楊昕，劉芳，張繼朋，張順

陜西中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院1病理科，3心胸外科，陜西 咸陽 712000 2空軍軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院胸外科，西安 710038

肺癌的病死率在過去30年上升尤為明顯，非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）占肺癌的85%[1-2]。該病已成為嚴(yán)重危害人類健康的重大疾病，尋求新的NSCLC診療手段是亟待解決的難題。近年來，分子生物學(xué)飛速發(fā)展，使得臨床提高了對NSCLC的分子特征認(rèn)知。了解腫瘤相關(guān)蛋白的變化，對指導(dǎo)臨床評估NSCLC預(yù)后有重要意義。已有多項研究報道，Beclin-1介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞自噬，與肺癌、前列腺癌等惡性腫瘤的病情進(jìn)展密切相關(guān)[3-4]。苯并咪唑出芽抑制解除同源物蛋白1（budding unin-hibited by benzimidazoles 1，BUB1）可調(diào)控腫瘤細(xì)胞生物學(xué)行為[5]。目前，BUB1與NSCLC患者病情進(jìn)展、預(yù)后關(guān)系的研究較少。本研究探討B(tài)eclin-1、BUB1在NSCLC中的表達(dá)及對預(yù)后的影響，以期為臨床診治NSCLC提供參考依據(jù)，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2018年1月至2020年1月陜西中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院收治的NSCLC患者的病歷資料。納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)纖維支氣管鏡/經(jīng)皮肺穿刺組織活檢病理或細(xì)針穿刺、痰細(xì)胞學(xué)確診為NSCLC[6]；②既往未接受過化療或其他抗腫瘤藥物治療；③除腫瘤原發(fā)疾病外，無其他明顯威脅生存的疾病，如嚴(yán)重肺功能不全、心功能不全、肝功能或腎功能不全、嚴(yán)重貧血等。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并第二原發(fā)惡性腫瘤；②小細(xì)胞肺癌；③精神障礙。根據(jù)納入、排除標(biāo)準(zhǔn)，共納入109例NSCLC患者，其中，男68例，女41例；年齡55～83歲，平均（60.11±5.36）歲；病程0.95～3.17年，平均（1.45±0.47）年。選取 109例NSCLC患者的腫瘤組織及癌旁正常組織（距腫瘤5 cm以上）。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)通過，所有患者均知情同意并簽署知情同意書。

1.2 Beclin-1、BUB1蛋白檢測方法

采用免疫組化法檢測Beclin-1、BUB1蛋白表達(dá)情況。蠟塊經(jīng)連續(xù)切片（厚度4 μm）后，進(jìn)行免疫組化染色。均經(jīng)甲醛溶液固定，石蠟包埋，載玻片泡酸，高溫滅菌，用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered solution，PBS）洗滌，多聚賴氨酸涂片。顯色液的配用：取一無菌試管加入0.85 ml蒸餾水，根據(jù)二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）試劑盒要求，按顯色劑A、B、C次序各取5μl加入無菌試管中，充分振蕩，配制成l ml的DAB顯色液。室溫下染色時間為3～5 min。后將經(jīng)DAB顯色液顯色的腫瘤組織及癌旁正常組織標(biāo)本使用蘇木精復(fù)染、脫水、樹膠封固。最后在顯微鏡下觀察Beclin-1、BUB1蛋白表達(dá)情況。

1.3 陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)

光學(xué)顯微鏡下觀察Beclin-1及BUB1蛋白染色情況。根據(jù)細(xì)胞核著色情況判定陽性及陰性，由兩位病理科醫(yī)師獨立評分。陽性細(xì)胞比例評分：≤5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，＞75%為4分；染色強度評分：未染色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。染色指數(shù)=陽性細(xì)胞比例評分+染色強度評分。染色指數(shù)＞3分為陽性表達(dá)，染色指數(shù)≤3分為陰性表達(dá)[7]。

1.4 觀察指標(biāo)

比較不同組織中Beclin-1及BUB1蛋白陽性表達(dá)率，分析二者與NSCLC患者臨床特征及預(yù)后的關(guān)系。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用t檢驗；計數(shù)資料以例數(shù)及率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Beclin-1及BUB1蛋白表達(dá)情況的比較

腫瘤組織中Beclin-1陽性表達(dá)率明顯低于癌旁正常組織，BUB1陽性表達(dá)率明顯高于癌旁正常組織，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。（表1）

表1 NSCLC腫瘤組織及癌旁正常組織中Beclin-1及BUB1蛋白表達(dá)情況的比較[n（%）]

2.2 Beclin-1及BUB1與NSCLC患者臨床特征的關(guān)系

不同性別、年齡、腫瘤直徑、組織學(xué)類型NSCLC患者的NSCLC組織中Beclin-1及BUB1陽性表達(dá)率比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義與（P＞0.05）；不同分化程度、TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況NSCLC患者的NSCLC組織中Beclin-1及BUB1陽性表達(dá)率比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。（表2）

表2 不同臨床特征NSCLC患者的NSCLC組織中Beclin-1及BUB1表達(dá)情況的比較

2.3 不同預(yù)后NSCLC患者Beclin-1及BUB1表達(dá)情況的比較

2年后，109例NSCLC患者生存61例（55.96%），死亡48例（44.04%）。死亡患者Beclin-1陽性表達(dá)率低于生存患者，BUB1陽性表達(dá)率高于生存患者，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。（表3）

表3 不同預(yù)后NSCLC患者Beclin-1及BUB1表達(dá)情況的比較[n（%）]

3 討論

肺癌在男性腫瘤相關(guān)性死亡原因中居首位，在女性腫瘤相關(guān)性死亡原因中居第二位，目前已成為世界范圍內(nèi)腫瘤相關(guān)性死亡的主要原因之一[8]。研究顯示，隨著診療及治療技術(shù)的提升，NSCLC患者生存率得到一定提升，但仍不理想[9-10]。

Beclin-1是程序性死亡細(xì)胞通路的相關(guān)因子，可通過細(xì)胞環(huán)境的刺激啟動、抑制細(xì)胞凋亡的過程，在惡性腫瘤中發(fā)揮關(guān)鍵作用[11]。BUB1是在細(xì)胞間期時合成的一種蛋白，首先在某些細(xì)胞的分裂前期的著絲點上被發(fā)現(xiàn)，與細(xì)胞分化及衰老相關(guān)[12]。本研究通過免疫組化法檢測Beclin-1、BUB1表達(dá)情況發(fā)現(xiàn)，腫瘤組織中Beclin-1陽性表達(dá)率明顯低于癌旁正常組織，BUB1陽性表達(dá)率明顯高于癌旁正常組織，可見Beclin-1、BUB1蛋白的調(diào)控在NSCLC發(fā)生發(fā)展的起始階段發(fā)揮重要作用。

既往文獻(xiàn)報道，腫瘤細(xì)胞可以通過凋亡被消滅，而Beclin-1在細(xì)胞發(fā)生凋亡時受到抑制，在腫瘤細(xì)胞被激活的情況下，Beclin-1可具有保護腫瘤細(xì)胞免受凋亡的作用，成為保護性蛋白[13-14]。目前，關(guān)于BUB1與NSCLC發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后的關(guān)系鮮有報道，但已有研究證實，其與前列腺癌和婦科惡性腫瘤存在聯(lián)系，認(rèn)為BUB1通過多種分子生物學(xué)機制參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)過程[15]。BUB1陽性表達(dá)率升高可能會導(dǎo)致有絲分裂檢查點功能異常，細(xì)胞控制有絲分裂進(jìn)程的機制失效，使得染色體異常分離形成非整倍體，引起細(xì)胞異常增殖，最終推動細(xì)胞的惡化進(jìn)程，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。本研究發(fā)現(xiàn)，Beclin-1、BUB1表達(dá)與分化程度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。隨訪2年，109例NSCLC患者中，生存61例（55.96%），死亡48例（44.04%）；死亡患者Beclin-1陽性表達(dá)率低于生存患者，BUB1陽性表達(dá)率高于生存患者，提示Beclin-1、BUB1與NSCLC患者病情進(jìn)展、預(yù)后密切相關(guān)，進(jìn)一步證實上述觀點。Beclin-1、BUB1表達(dá)可用于NSCLC患者的預(yù)后評估，二者與NSCLC臨床特征有關(guān)，皆可作為診斷早期NSCLC的標(biāo)志物，提高NSCLC的早期診斷率，是NSCLC早期診斷和靶向治療的新方向。但本研究存在一定的局限性，Beclin-1、BUB1具體是怎樣影響NSCLC細(xì)胞的功能，需進(jìn)一步研究加以闡述。

綜上所述，Beclin-1、BUB1參與NSCLC的發(fā)生、發(fā)展過程，且Beclin-1陰性表達(dá)、BUB1陽性表達(dá)會增加NSCLC患者預(yù)后死亡的風(fēng)險，二者對NSCLC的發(fā)生及發(fā)展可能起到一定的調(diào)控作用。