李春鑫，張永戰(zhàn)，陳國參，楊鐵鋼，張英濤，李 春，董誠明

（1. 河南省科學(xué)院生物研究所有限責(zé)任公司，河南 鄭州 450008；2. 河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 經(jīng)濟(jì)作物研究所，河南 鄭州 450002；3. 河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 芝麻研究中心，河南 鄭州 450002；4. 河南中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，河南 鄭州 450046）

地 黃（Rehmannia glutinosa）為 玄 參 科（Scrophulariaceae）地黃屬（Rehmannia）多年生草本植物，其根莖肉質(zhì)，鮮時呈黃色，因而得名[1?2]。地黃在我國主要分布在河南、河北、山東、天津、陜西、山西、四川、安徽及江浙等地[3]。作為一種傳統(tǒng)大宗中藥材，地黃具有清熱涼血、養(yǎng)陰生津的功效，《神農(nóng)本草經(jīng)》認(rèn)為地黃“味甘寒，主治折跌絕筋傷、逐血痹、填骨髓、長肌肉；作湯，除寒熱積聚，除痹”?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究也表明，地黃在提高機(jī)體免疫力、抗癌、防癌等方面具有積極作用[4?7]。我國最早地黃栽培品種記載見于1 000 余年前的《圖經(jīng)本草》，第一個近代地黃品種是崔大毛于1917年選育的四齒毛，李開壽隨后培育的金狀元在很長一段時間內(nèi)都是國內(nèi)的主栽品種[8]，同一時期較為著名的農(nóng)家品種還有小黑英、郭里錨、邢疙瘩等[9]。21 世紀(jì)60 年代，河南省溫縣農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所、中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物所等單位選育出了以85-5 系列為代表的懷地黃及北京1 號、北京3 號等現(xiàn)代地黃品種[9]，這些品種逐漸取代了早期的農(nóng)家種，在地黃生產(chǎn)中開始占據(jù)主導(dǎo)地位[9?10]。隨著無性繁殖品種占比逐漸提高，地黃品種遺傳基礎(chǔ)狹窄、親本材料來源單一、形態(tài)相似度高等問題開始凸顯。在品種選育、品種驗真和資源鑒定等工作中普遍采用的形態(tài)觀察和農(nóng)藝性狀考種鑒別，存在受環(huán)境影響大、性狀鑒定主觀性強(qiáng)、對親緣關(guān)系較近的品種鑒別效果差等問題，嚴(yán)重限制了地黃遺傳改良進(jìn)度和品種更新。同時，形態(tài)學(xué)等常規(guī)鑒別方法還使得外形相似的品種在種植、收儲等環(huán)節(jié)中難以提純、去雜，進(jìn)而導(dǎo)致藥材質(zhì)量產(chǎn)生較大波動，制約了地黃功效的發(fā)揮。因此，亟需開發(fā)一種高效的鑒定方法，實現(xiàn)對現(xiàn)有種質(zhì)快速、精準(zhǔn)區(qū)分，以便于后續(xù)引入更多優(yōu)良類型親本材料。

分子標(biāo)記具有不受時空、環(huán)境限制，多態(tài)性豐富等特點(diǎn)，被逐漸應(yīng)用于植物品種的鑒定、驗真領(lǐng)域。RAPD（Random amplified polymorphic DNA）標(biāo)記是最早應(yīng)用于地黃的分子標(biāo)記，其主要被應(yīng)用于地黃種質(zhì)的遺傳多樣性分析[11]、遺傳背景檢測[12]、種群劃分[13]、親緣關(guān)系和遺傳特點(diǎn)分析等[14]。RAPD標(biāo)記由于試驗穩(wěn)定性和重復(fù)性較差，無法檢測共顯性基因型，在結(jié)果精度方面存在不足。隨后，AFLP（Amplified fragment length polymorphism）和ISSR（Inter?simple sequence repeat）相繼被應(yīng)用于地黃品種基因型與有效成分關(guān)聯(lián)分析[15]、分子標(biāo)記擴(kuò)增體系優(yōu)化[16]、遺傳多樣性分析[17?18]等研究。但以上研究尚無法實現(xiàn)對每個供試品種的單獨(dú)區(qū)分，且新類型標(biāo)記的應(yīng)用相對滯后。

SSR（Simple sequence repeats）分子標(biāo)記具有特異性強(qiáng)、共顯性及多態(tài)性好、對DNA 濃度要求低的優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于品種鑒定、遺傳分析和指紋圖譜構(gòu)建等研究，但目前SSR 用于我國地黃品種遺傳解析的報道較匱乏。鑒于此，擬利用108 對SSR 引物對當(dāng)前我國黃淮產(chǎn)區(qū)的17 個地黃材料（主栽品種、地方品種和野生種質(zhì)資源）進(jìn)行遺傳多樣性分析和聚類分析，明確種質(zhì)間遺傳關(guān)系，并構(gòu)建其指紋圖譜，為地黃種質(zhì)鑒定、遺傳評估和品種選育提供支持。

1 材料和方法

1.1 材料

共17 個地黃種質(zhì)，其中6 個為主栽品種：金九、85-5、太空育種、北京3號、脫毒北京3號、懷中1號；6 個為地方品種：懷豐、噸王、金線釣魚、小黑英、沁懷、紅薯王；5 個為野生種質(zhì)：大田選育野生、野生1號、野生2號、金九野生、修武野生。以上地黃種質(zhì)均由河南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院董誠明教授提供，并統(tǒng)一種植于武陟縣大封鎮(zhèn)駕部村（34.995 2°N，113.261 6°E）。以上材料經(jīng)過董誠明教授連續(xù)多年的提純和鑒定，種質(zhì)名稱正確無誤，種質(zhì)純合、無雜株。每個種質(zhì)種植小區(qū)面積1 m2，小區(qū)間隔60 cm。所有種質(zhì)于2020 年5 月初以條播方法種植，行距30 cm、株距30 cm。于當(dāng)年7月采摘種質(zhì)幼嫩葉片，經(jīng)干冰處理后，置超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試劑

PCR 擴(kuò)增用的常規(guī)引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成；M13 熒光引物由美國賽默飛科技公司合成；dNTP（10 mmol/L）購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；Buffer（10×）、Taq酶（2.5 U/μL）購自天根生化科技有限公司；甲酰胺、PCR 板、封膜、LIZ500 內(nèi)標(biāo)、POP7 膠購自美國賽默飛科技公司。

1.3 儀器

PCR 儀為德國Eppendorf 公司的Mastercycler Pro S（Eppendorf AG，Hamburg，Germany）；利 用JXFSTPRP-64L 型研磨儀（上海凈信實業(yè)發(fā)展有限公司）研磨樣品；利用Avanti JXN-26 型離心機(jī)（美國貝克曼公司）進(jìn)行離心；利用微量分光光度計（美國，ThermoFisher 公司，型號ND-1000）測定DNA 濃度；利用ABI3730遺傳分析系統(tǒng)（美國賽默飛科技公司）檢測電泳產(chǎn)物。

1.4 樣品采集與DNA提取

每個種質(zhì)選取長勢和大小一致的地黃3 株，每株選取幼嫩葉片3～5片用干冰暫存，采用CTAB法[19]提取樣品總DNA，采用0.8%瓊脂糖電泳和微量分光光度計測定DNA 的純度和濃度。所有樣品稀釋至50 ng/μL，-20 ℃保存、備用。

1.5 引物的制備

根 據(jù)LIU 等[4]、JIAO 等[20]、LI 等[21]、HUANG 等[22]開發(fā)的108對SSR 引物（表1），在上游引物5′端加入TP-M13 序列（CACGACGTTGTAAAACGAC），將引物稀釋至1 μmol/L（上游）和10 μmol/L（下游）備用。TP-M13 引物分別引入FAM、PET、VIC 和NED 熒光基團(tuán)，M13熒光引物稀釋至10 μmol/L備用。

表1 108對地黃SSR引物名稱、序列及參考文獻(xiàn)Tab.1 Name，sequence and references of 108 pairs of Rehmannia glutinosa SSR primers

續(xù)表1 108對地黃SSR引物名稱、序列及參考文獻(xiàn)Tab.1（Continued） Name，sequence and references of 108 pairs of Rehmannia glutinosa SSR primers

續(xù)表1 108對地黃SSR引物名稱、序列及參考文獻(xiàn)Tab.1（Continued） Name，sequence and references of 108 pairs of Rehmannia glutinosa SSR primers

續(xù)表1 108對地黃SSR引物名稱、序列及參考文獻(xiàn)Tab.1（Continued） Name，sequence and references of 108 pairs of Rehmannia glutinosa SSR primers

續(xù)表1 108對地黃SSR引物名稱、序列及參考文獻(xiàn)Tab.1（Continued） Name，sequence and references of 108 pairs of Rehmannia glutinosa SSR primers

1.6 PCR擴(kuò)增

PCR 反應(yīng)體系：DNA 2.0 μL、Buffer（10×）1.2 μL、dNTP（10 mmol/L）0.2 μL、上游引物（1 μmol/L）1.0 μL、下 游 引 物（10 μmol/L）0.38 μL、M13 熒 光 引 物（10 μmol/L）0.28 μL、Taq酶（2.5 U/μL）0.1 μL、無菌水6.84 μL，總體積為12.0 μL。PCR 擴(kuò)增程序：95 ℃變性5 min；94 ℃變性30 s，68～58 ℃或65～55 ℃或62～52 ℃（視具體引物定退火溫度）退火60 s；72 ℃延 伸45～60 s，36 個 循 環(huán)；最 終72 ℃延 伸10 min。

1.7 PCR產(chǎn)物分析和數(shù)據(jù)處理

將0.5 μL PCR 產(chǎn)物加至10 μL 甲酰胺（含1%LIZ500 內(nèi)標(biāo)）中混勻，95 ℃變性6 min，冰浴冷卻10 min，離心（2 000 r/min、2 min），電泳檢測。利用Genemarker 軟件進(jìn)行擴(kuò)增片段電泳結(jié)果分析，每個樣品的SSR 擴(kuò)增條帶以0 和1 記錄，在相同的遷移位置上，有帶記為1，無帶記為0。種質(zhì)的遺傳相似系數(shù)（Genetic similarity，GS）根據(jù)公式GS=m/（m+n）[23]計算。式中，m表示基因型間共有帶型數(shù)目，n為基因型間差異帶型數(shù)目。SSR 引物的多態(tài)性信息量（Polymorphic information content，PIC）利 用 公 式PIC=1-∑fi2[24]計算。式中，fi為i位點(diǎn)的基因頻率。標(biāo)記索引系數(shù)（Marker index，MI）根據(jù)公式MI=等位基因數(shù)×PIC25]計算。 SSR 引物的鑒別力（Discriminatory power，DP）表示每對SSR 引物能分辨種質(zhì)的最大值[26]。利用軟件Fig Tree（V 1.4.3）進(jìn)行聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃淮產(chǎn)區(qū)地黃種質(zhì)PCR擴(kuò)增結(jié)果

在108 對SSR 引物中，有101 對能夠在17 個種質(zhì)間獲得有效擴(kuò)增，擴(kuò)增成功率達(dá)93.52%。其中，50對引物可以在種質(zhì)間擴(kuò)增出有效多態(tài)性，多態(tài)性比例為49.51%，且多態(tài)性引物擴(kuò)增的特異片段中多峰帶型占絕大多數(shù)（圖1）。在50 對多態(tài)性擴(kuò)增引物中，只有RSSR1613 和RSSR1151 在17 個種質(zhì)間擴(kuò)增代型為單峰類型，片段長度在107（RSSR1025）～365（Rg17381）bp。

圖1 多態(tài)性SSR引物在黃淮產(chǎn)區(qū)地黃種質(zhì)間特異性擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測Fig.1 Specific amplification products of Rehmannia glutinosa germplasms in Huang-Huai production area by polymorphic SSR primers

2.2 黃淮產(chǎn)區(qū)地黃種質(zhì)聚類分析

50 對多態(tài)性引物擴(kuò)增片段進(jìn)行匯總后，利用軟件TASSEL 3.0 和Fig Tree（V 1.4.3）對地黃種質(zhì)進(jìn)行聚類分析和作圖。結(jié)果（圖2）顯示，17 個地黃種質(zhì)共聚為3 個一級群，分別是亞群Ⅰ（含懷中1 號1 個地黃品種）、亞群Ⅱ（含懷豐、噸王和金線釣魚3個地黃品種）、亞群Ⅲ（含小黑英等13 個種質(zhì)）。亞群Ⅱ的3 個種質(zhì)均為地方品種。其中，噸王和金線釣魚親緣關(guān)系較近。在亞群Ⅲ的13 個種質(zhì)中，北京3 號和脫毒北京3 號聚為1 個二級分支；剩余的11 個種質(zhì)中，金九單獨(dú)為1 個三級分支，另外10 個種質(zhì)歸為1個分支。其中，小黑英、金九野生、修武野生、野生2號和大田選育野生聚為1個四級分支；野生1號、沁懷、紅薯王、太空育種和85-5歸為1個四級分支。

圖2 黃淮產(chǎn)區(qū)17個地黃種質(zhì)的聚類Fig.2 Cluster diagram of 17 Rehmannia glutinosa germplasms in Huang-Huai production area

2.3 黃淮產(chǎn)區(qū)地黃種質(zhì)遺傳相似性分析

根據(jù)50 對多態(tài)性引物在種質(zhì)間的帶型統(tǒng)計結(jié)果，計算兩兩種質(zhì)間的GS，結(jié)果見表2。兩兩種質(zhì)間GS 在0.552～0.984，平均為0.729，表明黃淮產(chǎn)區(qū)當(dāng)前種質(zhì)間遺傳背景相似度較高。具體到種質(zhì)，懷中1 號和脫毒北京3 號GS 最高，遺傳差異最大的為修武野生和沁懷。具體到種質(zhì)的GS 平均值，最低的是修武野生，GS平均為0.634；最高的是脫毒北京3 號，GS 平均為0.791（表3）。5 個野生種質(zhì)的平均GS為0.679，6個地方品種的平均GS為0.729，6個主栽品種的平均GS 為0.750，表明3 個群體間存在明顯的遺傳差異。5 個野生地黃種質(zhì)中，金九野生和修武野生GS 達(dá)到0.904，大田選育野生和野生2 號為0.960，只有野生1 號（GS 最大值為0.756）呈現(xiàn)較好的遺傳多樣性。

表2 黃淮產(chǎn)區(qū)17個地黃種質(zhì)的GSTab.2 GS of 17 Rehmannia glutinosa germplasms in Huang-Huai production area

表3 黃淮產(chǎn)區(qū)17個地黃種質(zhì)GS極值和均值Tab.3 Extreme and mean values of GS of 17 Rehmannia glutinosa germplasms in Huang-Huai production area

2.4 黃淮產(chǎn)區(qū)地黃種質(zhì)指紋圖譜和引物特征分析

通過對50 對多態(tài)性引物特異片段大小的比較和其在17個種質(zhì)間分布情況的分析發(fā)現(xiàn)，單一引物無法實現(xiàn)對全部種質(zhì)的區(qū)分，而多個引物組合可實現(xiàn)對任一種質(zhì)的鑒別。50 對多態(tài)性引物經(jīng)去冗余處理，并結(jié)合檢測穩(wěn)定性和可靠度，最終選取15 對引物用于17 個種質(zhì)的特異性區(qū)分（表4）。15 對引物擴(kuò)增片段在107～354 bp，普遍具備擴(kuò)增穩(wěn)定、重復(fù)性好、帶型判讀簡單的特點(diǎn)。在這一引物組中，每個種質(zhì)都擁有特異的擴(kuò)增片段組合，從而構(gòu)建了地黃種質(zhì)的SSR 指紋圖譜。15 對多態(tài)性引物在種質(zhì)間的帶譜均為多峰型。其中，引物RSSR1025 是擴(kuò)增長度片段數(shù)最多的引物，該引物共擴(kuò)增15條多態(tài)性條帶。

表4 黃淮產(chǎn)區(qū)17個地黃種質(zhì)的SSR指紋圖譜Tab.4 SSR fingerprints among 17 Rehmannia glutinosa germplasms in Huang-Huai production area

續(xù)表4 黃淮產(chǎn)區(qū)17個地黃種質(zhì)的SSR指紋圖譜Tab.4（Continued） SSR fingerprints among 17 Rehmannia glutinosa germplasms in Huang-Huai production area

該SSR 指紋圖譜的PIC 平均為0.748。其中，引物RSSR158 的最小，為0.574；引物RSSR1025 的最大，為0.890。引物的擴(kuò)增等位基因數(shù)最高為RSSR1025，在種質(zhì)中可檢測到15 個等位基因。在指紋圖譜的MI 中，最高的是引物RSSR1025，MI 為13.346。引物RSSR2 和RSSR158 的擴(kuò)增等位基因數(shù)僅有3個，其相應(yīng)的MI分別為1.843、1.723。15對引物DP為3～12，平均為7（表5）。

表5 黃淮產(chǎn)區(qū)地黃種質(zhì)指紋圖譜引物的多態(tài)性信息統(tǒng)計結(jié)果Tab.5 Statistical results of polymorphism information of fingerprint primers of Rehmannia glutinosa germplasms in Huang-Huai production area

3 結(jié)論與討論

系統(tǒng)選育是當(dāng)前地黃種質(zhì)選育的主要策略之一，隨著地黃種質(zhì)的增多，需要將表型和DNA 分子標(biāo)記相結(jié)合才能完成對種質(zhì)的鑒定。本研究結(jié)果顯示，全部種質(zhì)的平均GS為0.729，表明這些種質(zhì)遺傳背景較為相近。從具體種質(zhì)看，單個種質(zhì)的平均GS為0.634（修武野生）～0.791（脫毒北京3號）。5個野生地黃材料中金九野生和修武野生GS 達(dá)到0.904，大田選育野生和野生2 號為0.960，只有野生1 號（GS 最大值為0.756）呈現(xiàn)較好的遺傳多樣性。總體看，這5 個材料的平均GS 仍明顯低于育成品種，該結(jié)果為下一步地黃種質(zhì)遺傳背景的拓寬指明了方向。12 個育成品種中，脫毒北京3 號、懷中1號和北京3 號親緣關(guān)系最近，顯示了3 個品種中存在明顯的衍生關(guān)系。太空育種和85-5 的遺傳相似系數(shù)達(dá)0.980，表明了二者間存在演進(jìn)關(guān)系。12 個主栽/地方品種間的平均GS 也存在明顯的分化，地方品種小黑英和沁懷是其中遺傳差異較大的品種，擁有和5 個野生種質(zhì)接近的平均GS，表明在該地區(qū)過去的品種選育中，其利用率較低，但二者都具有較好的生產(chǎn)抗逆特性[9?10]，可以在今后的育種中加以重點(diǎn)利用。

地黃作為我國傳統(tǒng)中藥材，擁有深厚的栽培和藥用歷史積淀，但其研究基礎(chǔ)相比模式植物則明顯滯后。目前，地黃種質(zhì)的分子鑒定研究基本以RAPD、AFLP、SRAP（Sequence?related amplified polymorphism）及ISSR 標(biāo)記為主[11?18]。石海霞等[27]采用10 對SRAP 標(biāo)記對21 個地黃種質(zhì)遺傳多樣性進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，地黃種質(zhì)遺傳多樣性水平為中等偏低水平；趙楠等[28]使用ISSR 標(biāo)記分析了地黃居群間的基因流和進(jìn)化關(guān)系；LI 等[21]利用開發(fā)的7 對SSR 引物對36 份地黃品種和野生品系開展多態(tài)性分析發(fā)現(xiàn)，地黃品種和野生品系遺傳差異明顯，且野生品系間存在明顯的親緣關(guān)系。上述研究受限于標(biāo)記種類、數(shù)量及檢測技術(shù)，其分析結(jié)果局限于對品種或居群進(jìn)行遺傳多樣性評價和聚類，未實現(xiàn)對單個種質(zhì)的特異鑒別，無法構(gòu)建種質(zhì)的指紋圖譜。DNA條形碼是另一類地黃分子鑒定技術(shù)，但由于地黃屬種間遺傳差異較小，難以實現(xiàn)對地黃種質(zhì)間的鑒定[29]。

本研究利用108對SSR 引物對黃淮產(chǎn)區(qū)主栽品種、地方品種和野生種質(zhì)進(jìn)行遺傳多樣性分析，明確了種質(zhì)間遺傳相似系數(shù)和聚類關(guān)系。首次解析該地區(qū)主栽/地方品種與種植地野生種質(zhì)間的親緣關(guān)系，構(gòu)建了種質(zhì)的SSR 指紋圖譜，實現(xiàn)了對17個種質(zhì)中任意種質(zhì)的分子鑒別。在對黃淮產(chǎn)區(qū)17 個種質(zhì)進(jìn)行分子鑒定時，選用了在共顯性、重現(xiàn)性和變異性方面效果更優(yōu)的SSR 標(biāo)記。在擴(kuò)增檢測時，首次引入了靈敏度高、重現(xiàn)性好的毛細(xì)管電泳技術(shù)，實現(xiàn)了單一泳道的多標(biāo)記多重檢測及單堿基差異的穩(wěn)定重現(xiàn)，提高了地黃分子檢測的精準(zhǔn)度、重現(xiàn)性和高通量。該檢測技術(shù)靈敏性和分辨率高，因此，本研究SSR 引物多態(tài)性比例接近50%。同時，對于種質(zhì)分析所用引物，本研究基本涵蓋了目前已公開發(fā)表的SSR 引物，進(jìn)一步提高了研究結(jié)果的準(zhǔn)確性。

本研究為地黃種質(zhì)鑒定、指紋圖譜構(gòu)建等方面研究提供了參考，明確了黃淮產(chǎn)區(qū)大部分主栽品種存在遺傳背景相近的特點(diǎn)。在今后育種親本選擇時，應(yīng)更多考慮野生來源和地方品種來源的種質(zhì)材料。同時，未來應(yīng)在更多引物開發(fā)和新一代分子標(biāo)記開發(fā)方面深入發(fā)掘，以便為種質(zhì)鑒定和遺傳改良提供更精確的參考。