王 婷，杜令倩

牙周炎疾病進展程度與局部多種調控因子的變化有關[5]。作為牙周組織中重要的間充質干細胞，牙周膜干細胞(periodontal ligament stem cells，PDLSCs)具有自我更新和多向分化能力，卻往往因局部炎癥微環(huán)境導致過早凋亡，嚴重影響其增殖能力及成骨能力[6-8]。有研究發(fā)現(xiàn)，Ghrelin可在多種干細胞中調控凋亡[9-10]。其能否在PDLSCs中發(fā)揮作用目前尚不可知。

本研究擬探討Ghrelin對PDLSCs增殖和凋亡的影響及可能的調控機制，為實現(xiàn)Ghrelin在牙周治療中的應用提供重要的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

α-MEM培養(yǎng)基(Hyclone，美國)，胰蛋白酶-EDTA消化液、雙抗、油紅O染色液、Calcein-AM/PI活細胞/死細胞雙染試劑盒(Solarbio，中國)，Ghrelin(ab120230)、Ghrelin受體GHS-R1α拮抗劑DLS(ab141148)(Abcam，美國)，2%茜素紅染液(雷根生物，中國)，鼠抗人CD29、CD44、CD73、CD31、CD34單克隆抗體(Biolegend，美國)，CCK-8試劑盒(同仁，日本)，Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒(聯(lián)科生物，中國)，一步法TUNEL原位細胞凋亡檢測試劑盒(Elabscience，中國)，紫外分光光度儀(BMGLabtech，德國)，倒置相差顯微鏡(Olympus，日本)，流式細胞儀(CytoFLEX，美國)，熒光倒置顯微鏡及照相系統(tǒng)(Leica，德國)。

1.2 Ghrelin和DLS配制

Ghrelin配制：將1 mg Ghrelin溶解于20 mL無菌水中，配制成50 μg/mL的儲存液，-20 ℃保存?zhèn)溆?。使用時，將儲存液用培養(yǎng)基按濃度梯度稀釋到50、100、200、400 ng/mL。

DLS配制：將5 mg DLS溶解于2.69 mL無菌水中，配制成濃度為2 mmol/L的儲存液，-20 ℃保存?zhèn)溆?。使用時，將儲存液稀釋至20 μmol/L。

1.3 PDLSCs培養(yǎng)

研究方案經山東大學口腔醫(yī)學院倫理委員會(NO.20220105)批準，每位捐贈者均知情同意。取臨床上12～20歲拔除的牙周健康無齲壞的正畸牙或第三磨牙，刮取牙根中1/3處牙周膜組織并切成小塊，經含5%雙抗的PBS沖洗3次后，用探針將切碎的小塊組織平鋪于25 cm2培養(yǎng)瓶底，瓶內放入4 mL完全培養(yǎng)基(含20% FBS和1%雙抗的α-MEM)，倒置放入培養(yǎng)箱，3～4 h后翻瓶，并于37 ℃、5%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)，每3～4 d換液，連續(xù)培養(yǎng)2周。取對數(shù)生長期的第一代細胞，通過有限稀釋法擴大培養(yǎng)得到PDLSCs，取P3～P5代的細胞用于后續(xù)實驗。

1.4 PDLSCs的鑒定

1.4.1 流式細胞術分析PDLSCs細胞表面標記抗原 取活性良好的P3代PDLSCs，用含有2% FBS的PBS離心洗滌3次后，將細胞與鼠抗人CD29、CD44、CD73、CD31和CD34單克隆抗體(濃度均為2.5 μg/mL)在冰上避光孵育1 h；未經任何抗體處理的細胞用作空白對照。孵育后，用PBS再次洗滌細胞3次，流式細胞儀上機檢測。

1.4.2 PDLSCs成骨成脂分化 PDLSCs以2×105個/孔的密度接種在6孔板上，次日分別更換成骨誘導培養(yǎng)基(含1×10-8mol/L地塞米松、10 mmol/L β-甘油磷酸鈉、50 mg/L維生素C的完全培養(yǎng)基)和成脂誘導培養(yǎng)基(含1 μmol/L地塞米松、10 μg/mL胰島素、0.5 mmol/L IBMX、0.2 mmol/L吲哚美辛的完全培養(yǎng)基)，每3 d換液，分別誘導28 d，PBS沖洗，4%多聚甲醛固定后，分別用2%茜素紅染色液或油紅O染色液染色并于倒置顯微鏡下拍照。

(2)提高高技術產業(yè)內部的創(chuàng)新能力，注重創(chuàng)新技術的開發(fā)，增強創(chuàng)新技術的競爭力。高技術產業(yè)之所以獲得快速的成長，主要依靠的是創(chuàng)新技術的迅猛發(fā)展。創(chuàng)新主體要想在眾多競爭對手中脫穎而出，其關鍵就是創(chuàng)新技術。

1.5 細胞增殖實驗(CCK-8比色法)

PDLSCs以5×103個/孔的細胞密度接種到96孔板中，于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。待細胞貼壁后，分別更換濃度為0(對照組)、50、100、200、400 ng/mL Ghrelin的培養(yǎng)基(含0.1% FBS)。分別孵育24 h和48 h后，于避光條件下每孔加入10 μL CCK-8檢測液，培養(yǎng)箱中避光孵育2.5 h，酶標儀檢測450 nm 波長處的OD值。上述實驗重復3次。

1.6 細胞活死染色

將PDLSCs以3×104個/孔的細胞密度接種到24孔板中，次日待細胞貼壁后更換培養(yǎng)液，按照以下分組處理。對照組：加入不含F(xiàn)BS的α-MEM培養(yǎng)液；100 ng/mL、200 ng/mL和400 ng/mL Ghrelin組：分別加入100、200、400 ng/mL Ghrelin不含F(xiàn)BS的α-MEM培養(yǎng)液。各組饑餓培養(yǎng)48 h后，按照試劑盒說明書行活死細胞染色，即去除培養(yǎng)基后，用試劑盒內的緩沖液清洗2～3次，每孔加入200 μL染色工作液，避光孵育15 min后去除染色液，熒光顯微鏡觀察活死細胞熒光染色情況并拍照。Image J軟件分析活死細胞數(shù)量并計算細胞存活率，細胞存活率=活細胞數(shù)÷全部細胞數(shù)×100%。

1.7 流式細胞術檢測細胞凋亡

PDLSCs以2.5×105個/孔的細胞密度接種到6孔板中，24 h細胞貼壁后，采用饑餓誘導細胞凋亡模型[11]。Nc組：加入10% FBS的α-MEM；對照組、200 ng/mL Ghrelin組、400 ng/mL Ghrelin組：分組處理同1.6；200 ng/mL Ghrelin + DLS組：需提前加入20 μmol/L DLS，預處理30 min后再加入200 ng/mL Ghrelin。各組均于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h后，用不含EDTA的胰酶消化收集細胞，以預冷的PBS沖洗3次，按照Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒說明書，每孔加入500 μL Binding buffer、5 μL AnnexinV-FITC和10 μL PI重懸混勻細胞，避光孵育15 min后，上機檢測。

1.8 TUNEL染色

取生長活性狀態(tài)良好的P3代PDLSCs，以4×104個/孔的密度接種到24孔板中。接種前，孔板中提前放入大小適宜的細胞爬片，待24 h后細胞貼壁，按1.7分組處理。細胞培養(yǎng)72 h后，按照TUNEL試劑盒染色說明書操作。去除培養(yǎng)液，PBS漂洗2遍，4%多聚甲醛室溫固定20 min，0.2% TritonX-100于37℃通透10 min。取出爬片放入濕盒，滴加標記工作液于37℃避光反應1 h。PBS漂洗3次，DAPI復染，避光孵育5 min，PBS漂洗后，干燥，用含抗熒光淬滅劑的封片劑封片，熒光顯微鏡觀察熒光染色情況并拍照。

1.9 統(tǒng)計學分析

以上實驗數(shù)據(jù)均采用SPSS 19.0統(tǒng)計分析軟件進行統(tǒng)計，數(shù)據(jù)均用“均數(shù)±標準差”表示，采用方差分析，P<0.05時認為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 PDLSCs鑒定

2.1.1 細胞表面抗原 流式細胞技術檢測結果顯示，本實驗分離培養(yǎng)的PDLSCs表面陽性表達間充質干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)表面標記物CD29、CD44和CD73，而造血干細胞標記物CD31和CD34呈陰性表達(圖1)。這表明PDLSCs與MSCs具有相似的表型。

圖1 流式細胞儀檢測牙周膜干細胞表面相關抗原

2.1.2 牙周膜干細胞具有多向分化能力 PDLSCs經成骨誘導培養(yǎng)28 d后，鏡下觀察顯示細胞呈現(xiàn)復層生長，茜素紅染色可見散在的紅色礦化結節(jié)形成，證明PDLSCs具有成骨分化能力。成脂誘導培養(yǎng)28 d后經油紅O染色，鏡下可見多個脂滴形成，證明細胞具有成脂分化的能力(圖2)。

A：PDLSCs成骨分化；B：PDLSCs成脂分化

2.2 Ghrelin促進PDLSCs增殖

CCK-8檢測結果顯示，與未加Ghrelin的對照組相比，50、100、200、400 ng/mL濃度Ghrelin分別作用24 h和48 h后，均未對PDLSCs細胞表現(xiàn)出細胞毒性。100 ng/mL和200 ng/mL的Ghrelin可以明顯促進PDLSCs增殖(P<0.05)(圖3)。

與對照組相比，*：P<0.05

2.3 Ghrelin抑制饑餓誘導的PDLSCs死亡

活死細胞染色結果顯示，PDLSCs經無血清饑餓誘導48 h后，多數(shù)細胞存活(熒光呈綠色)，少數(shù)細胞死亡(熒光呈紅色)。對照組、100 ng/mL組、200 ng/mL組、400 ng/mL組的細胞存活率分別為(89.04±0.80)%、(97.04±0.04)%、(97.84±0.41)%、(91.26±1.05)%。與對照組相比，100、200、400 ng/mL Ghrelin處理組的細胞存活率明顯提高(P<0.05)，Ghrelin對饑餓誘導的細胞死亡具有保護作用(圖4)。

圖4 細胞饑餓誘導后活/死細胞染色

2.4 Ghrelin抑制饑餓誘導的PDLSCs凋亡

2.4.1 流式細胞術檢測PDLSCs凋亡 對照組(無FBS)較Nc組(含10% FBS)細胞凋亡率明顯增高(P<0.000 1)，本研究成功建立饑餓誘導的細胞凋亡模型。與對照組相比，200 ng/mL和400 ng/mL的Ghrelin均可以明顯降低細胞凋亡率，且200 ng/mL Ghrelin抑制凋亡作用更好(P<0.05)。為探究Ghrelin發(fā)揮保護作用的機制，本研究增加Ghrelin受體拮抗劑DLS預處理組。結果表明，DLS預處理后明顯逆轉了Ghrelin對細胞凋亡的保護作用(P<0.001)(圖5)。

A：對照組；B：200 ng/mL Ghrelin組；C：400 ng/mL Ghrelin組；D：200 ng/mL Ghrelin+DLS組；E：Nc組；F：統(tǒng)計分析結果；*：P<0.05；**：P<0.01；***：P<0.001；****：P<0.000 1

2.4.2 TUNEL染色檢測PDLSCs凋亡 TUNEL染色結果表明，無血清饑餓誘導72 h后，與Nc組(含10% FBS)相比，PDLSCs的TUNEL染色陽性細胞數(shù)顯著增加。與對照組相比，細胞經200 ng/mL和400 ng/mL Ghrelin作用后，其TUNEL染色陽性細胞數(shù)明顯減少，但Ghrelin抑制細胞凋亡的作用可被受體拮抗劑DLS所逆轉，這提示Ghrelin抑制凋亡的作用與Ghrelin結合PDLSCs表面受體GHS-R1α有關(圖6)。

圖6 TUNEL染色檢測細胞凋亡

3 討 論

PDLSCs因具備高增殖、自我更新和多向分化能力，被認為是恢復牙周組織再生最具有可行性的種子細胞。但實際應用中，PDLSCs常因衰老及炎癥作用而發(fā)生早期凋亡，失去其在組織再生應用中的價值。Ghrelin在唾液及齦溝液中呈高表達。健康人群齦溝液中Ghrelin濃度在(19 129±13 280)pg/mL，是血液及唾液的500余倍；Ghrelin表達量隨炎癥變化而變化[12]，牙周炎患者齦溝液中Ghrelin表達降低[13]，血液中Ghrelin的表達升高[14]，提示Ghrelin可能參與維持牙周組織穩(wěn)態(tài)，Ghrelin表達失調與牙周炎癥相關。PDLSCs作為牙周組織中重要的間充質干細胞，Ghrelin對其增殖及凋亡作用的研究未見報道。

本研究成功分離培養(yǎng)PDLSCs，根據(jù)齦溝液Ghrelin濃度及前期預實驗結果，研究濃度選取50～400 ng/mL用于后續(xù)實驗。CCK-8結果表明50～400 ng/mL的Ghrelin均未表現(xiàn)出細胞毒性作用，并且當濃度在100、200 ng/mL時可以明顯促進細胞增殖。Miao等[15]發(fā)現(xiàn)Ghrelin可以通過促進胰島素樣生長因子-1的表達來促進3T3-L1細胞的增殖，其促增殖效應與本研究結果相一致。另外，Ghrelin對干細胞的促增殖作用還可能與G1期阻滯抑制有關[16]。

細胞類型不同，Ghrelin對細胞凋亡作用的影響不同。Ghrelin對卵母細胞、原癌細胞具有促進凋亡作用，對心肌細胞、神經干細胞具有抑制凋亡作用[17-20]。本研究檢測了Ghrelin對饑餓誘導的PDLSCs細胞死亡和凋亡的影響，結果發(fā)現(xiàn)Ghrelin可以明顯提高相關細胞存活率，減少細胞凋亡率，表明Ghrelin可能對PDLSCs發(fā)揮重要的保護作用，其作用可能與Ghrelin與GHS-R1α結合激活下游ERK通路及PI3K/AKT通路，進而抑制Caspase3活化有關[21]。Ghrelin在全身多處器官如心臟[22]、腎臟[23]和腦[24]等中發(fā)揮保護作用，與其激活受體GHS-R1α有關[25]。GHS-R1α在牙齦上皮細胞、牙齦下結締組織以及牙周膜等牙周組織中均高度表達[12]。同時研究發(fā)現(xiàn)，牙周膜細胞及牙齦細胞表面的GHS-R1α受體也會通過炎癥刺激短期表達升高來實現(xiàn)牙周保護作用[26]。凋亡是細胞面臨饑餓和氧化應激、損傷等時最常見的細胞死亡形式，Ghrelin對PDLSCs的凋亡作用直接影響著Ghrelin的臨床應用。本研究中，200 ng/mL較400 ng/mL Ghrelin抑制凋亡的作用更明顯。一方面可能與200 ng/mL的濃度能更好地促進細胞增殖有關；另一方面可能因為Ghrelin作為配體的量過多，超過GHS-R1α可結合的量，引起ERK和PI3K信號通路負反饋調控機制激活[27]。本研究發(fā)現(xiàn)Ghrelin對細胞凋亡的抑制作用可以被GHS-R1α拮抗劑阻斷，表明Ghrelin和細胞表面受體GHS-R1α結合參與抑制細胞凋亡過程。有研究報道Ghrelin通過激活GHS-R1α/AMPK/Sirt1/PGC-1α/UCP2信號通路抑制神經元的凋亡，發(fā)揮神經保護作用，Ghrelin/GHS-R1α在PDLSCs發(fā)揮的抗凋亡效應是否與激活了此信號通路相關，有待于進一步的研究[28]。

綜上，Ghrelin可以促進PDLSCs增殖、抑制其凋亡，對PDLSCs發(fā)揮保護作用，可能與Ghrelin受體GHS-R1α的表達升高相關。局部施加具有抗炎、抗凋亡、促增殖作用的Ghrelin用于牙周炎的治療是具有可行性的，但Ghrelin抑制凋亡的作用機制及其體內應用安全性仍有待進一步研究。