直接鑒定。然而，由于菌株收集有限，本研究只局限對腸桿菌目細(xì)菌的檢測，未納入非發(fā)酵菌，這點將在后續(xù)的研究中改進(jìn)。

綜上所述，MALDI-TOF MS可以直接從血培養(yǎng)液中鑒定病原菌及檢測碳青霉烯酶活性，且表現(xiàn)出極好的靈敏度和特異度，這或?qū)εR床及早調(diào)整抗菌藥物治療和實施感染控制措施提供值得期待的應(yīng)用前景。