任偉凡，辛大偉，胡勁濤，吳風(fēng)晴，周化騰，杜偉斌，全仁夫

（1．杭州市蕭山區(qū)中醫(yī)院，浙江 杭州 311201；2．浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬杭州市中醫(yī)院，浙江 杭州 310007）

強(qiáng)直性脊柱炎（ankylosing spondylitis，AS）是一種自身免疫性疾病，患病率為 0．1% ～1．4%。AS主要累及中軸骨，臨床表現(xiàn)早期主要為后背疼痛和僵硬，晚期主要為脊柱關(guān)節(jié)強(qiáng)直。AS的發(fā)生是遺傳、環(huán)境和免疫等因素相互作用的結(jié)果，而遺傳因素起著重要作用。研究表明，人類白細(xì)胞抗原（human leucocyte antigen，HLA）-B27基因與 AS易感性強(qiáng)相關(guān)。臨床上 AS患者中約90%為 HLA-B27陽(yáng)性，但HLA-B27基因僅占AS遺傳度的23%。因此，可以推測(cè)還存在其他基因影響AS的發(fā)生。為了篩選其他AS易感基因，我們對(duì)一個(gè)HLA-B27陰性AS家系中的3名成員的基因組進(jìn)行了全外顯子組測(cè)序，并對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行了分析，現(xiàn)總結(jié)報(bào)告如下。

1 臨床資料

納入1個(gè)AS家系的15名核心成員，均為HLAB27陰性，其中AS患者2例，其余均正常。先證者，女，58歲，符合美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)會(huì)1984年修訂的紐約標(biāo)準(zhǔn)；先證者女兒，35歲，符合1991年歐洲脊柱關(guān)節(jié)病研究組提出的脊柱關(guān)節(jié)病的診斷標(biāo)準(zhǔn)。試驗(yàn)方案經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審查通過(guò)。

2 方 法

2．1 全外顯子組測(cè)序及測(cè)序數(shù)據(jù)分析

采集AS家系15名核心成員的外周血，提取外周血基因組。將先證者、先證者女兒、先證者兒子的外周血基因組進(jìn)行全外顯子組測(cè)序（廣州基迪奧生物科技有限公司）。將原始測(cè)序數(shù)據(jù)通過(guò)過(guò)濾和質(zhì)量控制后獲得有效數(shù)據(jù)，統(tǒng)計(jì)捕獲目標(biāo)區(qū)域長(zhǎng)度、有效測(cè)序片段數(shù)量、有效數(shù)據(jù)大小、目標(biāo)區(qū)域有效數(shù)據(jù)大小；采用BWA工具將外顯子序列比對(duì)到人類參考基因組，獲得比對(duì)結(jié)果，計(jì)算比對(duì)率（測(cè)序片段比對(duì)到的參考基因組在參考基因組中所占的比例）及捕獲效率（比對(duì)到目標(biāo)區(qū)域的序列在比對(duì)到參考基因組的序列中所占的比例）。采用SAMtool軟件將比對(duì)結(jié)果輸出為BAM格式文件，采用Picard軟件標(biāo)記重復(fù)測(cè)序片段，統(tǒng)計(jì)測(cè)序深度及測(cè)序片段覆蓋度。

2．2 AS易感基因篩選

采用GATK軟件挖掘單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）突變信息，采用ANNOVAR軟件注釋分析SNP突變，參照以下步驟篩選AS易感基因：①剔除外顯子和剪接區(qū)以外的突變；②剔除外顯子和剪接區(qū)內(nèi)的同義突變；③剔除千人基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中突變頻率≥0．01的突變；④剔除外顯子組整合數(shù)據(jù)庫(kù)中突變頻率≥0．01的突變；⑤采用 SIFT、Polyphen、MutationTaster、MutationAssessor、M-CAP、FATHMM、CADD等軟件進(jìn)行蛋白損傷預(yù)測(cè)，選擇至少有4個(gè)軟件的預(yù)測(cè)結(jié)果顯示為有害的突變；⑥保留患者共有而正常人不具有的變異；⑦確定AS易感基因名稱、位置及突變類型。

2．3 AS易感基因驗(yàn)證

根據(jù)篩選出的易感基因設(shè)計(jì)引物，分別以15名AS家系核心成員的基因組為模板，擴(kuò)增目的基因。采用瓊脂糖凝膠電泳分離目的基因，并對(duì)目的基因進(jìn)行Sanger測(cè)序（華大基因科技有限公司），確定存在該移碼突變的成員。

3 結(jié) 果

3．1 全外顯子組測(cè)序數(shù)據(jù)分析結(jié)果

全外顯子組測(cè)序獲得了較高質(zhì)量的測(cè)序數(shù)據(jù)，具體數(shù)據(jù)分析結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 全外顯子組測(cè)序數(shù)據(jù)分析結(jié)果

3．2 AS易感基因篩選結(jié)果

RELA基因10號(hào)外顯子上存在一個(gè)雜合移碼突變c．1039delG（圖1），突變的RELA基因可能為AS易感基因。

圖1 移碼突變c．1039delG測(cè)序峰圖

3．3 AS易感基因驗(yàn)證結(jié)果

根據(jù)RELA基因設(shè)計(jì)引物：正向引物，5’-AACTAAGTCCTGAGAGGCAAT-3’；反向引物，5’-TGAGAACTGACCTAGCCCTT-3’。Sanger測(cè)序結(jié)果顯示，先證者、先證者女兒及先證者孫子的基因組上存在RELA基因移碼突變，其他家系成員不存在該突變。

4 討 論

AS具有一定的家族遺傳性，以15～35歲為發(fā)病高峰。目前，AS的發(fā)病機(jī)制尚未完全明確。多項(xiàng)研究顯示，HLA-B27基因與 AS的發(fā)生強(qiáng)相關(guān)。Qian等的研究結(jié)果表明，在 AS患者中，HLAB27陽(yáng)性患者的發(fā)病時(shí)間早、臨床癥狀重。然而，HLA-B27基因僅占AS遺傳度的23%。因此，應(yīng)該還存在其他AS易感基因。本研究的家系成員均為HLA-B27陰性，其中有2例AS患者；這2例患者的發(fā)病時(shí)間均在30歲以后，且腰部疼痛不劇烈、晨僵癥狀時(shí)而好轉(zhuǎn)。通過(guò)外顯子組測(cè)序及數(shù)據(jù)分析，結(jié)果顯示該家系中可能存在其他的AS易感基因。

核因子（nuclear factor-κB，NF-κB）是細(xì)胞中重要的轉(zhuǎn)錄因子，與炎癥反應(yīng)、細(xì)胞分化、細(xì)胞生長(zhǎng)、細(xì)胞凋亡等過(guò)程密切相關(guān)。NF-κB蛋白以與NF-κB抑制蛋白（inhibitor of NF-κB，IκB）結(jié)合的狀態(tài)存在于細(xì)胞質(zhì)中，外界刺激促使IκB磷酸化、泛素化，進(jìn)而被蛋白酶體降解，隨后NF-κB蛋白進(jìn)入細(xì)胞核并與靶基因結(jié)合，調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄。NF-κB家族包括RelA（p65）、RelB、NF-κB1（p50）、NF-κB2（p52）和c-Rel 5位成員。除了RelB，其他成員均能形成同源或異源二聚體，其中p50／p65異源二聚體最為常見(jiàn)，幾乎存在于所有有核細(xì)胞中。NF-κB家族成員均含有Rel同源結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域含有300個(gè)氨基酸，具有特異性DNA序列結(jié)合、二聚化和抑制蛋白結(jié)合3個(gè)功能。p65包含Rel同源結(jié)構(gòu)域、連接區(qū)及拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)域，其中拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)域主要負(fù)責(zé)p65的轉(zhuǎn)錄活性調(diào)節(jié)。

AS的主要病理表現(xiàn)為炎癥介導(dǎo)的骨破壞和病理性骨形成。NF-κB信號(hào)通路是典型的炎癥信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。炎癥性腸病、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、牛皮癬、哮喘、全身炎癥反應(yīng)綜合征等多種疾病與NF-κB信號(hào)通路密切相關(guān)。在多種炎癥性疾病中，NF-κB能夠被激活并持續(xù)表達(dá)，而NF-κB的表達(dá)可進(jìn)一步誘導(dǎo)促炎性細(xì)胞因子、趨化因子、黏附因子、基質(zhì)金屬蛋白酶等多種蛋白的表達(dá)。Mulero等研究發(fā)現(xiàn)，多種炎癥性疾病患者體內(nèi)NF-κB活性增加，同時(shí)炎癥細(xì)胞募集增加，白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-8、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）等促炎性細(xì)胞因子表達(dá)量增加。韓飛等采用實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者、骨關(guān)節(jié)炎患者和健康成人的滑膜組織中NF-κB的mRNA表達(dá)，結(jié)果顯示類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者的NF-κB mRNA表達(dá)量顯著高于骨關(guān)節(jié)炎患者和健康成人；采用原位免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)p65在細(xì)胞核中的表達(dá)，結(jié)果顯示類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者p65的活性系數(shù)（細(xì)胞核p65陽(yáng)性百分比／細(xì)胞質(zhì)p65陽(yáng)性百分比）顯著高于骨關(guān)節(jié)炎患者和健康成人。方利等采用酶聯(lián)免疫吸附分析法檢測(cè)了30例AS患者（試驗(yàn)組）和30位健康志愿者（對(duì)照組）外周血血清中NF-κB信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)量，結(jié)果顯示試驗(yàn)組患者外周血血清中TNF-α、IL-1β、IL-17、NF-κB激活劑 1、p65、p50、IκBα、IκB激酶 β、顆粒膜蛋白140、血小板活化因子、血栓素A2的含量均顯著高于對(duì)照組，提示AS患者體內(nèi)NF-κB信號(hào)通路處于激活狀態(tài)。除了參與炎癥反應(yīng)，NF-κB對(duì)成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞代謝具有一定的調(diào)節(jié)作用。在關(guān)節(jié)炎和骨質(zhì)疏松癥的相關(guān)研究中，激活的NF-κB能夠抑制成骨細(xì)胞骨形成，促進(jìn)破骨細(xì)胞骨吸收，并能夠影響軟骨細(xì)胞的增殖與分化，抑制NF-κB表達(dá)能夠發(fā)揮抗炎和抗骨質(zhì)溶解的作用。

既往研究AS易感基因多以全基因組關(guān)聯(lián)分析為主，目前已發(fā)現(xiàn)50多種基因與AS相關(guān)。但是針對(duì)1個(gè)家系的研究，由于患病人數(shù)和突變基因攜帶者較少，不宜采用連鎖分析或關(guān)聯(lián)分析的方式。而采用Sanger測(cè)序法逐個(gè)驗(yàn)證候選基因，成本較高、周期較長(zhǎng)。隨著高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，將全基因組測(cè)序和全外顯子組測(cè)序用于單個(gè)家系和散發(fā)病例的致病基因研究，具有一定的優(yōu)勢(shì)。Liu等采用全外顯子組測(cè)序聯(lián)合基因篩查在1個(gè)家族性房間隔缺損家系中發(fā)現(xiàn)新的致病突變TBX20。外顯子僅占整個(gè)基因組的1%，但約85%的致病突變都位于外顯子上。相較于全基因組測(cè)序，外顯子組測(cè)序的費(fèi)用低、耗時(shí)少、效率高。此外，全外顯子組測(cè)序能夠較為準(zhǔn)確的確定候選基因，便于后續(xù)的基因篩選和功能鑒定。

移碼突變是指基因編碼區(qū)內(nèi)缺失或增加的核苷酸數(shù)目不是3的倍數(shù)從而造成閱讀框移動(dòng)的突變。由于閱讀框移動(dòng)，導(dǎo)致突變位點(diǎn)后的氨基酸組成種類和順序都發(fā)生了改變，進(jìn)而影響蛋白的結(jié)構(gòu)和功能。本研究結(jié)果顯示，RELA基因10號(hào)外顯子上存在一個(gè)雜合移碼突變c．1039delG。RELA基因位于11號(hào)染色體，有10個(gè)外顯子，編碼p65蛋白。RELA基因發(fā)生該移碼突變會(huì)導(dǎo)致p65蛋白拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)域發(fā)生變化，從而影響p65的轉(zhuǎn)錄活性，影響NF-κB信號(hào)通路的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。AS易感基因的驗(yàn)證結(jié)果顯示，先證者、先證者女兒及先證者孫子的基因組上均存在該突變。RELA基因突變可能是導(dǎo)致該家系A(chǔ)S發(fā)生的重要遺傳因素。先證者孫子尚未出現(xiàn)AS臨床癥狀，可能與其未到發(fā)病年齡有關(guān)。但需提醒其注意自身身體狀況，如出現(xiàn)AS臨床癥狀，應(yīng)盡早干預(yù)以避免病情惡化。本研究結(jié)果表明，突變的RELA基因可能是該AS家系的AS易感基因。