張 平，方 瓊，周 華

（安徽醫(yī)學高等?？茖W校，合肥 230601）

潰瘍性結腸炎（ulcerative colitis，UC）是炎癥性腸?。╥nflammatory bowel diseases，IBD）的主要形式，它是一種終身性疾病，其特征是持續(xù)的/彌漫性的炎癥，可從直腸近端擴散，并定位于結腸黏膜，主要的臨床表現為腹部疼痛、便血、體質量減輕、結腸縮短及貧血等〔1〕，特征是無癥狀緩解和活動性疾病發(fā)作的不斷循環(huán)〔2〕。它的發(fā)病機理涉及遺傳和環(huán)境因素之間復雜的相互作用，是由各種遺傳傾向的患者對腸道內容物不受控制的免疫反應誘導，是一種免疫炎癥性疾病，已日漸成為導致生活質量惡化和公共醫(yī)療系統負擔增加的公共衛(wèi)生問題。

流行病學模式的變化提出飲食因素是UC加重的潛在觸發(fā)因素，臨床數據證實，UC患者中飲酒者復發(fā)的風險更高，且UC患者在飲酒后出現的胃腸道癥狀比腸易激綜合征患者更嚴重。但“酒文化”是社交場合不可避免的，很多UC患者飲酒很常見。對酒精如何加重UC發(fā)作尚未得到深入研究。

文獻〔3〕報道，飲食中富含多酚、黃酮的水果和蔬菜的攝入量與UC低風險相關。蜂膠是大自然中天然的寶藏，是一種天然的抗生素，由覓食的蜜蜂從不同種類植物的芽和滲出物中收集樹脂物質，與蜜蜂唾液中的β-糖苷酶混合而成，其主要成分是黃酮類化合物，具有較強的抗氧化特性以及調節(jié)免疫反應和腸道微生物群的能力〔4〕，是治療UC的一種候選藥物。本研究采用葡聚糖硫酸鈉（dextran sulfate sodium，DSS）建立UC大鼠模型，隨后接受“酗酒”模式，檢測酒精對DSS誘導的大鼠結腸炎癥的影響，同時評價水溶性蜂膠對酒精加重的UC發(fā)作時結腸炎癥的緩解作用并對其作用機制進行初步探討，為UC患者飲酒安全提出可靠建議。

1 材料與方法

1.1 動物 雄性SD大鼠（SPF級）40只，體質量180~200 g，購自濟南明悅實驗動物繁育有限公司，許可證號：SCXK（魯）20190003。實驗前4 d適應性籠養(yǎng)于12 h/12 h光/暗循環(huán)環(huán)境中（室溫18~25℃，相對濕度50%~65%），室內安靜，通風正常，自由飲水和食用全價顆粒飼料。

1.2 試劑 水溶性蜂膠（純度>98%，廣州市杰禾蜂業(yè)有限公司，批號：20210325-B）；DSS（分子量：36 000~50 000 Da，美國Sigma公司，批號：S5036）；白細胞介素-6（IL-6）、白細胞介素-10（IL-10）、白細胞介素-17（IL-17）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）檢測試劑盒（均購自合肥博美生物科技有限責任公司，批號分別為：200-06；210-10；210-17；315-01a）；美沙拉嗪腸溶片（合肥市蜀山區(qū)潤吉化學試劑經營部，批號：181003）。

1.3 主要儀器-80℃超低溫冰箱（Thermo公司）；倒置顯微鏡（Olympus公司）；Model-680酶標儀（Biorad公司）；FA2004電子天平（天津天馬衡基儀器公司）。

1.4 分組、給藥及造模 將大鼠隨機分為5組，分別為對照組、UC組、UC+酒精組、UC+酒精+蜂膠組、UC+酒精+美沙拉嗪組，每組8只。UC+酒精+蜂膠組大鼠每天灌胃蜂膠溶液200 mg/kg，UC+酒精+美沙拉嗪組大鼠每天灌胃美沙拉嗪溶液50 mg/kg，其余各組每天灌胃等量蒸餾水，灌胃劑量0.2 mL/10 g，連續(xù)灌胃17 d。在給藥7 d后，對照組大鼠自由飲用蒸餾水，其余4組自由飲用4% DSS溶液，連續(xù)7 d。第15天，各組停止飲用DSS溶液，UC+酒精組、UC+酒精+蜂膠組、UC+酒精+美沙拉嗪組灌胃50%乙醇溶液，連續(xù)3 d，以模擬“酗酒”模式，其余組灌胃等量蒸餾水。第18天，將各組大鼠麻醉后頸椎脫臼處死。

1.5 結腸炎程度評估

1.5.1 疾病活動指數檢測 自開始飲用DSS溶液起（第0天），每天固定時間測量各組大鼠體質量、糞便稠度及便血，計算疾病活動指數（disease activity index，DAI）：DAI=體質量變化百分數+糞便稠度分數+便血分數。評分標準依據文獻〔5〕。見表1。

表1 DAI評分標準

其中，大鼠體質量變化百分數計算公式：體質量變化百分數（%）=（（第X天體質量-第0天體質量）/第0天體質量）×100%。使用隱血檢測試劑盒檢測大鼠便血情況，具體操作步驟參照試劑盒說明書。

1.5.2 結腸長度、質量及結腸質量指數檢測 大鼠處死后，沿腹中線切開大鼠腹部，暴露直腸，剪取直腸至回盲腸交界部的整段結腸，置于自制冰床上測量結腸長度；將結腸沿縱軸剖開，用預冷0.9%氯化鈉溶液沖洗，清理結腸內容物，置于濾紙上吸干，測量結腸質量；計算結腸質量指數（%）=（結腸質量/大鼠體質量）×100%。

再取中段結腸0.5 cm，對每只大鼠的結腸組織進行分析。其余結腸組織置于凍存管中，于-80℃冷凍保存。

1.5.3 結腸組織學評分（histological score，HS） 結腸標本用4%多聚甲醛固定，95%乙醇脫水，石蠟包埋，制成5 μm切片，蘇木精-伊紅染色。依據文獻〔6〕在光學顯微鏡下觀察結腸黏膜的完整性、黏膜下炎性細胞浸潤的程度及腸壁腺體結構的改變等，對腸道炎癥組織學損傷進行評分，評分標準見表2。

表2 結腸組織學損傷評分標準

1.6 促炎因子和抗炎因子檢測 取出冷凍保存的結腸標本，與0.9%氯化鈉溶液按1∶9比例混合，于自制冰床上充分研磨，直至勻漿液中僅有少量結締組織。將勻漿液移至離心管中，4℃下3 000 r/min離心30 min，離心半徑15 cm。取上清液，利用細胞因子特異性試劑盒進行酶聯免疫吸附測定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA），按照試劑盒使用說明書中步驟進行操作，檢測結腸組織勻漿中促炎細胞因子IL-6，IL-17，TNF-α以及抗炎細胞因子IL-10的水平。

1.7 統計分析 所有統計分析均使用SPSS 25.0軟件進行，結果以（±s）表示。多組間數據比較采用單因素方差分析，多組間兩兩比較根據方差是否齊性采用LSD法或Tamhane法，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠體質量變化百分數和DAI評分 第7天，停止飲用DSS溶液后，進入UC緩解期。對照組大鼠體質量穩(wěn)定增加，UC組、UC+酒精組大鼠體質量均從第4天開始降低；與對照組比較，除第1天外，UC組、UC+酒精組、UC+酒精+蜂膠組、UC+酒精+美沙拉嗪組大鼠體質量變化百分數均降低，DAI評分增加，差異有統計學意義（P<0.05）。從第7天開始，接受DSS和酒精聯合處理的大鼠（UC+酒精組），與僅飲用DSS的大鼠（UC組）相比，體質量下降更明顯，DAI評分進一步增加，差異有統計學意義（P<0.01）。與UC+酒精組比較，使用水溶性蜂膠（UC+酒精+蜂膠組）和美沙拉嗪（UC+酒精+美沙拉嗪組）預處理的大鼠，體質量變化百分數明顯減少，且DAI評分降低，差異有統計學意義（P<0.05）。提示DSS成功建立UC大鼠模型，酒精可加重UC發(fā)作，加劇結腸炎癥，水溶性蜂膠和美沙拉嗪可緩解酒精加重的UC發(fā)作，減輕結腸炎癥。見表3~4。

表3 各組大鼠體質量變化百分數（%，±s）

表3 各組大鼠體質量變化百分數（%，±s）

注：與對照組比較*P<0.05，**P<0.01；與UC組比較## P<0.01；與UC+酒精組比較ΔP<0.05，ΔΔP<0.01。

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表4 各組大鼠DAI評分（±s）

表4 各組大鼠DAI評分（±s）

注：與對照組比較*P<0.05，**P<0.01；與UC組比較## P<0.01；與UC+酒精組比較ΔP<0.05，ΔΔP<0.01。

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2.2各組大鼠結腸長度、結腸質量、結腸質量指數和HS與對照組比較，UC組、UC+酒精組、UC+酒精+蜂膠組、UC+酒精+美沙拉嗪組大鼠結腸長度明顯縮短（P<0.01），結腸質量（除UC+酒精+美沙拉嗪組外）均明顯升高（P<0.01），結腸質量指數均明顯升高（P<0.01），HS均明顯升高（P<0.01）。與UC組比較，UC+酒精組大鼠結腸長度進一步縮短（P<0.01），結腸質量、結腸質量指數及HS均進一步升高（P<0.01）。與UC+酒精組比較，UC+酒精+蜂膠組和UC+酒精+美沙拉嗪組大鼠的結腸質量、結腸質量指數和HS均降低（P<0.05），結腸長度增加（P<0.05）。見圖1。結果提示“酗酒”模式后，酒精加重結腸損傷，UC癥狀惡化，水溶性蜂膠和美沙拉嗪對酒精加重的UC發(fā)作有一定治療效果。

圖1 各組大鼠結腸長度、結腸質量、結腸質量指數和HS

2.3 各組大鼠結腸組織勻漿中IL-6，IL-10、IL-17和TNF-α含量 結果顯示，與對照組比較，UC組、UC+酒精組、UC+酒精+蜂膠組、UC+酒精+美沙拉嗪組大鼠結腸組織中TNF-α和IL-17含量均顯著升高（P<0.01），IL-6含量（除UC+酒精+美沙拉嗪組外）均明顯升高（P<0.01），IL-10含量顯著降低（P<0.01）。與UC組比較，UC+酒精組大鼠結腸組織中IL-6，TNF-α和IL-17含量升高（P<0.01），IL-10含量降低（P<0.01）。與UC+酒精組比較，UC+酒精+蜂膠組、UC+酒精+美沙拉嗪組大鼠結腸組織中IL-6，TNF-α和IL-17含量降低（P<0.01），IL-10含量升高（P<0.01）。見圖2。

圖2 各組大鼠結腸組織勻漿中IL-6、IL-10、IL-17和TNF-α含量

3 討論

某些食物可以誘發(fā)或加重UC癥狀，這些食物在文獻中通常被稱為“觸發(fā)食物”〔7〕。其中，酒精與UC的發(fā)展和惡化有關，臨床數據也證實UC復發(fā)風險增加與高濃度酒精攝入相關〔8〕。但目前很少有研究描述酒精對UC發(fā)作的影響。因此，本研究采用DSS誘導大鼠UC模型，隨后讓大鼠接受“酗酒”模式，探究酒精是否加重UC癥狀。美沙拉嗪是一種治療UC的常用藥物，可顯著抑制結腸炎癥，但其副作用較多，尋找新的替代藥物尤為重要。蜂膠是一種黏性天然化合物，是一種天然的抗生素，已被廣泛用作食品補充劑，自古埃及時代以來，它一直被用于治療各種炎癥性疾病。蜂膠含有400多種化學物質，包括萜類、多酚、類黃酮等，具有多種生物學功能，包括抗炎和免疫調節(jié)等〔9〕。本研究對水溶性蜂膠緩解酒精加重UC發(fā)作的作用機制進行了初步探索。

DSS誘導的結腸炎是研究UC發(fā)作的成熟模型。該模型表現出許多與人類UC相似的癥狀，如：體質量減輕、結腸縮短、腹痛、腹瀉、便血、腸黏膜潰瘍和促炎細胞因子產生增加等。文獻〔10〕中使用3%~5% DSS溶液誘導大鼠UC模型，本實驗中為區(qū)別單獨使用DSS及DSS和酒精聯合使用導致結腸炎癥損傷的微小差別，使用4%的DSS溶液，使用DSS處理的SD大鼠（UC組）表現出體質量減輕、DAI評分升高，結腸長度縮短，結腸質量指數升高及HS升高等一系列UC癥狀，表明UC模型制備成功。與UC組相比，UC+酒精組大鼠體質量及結腸長度進一步降低，DAI評分、結腸質量指數、HS進一步升高。結果表明，在DSS誘導大鼠結腸炎后，再經歷“酗酒”模式，可明顯加重結腸炎癥。Bishehsari等〔11〕認為酒精可能通過多種途徑誘發(fā)腸道炎癥，其中腸黏膜免疫系統破壞發(fā)揮重要作用，且在活動性腸道炎癥情況下，繼續(xù)飲酒會加重疾病活動。

貫穿整個胃腸道的促炎和抗炎細胞因子之間的微妙平衡對于健康的腸黏膜屏障功能和穩(wěn)態(tài)至關重要。免疫耐受性的破壞是UC的一個重要標志〔12〕。大量證據表明，UC主要是由于固有層T淋巴細胞的激活不當所致，當幼稚T淋巴細胞與抗原呈遞細胞（antigen presenting cells，APC）接觸時，它們有可能被激活并分化為T淋巴細胞亞群，包括輔助性T淋巴（helper T，Th）1、Th2、Th17細胞和調節(jié)性T（regulatory T，Treg）細胞。近期發(fā)現Th17細胞與許多免疫炎癥性疾病有關，并且在UC進展中的重要性已經被證實；Treg細胞具有免疫調節(jié)功能，促進免疫耐受，具有抗炎作用，在抑制免疫反應和維持免疫耐受方面發(fā)揮重要作用。故Th17細胞的過度反應和Treg細胞的功能不足與UC發(fā)作有關〔13〕。

IL-17是一種由Th17細胞產生的促炎細胞因子，它可以激活信號轉導和轉錄激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3），從而刺激強烈的慢性免疫炎癥反應，它在腸道炎癥部位充當促炎反應的觸發(fā)器〔14〕，在炎癥反應期間招募T淋巴細胞到固有層，導致腸道免疫系統過度激活，觸發(fā)了一系列的細胞內事件，導致細胞凋亡、細胞浸潤和腸黏膜結構完整性和功能喪失，從而促進腸道炎癥，而抑制Th17可以有效減少急性結腸炎的發(fā)展。由于Th17細胞在腸道炎癥中起著關鍵作用，因此有人提出促炎細胞因子IL-17可能是調節(jié)腸道炎癥反應的治療靶點。本研究發(fā)現，與對照組相比，UC組大鼠結腸組織中IL-17水平升高；與UC組相比，UC+酒精組大鼠結腸組織中IL-17水平進一步升高；而與UC+酒精組相比，UC+酒精+蜂膠組大鼠結腸組織中IL-17水平降低，說明在活動性炎癥疾病期間，攝入酒精可提高促炎細胞因子IL-17水平，加劇腸道炎癥；水溶性蜂膠靶點Th17細胞，降低IL-17水平，發(fā)揮抗炎作用，改善酒精加重的UC發(fā)作，蜂膠的抗炎特性主要是由于它的類黃酮成分。Khosravi等〔15〕報道，煙曲霉分生孢子是最常見的室內真菌過敏原，可增加促炎細胞因子IL-17的釋放誘導過敏性哮喘，蜂膠提取物可降低IL-17的水平，有效緩解哮喘發(fā)作。巴西蜂膠乙醇提取物對膠原誘導性關節(jié)炎（collagen-induced arthritis，CIA）發(fā)病機制的保護作用與抑制CIA小鼠中IL-17水平有關〔16〕。

幼稚T淋巴細胞向Th17細胞分化受到高濃度促炎細胞因子IL-6的調節(jié)，被IL-6激活的STAT3是參與Th17分化的關鍵信號分子，Th17細胞可分泌促炎細胞因子，如IL-17和TNF-α，在腸道炎癥中發(fā)揮致病作用。我們同樣檢測了各組結腸組織中IL-6和TNF-α的水平，結果表明UC組和UC+酒精組IL-6、TNF-α的發(fā)生趨勢與IL-17一致，促炎細胞因子的過量產生可導致活動性炎癥〔17〕。與UC+酒精組相比，UC+酒精+蜂膠組的IL-6、TNF-α水平下降趨勢與IL-17也一致，說明蜂膠可抑制促炎細胞因子IL-6、TNF-α的產生，這與文獻報道蜂膠在體外抑制IL-6誘導的Th17細胞分化，抑制IL-6誘導的信號轉導和STAT3的磷酸化，在炎癥免疫性疾病中發(fā)揮抗炎作用一致〔18〕。說明蜂膠對Th17細胞分化的抑制作用有助于控制UC中的細胞因子穩(wěn)態(tài)不平衡，從而發(fā)揮抗炎作用。

與對照組相比，UC組大鼠結腸組織中IL-10水平降低；與UC組相比，UC+酒精組大鼠結腸組織中IL-10水平進一步降低。IL-10是一種有效的抗炎細胞因子，由Treg細胞分泌。Treg細胞是T細胞的一個特殊子集，具有免疫調節(jié)功能，能促進免疫耐受和抗炎，在抑制免疫反應和維持免疫耐受方面發(fā)揮重要作用〔19〕。文獻〔20〕報道IL-10的缺失會導致腸道炎癥，而缺乏IL-10受體的Treg細胞更容易發(fā)生結腸炎。Treg細胞通過降低Th17相關細胞因子的表達預防腸道炎癥。IL-10還可以直接抑制CD4+Th的促炎細胞因子的表達，并通過APC抑制趨化因子的表達〔21〕。IL-10缺陷小鼠發(fā)生自發(fā)性IBD，其特征是存在由淋巴細胞、巨噬細胞和中性粒細胞組成的炎癥浸潤〔19〕。故推測在活動性結腸炎期間，攝入大量酒精，抑制Treg細胞分泌抗炎細胞因子IL-10，加重UC期結腸炎癥。與UC+酒精組大鼠比較，UC+酒精+蜂膠組大鼠結腸組織中IL-10水平升高，推測蜂膠可通過提高抗炎細胞因子IL-10水平，在UC發(fā)作期間對結腸黏膜起保護作用。有文獻〔22〕報道，蜂膠可通過Jak/Stat途徑下調核因子-кB途徑，進而降低TNF-α、IL-8、IL-12、單核細胞趨化蛋白1、細胞間黏附分子1等的水平，調節(jié)先天和適應性免疫反應，發(fā)揮抗炎作用。

綜上所述，酒精加重UC的發(fā)作，是導致UC癥狀持續(xù)存在的潛在因素。水溶性蜂膠可以通過降低結腸組織中促炎細胞因子IL-6、IL-17、TNF-α水平，提高抗炎細胞因子IL-10的水平，控制UC中細胞因子穩(wěn)態(tài)的不平衡，從而緩解酒精加重的UC發(fā)作。