孔艷娥

（曲靖醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，云南曲靖 655011）

祛斑養(yǎng)顏膠囊為曲靖市第一人民醫(yī)院的院內(nèi)制劑，具有疏肝理氣、散郁調(diào)經(jīng)、活血、化瘀、祛斑的功效，臨床用于治療面部黃褐斑、色素沉著，經(jīng)過20多年臨床實(shí)踐，療效確切。其組方為柴胡（醋炙）、白術(shù)（麩炒）、生姜、丹參、桃仁、青蒿、川芎、當(dāng)歸（蒸）、白芍（酒炙）、梔子（炒）、香附、牡丹皮、薄荷、藏紅花。丹參具有活血祛瘀、通經(jīng)止痛、清心止煩、涼血消癰的功效，其一類主要有效成分是以沒食子酸、丹參素鈉和丹酚酸B為代表的水溶性成分〔1〕。川芎具有活血行氣、祛風(fēng)止痛的功效，其主要有效成分是以阿魏酸為代表的有機(jī)酸類成分〔2〕。當(dāng)歸具有補(bǔ)血活血、調(diào)經(jīng)止痛、潤腸通便的功效，其主要有效成分是以阿魏酸為代表的水溶性有機(jī)酸類成分〔3〕。梔子具有瀉火止煩、清熱利濕、涼血解毒的功效，其主要化學(xué)成分是以梔子苷為代表的環(huán)烯醚萜類成分〔4〕。白芍具有養(yǎng)血調(diào)經(jīng)、斂陰止汗、柔肝止痛、平抑肝陽的功效，其主要化學(xué)成分是以芍藥內(nèi)酯苷和芍藥苷為代表的單萜類成分〔5〕。在現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中，僅對川芎和當(dāng)歸進(jìn)行定性鑒別，沒有定量相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，中藥復(fù)方制劑的藥效大多是多成分協(xié)同作用的結(jié)果，為更好地提升其質(zhì)量的可控性，確保臨床療效，本文建立了HPLC法同時測定祛斑養(yǎng)顏膠囊中沒食子酸、丹參素鈉、梔子苷、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、丹酚酸B、阿魏酸7種成分含量的方法，為其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提升提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器 島津LC-20AT型高效液相色譜儀（配LC-20AT輸液泵、SIL-20A自動進(jìn)樣器、CBM-20A控制器、SPD-20A紫外檢測器、CTO-10AS vp柱溫箱、DGU-20A5脫 氣 機(jī)、LCsolution色 譜 工 作 站，Shimadzu公司）；MS205DU型電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）；島津UV-2401PC型紫外可見分光光度計(jì)（Shimadzu公司）；AS10200BDT超聲波清洗機(jī)（天津奧特賽恩斯儀器有限公司）；電熱恒溫水浴鍋（北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司）。

1.2 試劑與藥物 沒食子酸對照品（批號：110831-201605，含量：90.8%）、丹參素鈉對照品（批號：110855-201613，含量：98.8%）、梔子苷對照品（批號：110749-201115，含量：99.7%）、芍藥內(nèi)酯苷對照品（批號：19121705，含量：99.28%）、芍藥苷對照品（批號：110736-201640，含量：95.2%）、阿魏酸對照品（批號：110773-201614，含量：99.0%）、丹酚酸B對照品（批號：111562-201615，含量：96.2%），除芍藥內(nèi)酯苷對照品購自成都普菲德生物科技有限公司外，其余對照品均購自中國食品藥品檢定研究院；乙腈（Merck KGaA公司，色譜純）；蒸餾水；其余試劑均為分析純；祛斑養(yǎng)顏膠囊（批號：20160513、20160826、20161129、20170104，規(guī)格：0.4 g/粒）由曲靖市第一人民醫(yī)院制劑室提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：依利特C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；柱溫：25℃；流動相：0.1%磷酸溶液（A）-乙腈（B）；梯度洗脫（0～35 min，4%→18% B；35～55 min，18%→33% B；55～65 min，4% B）；流速：1.0mL/min；檢測波長：232 nm；進(jìn)樣量：10 μL。

2.2 溶液制備

2.2.1 對照品溶液 分別精密稱取沒食子酸、丹參素鈉、梔子苷、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、阿魏酸、丹酚酸B對照品適量，加70%甲醇制成每1 mL分別含上述對照品0.159 9、0.189 9、0.831 9、0.338 6、0.970 3、0.080 6、0.529 1 mg的混合對照品儲備液。精密量取上述對照品儲備液1.00 mL，置于10 mL容量瓶中，加70%甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，即得對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 取祛斑養(yǎng)顏膠囊20粒，取其內(nèi)容物，研細(xì)，混勻，稱取約1.0 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，加入70%甲醇50 mL，稱定重量，置水浴回流40 min，放冷，用70%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，靜置，取上清液濾過，即得供試品溶液。

2.2.3 陰性供試品溶液 按處方及工藝，分別制得不含丹參、梔子（炒）、白芍（酒炙）、川芎和當(dāng)歸（蒸）的陰性供試品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制成陰性供試品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.2.1”項(xiàng)下的對照品儲備液0.20、0.50、1.00、2.00、3.00、5.00 mL，分別置于10 mL容量瓶中，加70%甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，即得。分別進(jìn)樣10 μL，記錄峰面積。以對照品質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)，峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程，結(jié)果見表1。沒食子酸、丹參素鈉、梔子苷、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、阿魏酸、丹酚酸B在各自的線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表1 7種成分的線性關(guān)系

2.3.2 專屬性試驗(yàn) 分別吸取“2.2”項(xiàng)下的3種溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測定。結(jié)果，陰性供試品在與對照品和供試品色譜峰保留時間相應(yīng)位置上，沒有相應(yīng)的色譜峰，表明陰性供試品不干擾測定，色譜圖見圖1。

圖1 高效液相色譜圖

2.3.3 精密度試驗(yàn) 精密吸取“2.2.2”項(xiàng)下的供試品（批號：20160513）溶液10 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積。結(jié)果，沒食子酸、丹參素鈉、梔子苷、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、阿魏酸、丹酚酸B的RSD分別為0.62%、0.49%、0.51%、0.67%、0.71%、0.52%、0.48%。表明儀器精密度良好。

2.3.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批供試品（批號：20160513）6份，按“2.2.2”項(xiàng)下制備，測得沒食子酸、丹參素鈉、梔子苷、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、阿魏酸、丹酚酸B的含量均值分別為0.435 5、0.843 5、2.977 0、1.428 2、4.080 8、0.326 0、2.660 0 mg/g，其含量的RSD分別為0.78%、0.60%、0.83%、0.74%、0.65%、0.92%、0.57%，表明試驗(yàn)重復(fù)性良好。

2.3.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批供試品（批號：20160513）溶液，按“2.2.2”項(xiàng)下制備，分別在0、4、8、16、24、36 h時進(jìn)樣10 μL，記錄峰面積。結(jié)果，沒食子酸、丹參素鈉、梔子苷、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、阿魏酸、丹酚酸B峰面積的RSD分別為0.69%、1.05%、0.62%、0.87%、0.96%、1.21%、0.74%，表明供試品36 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.6加樣回收率試驗(yàn) 取已知含量的祛斑養(yǎng)顏膠囊（批號：20160513）6份，每份約0.5 g，精密稱定，加入“2.2.1”項(xiàng)下的對照品儲備液2.5 mL，再加入70%甲醇47.5 mL，按“2.2.2”項(xiàng)下操作。測得各成分加樣回收率見表2。7種成分平均加樣回收率均不低于98.54%，RSD均不高于0.90%，表明試驗(yàn)方法可行，符合定量分析要求。

表2 各成分加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）

2.4 供試品測定結(jié)果 取3批供試品，按“2.2.2”項(xiàng) 下的方法制備供試品溶液，測定含量。見表3。

表3 供試品含量測定結(jié)果（mg/粒，n＝3）

3 討論

3.1 檢測指標(biāo)的選擇 《中華人民共和國藥典》（2015版）〔6〕選擇梔子苷為梔子（炒）、芍藥苷為白芍（酒炙）、阿魏酸為川芎和當(dāng)歸（蒸）、丹酚酸B為丹參的水溶性成分質(zhì)量控制指標(biāo)，由于中藥復(fù)方制劑的復(fù)雜性，并考慮中藥復(fù)方制劑的藥效大多是多成分協(xié)同作用的結(jié)果，本文參考《中華人民共和國藥典》〔6〕并結(jié)合藥材有效成分情況，選擇沒食子酸、丹參素鈉、丹酚酸B、阿魏酸、梔子苷、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷為檢測指標(biāo)。

3.2 檢測波長的選擇 分別稱取沒食子酸、丹參素鈉、梔子苷、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、阿魏酸、丹酚酸B對照品適量，用70%甲醇制成適宜濃度的對照品溶液，在200~550 nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，結(jié)果顯示，沒食子酸在220 nm和273 nm、丹參素鈉在212 nm和282 nm、梔子苷在236 nm、芍藥內(nèi)酯苷和芍藥苷在230 nm、阿魏酸在232 nm和320 nm、丹酚酸B在255 nm和284 nm波長處有最大吸收。根據(jù)掃描圖譜吸收度大小情況和定量測定要求，同時兼顧7種成分用一個波長測定，最終確定了232 nm的檢測波長。

3.3 提取方法的選擇 參考《中華人民共和國藥典》（2015版）〔6〕及文獻(xiàn)〔7-15〕，對提取溶劑（甲醇和乙醇）、溶劑濃度（50%、60%、70%、80%、100%）、提取方法（超聲和回流）、提取時間（30、40、50 min），進(jìn)行正交試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)用70%甲醇回流提取40 min的方法對7個待測成分都能提取完全，提取率高，特別是芍藥苷用此方法提取時，測定得到的含量最高。

3.4 流動相的選擇 參考《中華人民共和國藥典》（2015版）〔6〕及文獻(xiàn)〔7-13〕，試驗(yàn)了0.1%磷酸溶液-乙腈、0.1%磷酸溶液-甲醇系統(tǒng)。使用0.1%磷酸溶液-甲醇系統(tǒng)時，梔子苷和芍藥苷與其附近雜質(zhì)峰均分離不佳，且阿魏酸峰形不好；使用0.1%磷酸溶液-乙腈系統(tǒng)時，阿魏酸峰形較好，經(jīng)反復(fù)調(diào)整流動相比例和梯度，當(dāng)為本試驗(yàn)流動相方法時，各待測成分分離度和峰形均能達(dá)到良好效果。因此確定0.1%磷酸溶液-乙腈系統(tǒng)為本試驗(yàn)的流動相。

本實(shí)驗(yàn)采用HPLC法同時測定祛斑養(yǎng)顏膠囊中沒食子酸、丹參素鈉、梔子苷、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、丹酚酸B、阿魏酸7種成分的含量，該方法簡便可靠，結(jié)果準(zhǔn)確，重復(fù)性好，可為該制劑的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)的提升提供參考。