張生琰，王玢，邵志偉，陳卓濤，楊林鵬，謝憶，李薇，雷清，楊俊杰

蘭州生物制品研究所有限責(zé)任公司中試研究室甘肅省疫苗工程技術(shù)研究中心，甘肅 蘭州 730046

近年來，隨著生物工程技術(shù)的發(fā)展，通過重組DNA技術(shù)構(gòu)建重組工程菌以用于生物制品的研發(fā)和生產(chǎn)得到人們的廣泛關(guān)注。部分重組工程菌所生成的目的蛋白在培養(yǎng)過程中不分泌至發(fā)酵液中，而是聚集在細(xì)胞內(nèi)，此時提取目的蛋白的第一步就是要破碎細(xì)胞以釋放目的蛋白［1］。目前，常用的細(xì)胞破碎方法分為機械法和非機械法兩種，機械法包括高壓勻漿法、超聲破碎法、壓榨法、球磨法等，非機械法包括酶溶法、干燥冷凍法等，每種破碎法都有其優(yōu)缺點，其中高壓勻漿法具有操作簡單、成本低、處理量大、后續(xù)分離簡單、易于工藝放大等優(yōu)勢，尤其適用于工業(yè)化生產(chǎn)中［2-3］。

高壓勻漿破碎細(xì)胞的過程受均質(zhì)壓力、均質(zhì)次數(shù)、均質(zhì)酵母質(zhì)量分?jǐn)?shù)、均質(zhì)時間、均質(zhì)溫度等因素的影響，而均質(zhì)時間受均質(zhì)機性能所限且與均質(zhì)次數(shù)相關(guān)［4］。市售高壓均質(zhì)機在高壓均質(zhì)的過程中大多均能夠?qū)⒕|(zhì)料液的溫度控制在10℃以下，因此均質(zhì)壓力、均質(zhì)次數(shù)、均質(zhì)酵母質(zhì)量分?jǐn)?shù)3個因素是影響高壓均質(zhì)的關(guān)鍵工藝參數(shù)［5］。從質(zhì)量源于設(shè)計（Quality by Design，QbD）理念的角度優(yōu)化重組漢遜酵母細(xì)胞高壓勻漿破碎工藝的研究尚未見報道，基于此，本文選用高壓勻漿法破碎重組漢遜酵母細(xì)胞，響應(yīng)面法優(yōu)化均質(zhì)壓力、均質(zhì)次數(shù)、均質(zhì)酵母質(zhì)量分?jǐn)?shù)3個關(guān)鍵工藝參數(shù)，探討其對重組漢遜酵母細(xì)胞高壓勻漿破碎工藝的影響，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 發(fā)酵液 重組漢遜酵母細(xì)胞發(fā)酵液由蘭州生物制品研究所有限責(zé)任公司中試研究室制備，批號分別為20190605、20190802和20190907，－20℃保存。

1.2 主要試劑及儀器 十二水合磷酸氫二鈉、二水合磷酸二氫鈉、氯化鈉、乙二胺四乙酸二鈉、異丙醇（均為分析純）購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司；苯甲基磺酰氟（分析純）購自美國默克制藥公司；AH100B型ATS高壓均質(zhì)機購自安拓思納米技術(shù)（蘇州）有限公司。

1.3 重組漢遜酵母細(xì)胞的破碎 取3 L重組漢遜酵母細(xì)胞濃縮發(fā)酵液，室溫融化后，加入PBS緩沖液稀釋發(fā)酵液至均質(zhì)酵母質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為8%、10%和12%，分別加入乙二胺四乙酸二鈉緩沖液（1%，V／V）和苯甲基磺酰氟溶液（1%，V／V），攪拌10 min，采用高壓均質(zhì)機對上述發(fā)酵液在一定的均質(zhì)壓力下循環(huán)破碎處理。

1.4 酵母細(xì)胞破碎率測定方法 取1 mL破碎前后細(xì)胞懸液，稀釋10 000倍后，取1滴加至血細(xì)胞計數(shù)板上，光學(xué)顯微鏡下計數(shù)完整細(xì)胞，每個樣品計數(shù)3次后取均值，按下式計算酵母細(xì)胞破碎率［6］。

細(xì)胞破碎率（%）＝（破碎前完整細(xì)胞數(shù)－破碎后完整細(xì)胞數(shù)）／破碎前完整細(xì)胞數(shù)×100%

1.5 Box-Behnken設(shè)計 應(yīng)用Design-Expert軟件，根據(jù)Box-Behnken中心組合試驗設(shè)計方案，以均質(zhì)壓力（A）、均質(zhì)次數(shù)（B）、均質(zhì)酵母質(zhì)量分?jǐn)?shù)（C）為影響因素，酵母細(xì)胞破碎率（Y）為響應(yīng)值，進行3因素3水平響應(yīng)面試驗，分別進行17組試驗，其中包括5個中心點重復(fù)，見表1。用響應(yīng)曲面法建立二階數(shù)學(xué)模型，考察各因素對酵母細(xì)胞破碎率的影響。通過Design-Expert軟件基于二次多項式回歸模型建立設(shè)計空間，設(shè)定關(guān)鍵工藝評價指標(biāo)細(xì)胞破碎率為50%～100%。

表1 Box-Behnken中心組合試驗設(shè)計因素水平Tab.1 Factors and levels in Box-Behnken center-united experiment design

1.6 規(guī)?；に囼炞C 考慮到規(guī)?；a(chǎn)中發(fā)酵料液的量較大，為減少破碎料液，縮短破碎時間，保持破碎工藝在4～8℃范圍內(nèi)進行，在規(guī)?；a(chǎn)中最終選擇均質(zhì)酵母質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%。規(guī)模化生產(chǎn)中其他參數(shù)設(shè)置參考所得的參數(shù)操作空間范圍，均質(zhì)壓力選擇1 200 bar，均質(zhì)次數(shù)選擇3次。取3批重組漢遜酵母細(xì)胞發(fā)酵液，每批12 L，處理發(fā)酵液使均質(zhì)酵母質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%，用AH100B型ATS高壓均質(zhì)機在1 200 bar的壓力下均質(zhì)3次，破碎前后取樣10 mL，檢測細(xì)胞數(shù)并計算酵母細(xì)胞破碎率。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用Design-Expert 10.0軟件對試驗數(shù)據(jù)進行方差分析和回歸分析，方差分析和回歸方程的顯著性檢驗采用F檢驗，以P＜0.05判定為差異顯著。多元回歸模型擬合度采用R2表示，R2＞0.9判定為優(yōu)；擬合度失擬（Lack of Fit）以P＞0.05判定為失擬不顯著，說明回歸模型與數(shù)據(jù)擬合較好。

2 結(jié)果

2.1 響應(yīng)面試驗 響應(yīng)面試驗設(shè)計結(jié)果見表2，所得數(shù)據(jù)通過Design-Expert軟件進行回歸分析，經(jīng)回歸擬合得回歸方程為：Y（細(xì)胞破碎率）=41.51+11.15 A+7.64 B+7.62 C－0.97 AB－1.64 AC+6.04 BC+8.55 A2+1.67 B2+3.50 C2，擬合相關(guān)系數(shù)R2為0.963 2，提示Y的真實值與預(yù)測值之間有較好的擬合度，可用此模型來預(yù)測Y的真實情況。

表2 Box-Behnken中心組合試驗設(shè)計及其結(jié)果Tab.2 Design and results of Box-Behnken center-united experiment

用Box-Behnken設(shè)計構(gòu)建數(shù)學(xué)模型，方差分析及顯著性檢驗結(jié)果見表3，回歸擬合模型明顯顯著（P＜0.01），失擬項不顯著（P＞0.05），模型的擬合相關(guān)系數(shù)R2為0.963 2，提示所建立的數(shù)學(xué)模型擬合程度較好，可用此模型來對重組漢遜酵母細(xì)胞的高壓均質(zhì)破碎工藝進行分析和預(yù)測。響應(yīng)值Y（細(xì)胞破碎率）與A、B、C、A2差異明顯顯著（P＜0.01），與BC差異顯著（P＜0.05），與AB、AC、B2、C2差異不顯著（P＞0.05），提示各實驗因素對細(xì)胞破碎率的影響非簡單的線性關(guān)系。

表3 回歸模型方差分析及顯著性檢驗Tab.3 Variance analysis of regression model and significance test

通過Design-Expert軟件對回歸擬合模型進行響應(yīng)面分析，可得到各響應(yīng)面的立體分析圖，見圖1～3。對回歸方程求解，獲得模型極值點，均質(zhì)壓力為1 200 bar，均質(zhì)次數(shù)為4次，均質(zhì)酵母質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12%，預(yù)測破碎率為85.05%。

圖1 均質(zhì)壓力和均質(zhì)次數(shù)交互影響的三維曲面圖（A）和等高線圖（B）Fig.1 Three-dimensional surface（A）and contour（B）plots of mutual-influence of homogeneous pressure and homogeneous times

2.2 構(gòu)建設(shè)計空間 得到操作空間范圍為：均質(zhì)壓力1 125～1 200 bar，均質(zhì)次數(shù)3～4次，均質(zhì)酵母質(zhì)量分?jǐn)?shù)12%。見圖4。

圖4 設(shè)計空間二維圖Fig.4 2D plot of design space

2.3 規(guī)?；に囼炞C結(jié)果3批重組漢遜酵母細(xì)胞發(fā)酵液檢測結(jié)果顯示，細(xì)胞破碎率均達到65%以上，該值在響應(yīng)值設(shè)計空間范圍內(nèi)，驗證了構(gòu)建的參數(shù)參考空間，見表4。

表4 破碎試驗的細(xì)胞總破碎率比較Tab.4 Total cell disruption rate in disruption test

圖2 均質(zhì)壓力和均質(zhì)酵母質(zhì)量分?jǐn)?shù)交互影響的三維曲面圖（A）和等高線圖（B）Fig.2 Three-dimensional surface（A）and contour（B）plots of mutual-influence of homogeneous pressure and homogeneous yeast mass fraction

圖3 均質(zhì)次數(shù)和均質(zhì)酵母質(zhì)量分?jǐn)?shù)交互影響的三維曲面圖（A）和等高線圖（B）Fig.3 Three-dimensional surface（A）and contour（B）plots of mutual-influence of homogeneous times and homogeneous yeast mass fraction

3 討論

要獲得重組漢遜酵母細(xì)胞表達的胞內(nèi)目的蛋白就需要進行細(xì)胞破碎，而細(xì)胞破碎結(jié)果會影響破碎后目的蛋白的產(chǎn)量、目的蛋白的活性、細(xì)胞碎片的去除、小分子雜質(zhì)的去除等，因此選擇合適的細(xì)胞破碎方法并制定高效的細(xì)胞破碎工藝在工業(yè)生產(chǎn)中顯得至關(guān)重要［7-8］。高壓均質(zhì)破碎法屬于物理破碎方式，是將細(xì)胞在高壓腔體內(nèi)進行撞擊、剪切，使得細(xì)胞受到對流撞擊、高速剪切、高頻振蕩、空穴現(xiàn)象等物理作用和熱效應(yīng)，從而破壞細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，達到破碎細(xì)胞的目的，具有破碎時間短、能夠連續(xù)運行、不產(chǎn)生二次污染、處理量大的優(yōu)點，適用于工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)，然而其細(xì)胞破碎率較低，限制了其廣泛的應(yīng)用［9］。

細(xì)胞高壓均質(zhì)破碎的生產(chǎn)工藝受到許多工藝參數(shù)的影響，其中均質(zhì)壓力、均質(zhì)次數(shù)、均質(zhì)酵母質(zhì)量分?jǐn)?shù)、均質(zhì)料液溫度、均質(zhì)時間等均為關(guān)鍵工藝參數(shù)，這些參數(shù)相互影響，共同影響細(xì)胞的破碎效果，為獲得最佳的破碎工藝條件以提高生產(chǎn)效率、降低生產(chǎn)成本，有必要對這些關(guān)鍵工藝參數(shù)進行優(yōu)化［10］。根據(jù)以往的工作經(jīng)驗和實際操作情況及文獻報道［11-12］，在重組漢遜酵母細(xì)胞高壓均質(zhì)破碎的工藝優(yōu)化中，選取均質(zhì)壓力、均質(zhì)次數(shù)及均質(zhì)酵母質(zhì)量分?jǐn)?shù)3個關(guān)鍵工藝參數(shù)作為優(yōu)化的參數(shù)。本試驗采用響應(yīng)面優(yōu)化法，以多元高次回歸函數(shù)模型為預(yù)測工具，對各參數(shù)與細(xì)胞破碎率的關(guān)系進行曲線擬合，分析擬合函數(shù)的響應(yīng)面和等高線圖，獲得了各參數(shù)與響應(yīng)面之間的相關(guān)性關(guān)系，最終得到重組漢遜酵母細(xì)胞高壓均質(zhì)破碎工藝的最佳參數(shù)設(shè)置為均質(zhì)壓力1 200 bar，均質(zhì)次數(shù)4次，均質(zhì)酵母質(zhì)量分?jǐn)?shù)12%，在此條件下，酵母細(xì)胞的破碎率能夠達到85.05%。

本研究中，通過設(shè)計空間的構(gòu)建，獲得本工藝的操作空間為均質(zhì)壓力1 125～1 200 bar，均質(zhì)次數(shù)3～4次，均質(zhì)酵母質(zhì)量分?jǐn)?shù)12%。高壓均質(zhì)機在均質(zhì)的過程中會破壞酵母細(xì)胞壁和整個細(xì)胞的結(jié)構(gòu)。從提高細(xì)胞破碎率的角度看，提高均質(zhì)壓力有利于破碎效果的提高，然而均質(zhì)壓力越高，均質(zhì)機的磨損越大，會影響設(shè)備的使用壽命，另外動力消耗也會增大［13］。因此，為延長均質(zhì)機使用壽命、降低能耗，結(jié)合ATS均質(zhì)機本身特性，本工藝最終確定實際的均質(zhì)壓力參數(shù)為1 200 bar。在一定壓力下，一次的均質(zhì)只能使部分酵母細(xì)胞破碎，要獲得高破碎效果就需重復(fù)多次破碎，而均質(zhì)次數(shù)也并不是越多越好，在實際工藝操作中，均質(zhì)次數(shù)多會導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)其他內(nèi)含物大量釋放，為后續(xù)處理工藝增加困難，還有可能影響目的蛋白的結(jié)構(gòu)及其收率［14］?；诖?，本工藝最終確定實際的均質(zhì)次數(shù)為3次。酵母細(xì)胞發(fā)酵液為非牛頓型流體，發(fā)酵液濃度越大，流體的表觀黏度越大，而高壓均質(zhì)破碎細(xì)胞的作用原理之一是流體對細(xì)胞的剪切力，剪切力的大小受到黏度的影響，因此，提高細(xì)胞發(fā)酵液的濃度會導(dǎo)致高壓均質(zhì)破碎效果的降低［15］，這也在本文得到驗證。本研究得到的最佳均質(zhì)酵母質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12%。雖然低濃度細(xì)胞發(fā)酵液能夠獲得較高的酵母細(xì)胞破碎率，但提高均質(zhì)酵母質(zhì)量分?jǐn)?shù)就會增加酵母細(xì)胞均質(zhì)料液的用量，在實際的規(guī)?；I(yè)生產(chǎn)中，這個增加的用量可能會達到上百升，會增加均質(zhì)破碎的工作量，導(dǎo)致破碎操作時間延長，增加成本，另外提高均質(zhì)酵母質(zhì)量分?jǐn)?shù)還會導(dǎo)致目的蛋白濃度降低，使得后續(xù)分離純化過程工作量加大。綜合利弊，本工藝最終確定實際的均質(zhì)酵母質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%。

本研究取3批料液對最終確定的工藝參數(shù)進行了規(guī)?；炞C，結(jié)果顯示，各批次細(xì)胞破碎率均在65%以上，在試驗設(shè)計范圍內(nèi)，說明試驗結(jié)果有較好的穩(wěn)健性和適應(yīng)性。規(guī)?；に囼炞C中操作參數(shù)的選擇考慮了實際的工藝需求，操作參數(shù)為均質(zhì)壓力1 200 bar、均質(zhì)次數(shù)3次、均質(zhì)酵母質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%，獲得的細(xì)胞破碎率在65%以上，這遠(yuǎn)遠(yuǎn)未達到預(yù)測破碎率85.05%，是由于預(yù)測破碎率是在模型極點值（均質(zhì)壓力1 200 bar，均質(zhì)次數(shù)4次，均質(zhì)酵母質(zhì)量分?jǐn)?shù)12%）的理想數(shù)據(jù)，實際規(guī)?；に嚳紤]到實際工藝需求，并未應(yīng)用理想的操作參數(shù)，導(dǎo)致實際細(xì)胞破碎率未達到預(yù)測破碎率。在未進行工藝優(yōu)化前，本課題組在這步工藝的細(xì)胞破碎率約為50%，經(jīng)響應(yīng)面優(yōu)化后細(xì)胞破碎率達到65%以上，這對于整個工藝最終產(chǎn)品回收率的提高有重要的意義。另外本研究中獲得了參數(shù)的操作空間，這也有助于工業(yè)化大規(guī)模細(xì)胞破碎中工藝的穩(wěn)健。

對于細(xì)胞破碎工藝的研究，細(xì)胞破碎率、目的蛋白活性回收率及破碎過程中雜質(zhì)量的增多均是需要考察的重要指標(biāo)。本研究中的重組漢遜酵母細(xì)胞破碎是用于細(xì)胞內(nèi)病毒樣顆粒的釋放，而本課題組病毒樣顆粒在破碎液中的活性檢測方法尚未建立，因此無法獲得目的蛋白活性回收率這一重要指標(biāo)，在之前的研究中，考慮用總蛋白釋出度來替代目的蛋白活性回收率，大量的試驗數(shù)據(jù)顯示，總蛋白釋出度與細(xì)胞破碎率具有較好的一致性，因此僅選擇細(xì)胞破碎率作為響應(yīng)值。另外，破碎過程中宿主細(xì)胞、宿主蛋白、宿主DNA等雜質(zhì)在后續(xù)聚乙二醇沉淀這一步會得到充分去除，因此也未將這一指標(biāo)作為響應(yīng)值。

綜上所述，本研究基于QbD的理念，采用響應(yīng)面法對重組漢遜酵母細(xì)胞高壓均質(zhì)破碎工藝進行優(yōu)化，建立了穩(wěn)定的高壓均質(zhì)破碎工藝，在試驗結(jié)果和規(guī)?；I(yè)生產(chǎn)之間取得了平衡，能夠用于后續(xù)破碎工藝的開發(fā)放大。